专利名称：棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16的克隆及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GAM4尸《M的克隆、重组 及转基因烟草抗盐能力的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。
二背景技术：
我国农作物生产中的淡水、土地等资源严重匮乏已严重制约着我国农业的 可持续发展，可耕地中有近三分之一面积的土地受到不同程度盐渍化的影响， 而且盐渍化耕地面积还在逐年增加。此外，我国还有15亿亩以上的荒地和滩涂 是盐碱地。据保守估计，盐碱、低温等环境胁迫造成的我国主要农作物减产每 年高达总产的15%以上，其中土壤含盐量是限制农作物产量的关键因素。高浓 度的盐溶液能引起植物的高渗透胁迫，导致植物发育不良，生长缓慢，甚至死 亡，以致大大降低农作物产量。因此，提高农作物的抗盐能力越来越受到人们 的重视。早期提高作物抗盐能力的措施主要是改善土壤结构、改进栽培管理技 术和传统的杂交育种。通过改善土壤结构来增强作物适应性的措施周期长、成 本高。通过改进栽培管理技术来提高植物的抗盐能力的措施也收效甚微。而传 统的育种方式由于育种周期长、工作量大、成本高，加之绝大多数植物缺少抗 盐或耐盐基因，因此，通过传统的育种方式来提高植物的抗盐能力已远远无法 满足人们的要求。近年来，植物分子生物学和基因工程技术的发展给植物抗盐 育种开辟了新途径。寻找与抗盐相关的基因并研究其具体功能，通过转基因技 术提高作物的抗盐能力已成为一种行之有效的方法。
植物能产生一系列主动适应机制来应对各种内外因素的影响，并将信号在细胞内与细胞间进行快速传递。20世纪90年代以来，细胞信号转导的研究引起 了国内外生物界极为广泛的关注。近年来的研究表明，信号转导过程是一个立 体网络系统，促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应途径位于网络中心，它 通过磷酸化和去磷酸化将多种胁迫信号逐级放大并传递到靶分子，引起细胞的 一系列抗逆反应。植物中的MAPK级联途径与机械损伤、干旱、低温、高盐、 植物激素、生长发育以及病原物的侵染等各种刺激反应相关联(Jonak et al.， 2004; Xiong and Yang， 2003; Agarawal et al., 2002; Zhang and Klessig, 1998;彭立新等， 2003)。当植物受到高盐胁迫时，MAPK基因会被诱导而高效表达。
发明内容
本发明从棉花幼叶中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库中 已发布的其它植物中促丝裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，设计兼并 引物，进行常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)。将PCR产物 与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选重组子，进行序 列分析。然后通过3'和5'末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术分别获得3'和5'端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA 的3'和5'端序列设计特异引物，以棉花幼叶的cDNA为模板进行PCR扩增，得 到cDNA全长序列，将该cDNA命名为GAM4/^/6。
该基因的全长cDNA为2030 bp,其中开放阅读框部分为1662 bp。由此推 得，该基因具有554个氨基酸。将其氨基酸序列在GenBank中检索，发现与已 发表的OsMPK16-l (水稻，EU779804) 、 ZmMPK6 (玉米，NM_001111768)、 AtMPK16 (拟南芥，NM一121906)相比，氨基酸同源性分别为73.84 %、 76.02 %、 75.31%。由此表明，经过上述克隆步骤得到了编码棉花促丝裂原活化蛋白激酶的基因(^M4i^M。 该基因序列如下 序列表
(l)SEQ. ID.NO. 1的信息
(a)序列特征 长度2030 bp
类型核酸
链型双链
拓扑结构线性
0>)分析类型CDNA
(C)假设否
(d)反义否
0)最初来源棉花
(f)序列描述SEQ.ID.NO. 1aacttggtttctactattactttgggggct
caaagttttgatgctaag|atg|cagcctgat
tttttcactgaatatggtgagggaagcagg
agctatggtgttgtttgttcagcgtatgac
AAAATCAATGATATATTTGAACATGTATCT
cttctcaggctcctacgtcatccagacatt
tcaagaagggaatttaaagatatatacgtg
caggttatca
cttcttgggggcctgaaatacattcacaca
aaaaatatcttagccaatgctgattgcaaa
gtagcttttaatgacacccccactgcaata
tcctgtttga tgccaattgt tttctgtttc 60
cagagaagaa agtcagctgc ggatgtagm 120
tatagaatag aggaagtaat tggaaaagga 180
actcatactg gagaaaaggt tgctattaag 24 0
gacgccaccc gaatcctcag agagattaaa 300
gttgagatca agcacatatt gttccctcct 360
gtmttgaac ttatggaatc tgatttacac 4 20
ccagaacact accagtttct tctttmcag 4 80
gctaatgttt ttcatcggga tctaaagccg 540
ctgaagatct gtgattttgg gcttgcaaga 600
ttctggacgg actatgttgc aacaagatgg 660TACAGGGCTC CGGGATTGTG TGGATCCTTT TGGAGCATTG GGTGCATCTT TGCTGAACTT AATGTTGTCC ATCAZVTTGGA TCTGATGACT ATTGCTAGGG TGCGTAATGA GAAAGCTCGG CCAATTCCTC TCTCCCACAA GTTCCCTAAT AGGATGCTTG CTTTTGAACC CAAGGATCGA TATTTCAAGG GGTTGGCCAA AGTTGAAAGG GAATTTGAGT TTGAGAGACG TAGGATTACA GAAATTCTTG AGTATCATCC TAAAATGTTG GGCTTCATGT ATCCAAGTGC GGTTGACCAT CACTATGGAA ATGGTACGAC TGCAGCTCCA CCATGTGTGT TATATTCAGA TAATTCAGTA TCTAAATGTT CCATCAAGGA AACTGAGAAA ATGTCAAGGC TTCCCCCTCA AGTTCCTCAA GTAGTTGGAT CAGTMTGCG ATACAACAAT GAACAGCGAA GAATGGCTCG GAATCCTTCA TCATATCCAC GGAGAAATCC TGTCTGTAAA CCCCAGTACA TGGCTAGGAA AGTTGCTGCT fTG牟CTAATA TCAACTACAA ATGGCCAACA TGCTCTTCCT ACTGCTGGTT GAGGAAAGCT TAATTTATAG CACTAATTTC AAAGAGATGA GTGAAAGTTA GAGACTTGAG GAAAAGGCAA CTCTACTTTA TTTATTCTTT ATTAACACCC
其中透明方框内的为起始密码子:
(3) SEQ.ID.NO.2的信息
(a)序列特征 长度554个氨基酸 类型氨基酸
TTCTCCAAGT ATACCCCAGC AATAGATATA 7 20
CTAACAGGGA AACCTCTGTT TCCTGGAAAA 780
GATCTTTTGG GAACACCATC TGCTGAAGCC 840
AGATACTTGA GCAGCATGCG AAAGAAAAAG 900
GCAGATCCTC TTGCTGTTCT TTTGTTAGAA 960
CCTAGTGCTG AAGAGGCCCT AGCTGATCCA 1020
GAGCCTTCCG CACAACCAGT TACCAAGATG 1080
AAGGAAGATG TTAGGGAGCT CATATACCGT 114 0
AAAGAGTATC TGGAAGGATC AGAGCCAACT 1200
TTCAAGAAGC AGTTTGCCTT CCTTGAGGAG 1260
CTTGAGAGAC AACATGCATC TTTGCCAAGG 1320
CAAAACTCAA CAGATGTGAC AGATAACTTA 1380
CCCCAACCAG AGAGAAGCTT TCCAATCCCT 14 40
AGCATCCAAG GTGCTGCCAG ACCTGGGAAA 1500
TGTGGGGCAG TAGCCGCAGG TGAGGCTCTT 1560
GTTCCAACTC AGTATACTGC CACAAATTGT 1620
GATGATGAAG AAAATGAATT GCAGCCAAAA 1680
GCCCAAGGTG GMCAAGAAG TCAGTGGTM 1740
AAAAAGGCCG GTGAGGATTT ACTCCCAAAT 1800
CAGACAAGTT ACAAGTGAAG CTATGCATTG 1860
AACTGTGCCT TCTTATCCTT CATAAGATAT 1920
AAGTGAACTC TGTAACTTAT GAAGTTGGTT 1980
TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2030
灰色方框内的为终止密码子。链型单链 拓扑结构线性
(b) 分析类型蛋白质
(c) 序列描述SEQ.ID,NO-2
Met 1
Thr
Gin Pro Asp Gin Arg Arg Lys Ser Ala Ma Asp Val Asp Phe Phe
Glu Tyr
Lys Gly
Glu
Asp
65
His
Lys
50
Ala
Ser 35 Val
Gly 20 Tyr
5
G丄u
Gly Ser
Gly Val Val
Ma工le Lys
Thr Arg lie
Pro Asp lie
Arg Glu Phe
Leu His Gin 115
Gin Phe Leu 130
Ala Asn Val 145 Ala
Lys 100 Val
Val
85
Asp
Leu 70 Glu
!Lys 55 Arg
Arg Tyr 25
Cys Ser 40
工le Asn
10 Arg
Glu lie Lys
工le L<ys His
lie Tyr
工le Lys Ala
Leu Tyr Gin
Val Val 105 Asn Asp 120
Leu Arg
工le
Leu !Lys Pro
Asp Cys Lys
Phe Asn Asp
Leu 135
Phe His Arg Asp 150
Leu Lys lie Cys Asp Phe 165 170 Thr Pro Thr Ala lie Phe Trp 180 185
工le Glu Glu
Ala Tyr
Asp工le
Leu
75
Leu
Asp Thr
45 Phe Glu 60
Leu Arg
Val 30 His
15 lie
Gly
Thr Gly
His Val Ser
!Leu Leu
Phe Pro Pro
Glu Leu Met
Asp Leu
Gly Leu
Thr Pro 125 !Lys Tyr 140 Lys Asn lie 155
Gly Leu Ala Thr Asp Tyr
Glu 110 Glu
Ser 95 Ser
80 Arg
Asp
His Ty:c
lie His Thr
Leu Ala
Arg
Val 190
Val 175 Ma
160 Ala
ThrArg Trp Tyr Arg 195
Thr Pro Ala lie 210
Leu Thr Gly Lys 225
Asp Leu Met Thr
Als Pro
Asp工le
Arg Val Arg
Lys Lys Pro 275
Ala Val Leu
290 Pro Ser Als 305
Lys Val Glu
Glu Phe Glu
Tyr Arg Glu 355
Glu Gly Ser
370 Phe Lys Lys 385
Thr Ma Ala
Asn 260 工le
Pro
Asp 245 Glu
Leu 230 Leu
Lys
Pro Leu
Leu Leu Glu
Glu Glu
340 工le
Glu 325
Ala 310 Pro
Leu Glu
Glu Pro Thr
Gin Phe
Pro
Ala 390 Glu
Leu 405
Val Leu Tyr Ser Asp Asn Ser Val
Gly Leu Cys Gly 200
Trp Ser lie Gly 215
Phe Pro Gly Lys
Leu Gly Thr Pro 250
Ala Arg Arg Tyr 265
Ser His Lys Phe 280
Arg Met Leu Ala 295
Leu Ala Asp Pro
Gin Pro 330 !Lys Glu
Pro Lys
Met Tyr
Glu Glu
His Ala 410 Gin Asn
Arg工le Thr
Tyr His 360 Gly Phe 375
Phe Leu Arg Gin
Ser Phe Phe Ser Lys Tyr 205
Cys工le 220 Asn Val 235
Ser Ala
Phe
Ala Glu Leu
Val His
Glu Ala
Leu Ser Ser
Pro Asn
Phe Glu 300 Tyr Phe 315
Val Thr
Ala 285 Pro
Met 270 Asp
Gin Leu
lie Ala 255
Arg Lys Pro Leu
Lys Asp Arg
Lys Gly
Lys Met
Asp Val Arg
Met Leu
Pro Ser 380 His Tyr 395
Ser I^u
Lys Ala
Glu 350 Glu
Leu Ala 320 Glu Phe 335
Leu 工le Tyr Leu
Val Asp His
Gly Asn
Pro Arg
Ser Thr Asp Val
Gly Thr 400 Pro Cys 415
Thr Asp420 425 430
i\sn Leu Ser !Lys Cys Ser lie Lys Glu Thr Glu Lys Pro Gin Pro Glu
435 440 445
Arg Ser Phe Pro lie Pro Met Ser Arg Leu Pro Pro Gin Val Pro Gin
450 455 460
Ser工le Gin Gly Ala Ala Arg Pro Gly Lys Val Val Gly Ser Val Leu 465 470 475 480
Arg Tyr Asn Asn Cys Gly Ala Val Ala Ala Gly Glu Ala Leu Glu Gin
485 490 495
Arg Arg Met Ala Arg Asn Pro Ser Val Pro Thr G丄n Tyr Thr Ala Thr
500 505 510
Asn Cys Ser Tyr Pro Arg Arg Asn Pro Val Cys Lys Asp Asp Glu Glu
515 520 525
Asn Glu Leu Gin Pro Lys Pro Gin Tyr Met Ala Arg Lys Val Ala Ala
530 535 540
Ala Gin Gly Gly Ser Arg Ser Gin Trp Tyr 545 550
本发明还提供了编码促丝裂原活化蛋、白激酶基因G/2M4尸ia6在农作物中应
用的方法，可提高作物的抗盐能力。步骤为
(a) 利用棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因(^M4Pia6，将cDNA序列置于 CaMV35S启动子之下，构建植物表达载体。
(b) 将表达载体转入农杆菌LBA4404感受态细胞。
(c) 利用(b)获得的转化子转化植物，得到转基因植株。 本发明从棉花中分离出一种编码促丝裂原活化蛋白激酶的基因
(GAM4尸iW6)，将该cDNA序列构建在由组成型CaMV35S强启动子控制的 真核转化载体pBI121上，构建了 G/zM4P尺i6的正义表达载体，采用农杆菌介导的方法转化烟草栽培品种NC89。对获得的转基因烟草进行抗盐能力分析表 明，转基因烟草中G7zM4尸K/6的过量表达能提高其抗盐能力。在含200 mMNaCl 的GM固体培养基上，转基因烟草可正常生长，而非转基因烟草发育迟缓。在 土壤中生长6周后对其定时定量浇灌浓度为200 mM的NaCl溶液，相对于非转 基因烟草，转基因植株具有明显的抗盐能力。该基因转化棉花、小麦、玉米等 农作物，可提高其抗盐能力，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会 价值。
四
图1.棉花中GhMAPK16氨基酸序列与几种其它植物的MAPK氨基酸序列 的比较结果。其中相同的氨基酸残基用黑底表示。它们在GenBank中的注册号 及其物种来源分别为OsMPK16-l (水稻，EU779804) 、 ZmMPK6 (玉米， NM—001111768) 、 AtMPK16 (拟南芥，NM—121906)。
图2.烟草正义表达载体的构建程序。
图3.部分转基因植株的PCR鉴定结果。CK-:非转基因对照；CK+: pBI121 质粒作为阳性对照；1-12:转基因烟草植株M: markerDL2000
图4.过量表达GAM1P《7(5的转基因烟草与非转基因烟草在含200 mM NaCl的GM固体培养基上的生长状况比较。A:转基因烟草；B:非转基因烟草
图5.转基因烟草与非转基因烟草在土壤中的生长状况。生长6周后对其浇 灌浓度为200 mM的NaCl溶液，每次定量浇30 ml，每周浇2-3次，维持3周。 然后用清水浇灌，使其恢复一周。A:转基因烟草；B:非转基因烟草
五具体实施例方式
实施方式(一) 一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhM4户jn6的克隆方法
1. RNA的提取利用TRIZOL试剂盒提取棉花总RNA
2. cDNA第一链的合成
在0.25 ml离心管中加入下列试剂
mRNA
oligo d(T)引物 DEPC-H20
4^1
2|Lll
6 pi
吸打混匀后65。C水浴5min，冰上冷却5 min，轻离心，加入下列试剂:
;xFirst-Strand Buffer
Rnasin Ribonuclease Inhibitor
10mMdNTP
EasyScript Reverse Transcriptase
4|ul 1 pi
1 |Lll
1 ^
0.1 MDTT
轻轻敲打混匀，稍离心后，42"保温lh， 3. cDNA的5'加尾反应
2^1
然后-20。C保存备用,
(a)反应体系:
cDNA
5 xTdT Buffer 0.1%BSA lOOmMdCTP TdT
ddH20 Up to
20 |il 10 pi 5^1 1 pi 1 |il 50 |ul(b) 37。C保温30min。
(c) 加100iil无水乙醇，-20。C沉淀30min。
(d) U,000rpm，室温离心5min。弃上清，干燥后加适量ddH20回溶。 4. cDNA全长序列的获得
4.1用兼并引物进行PCR反应获得G/2M4P《76中间片段 体系如下
10xEasy7b《buffer 2.5 jal
dNTP mixture (10 mM) 1 pi
MPl(lO 一) 1 nl
MP2(10juM) 1 cDNA 1 pl
r"《E 0.25 (^1
ddH20 Up to 25 pi
反应程序为:
<formula>formula see original document page 12</formula>反应完毕后，电泳检测结果并回收正确片段。将所得片段连入pMD18-T， 取PCR产物4 pi与pMD18-T载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品 pMD18-T Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞， 在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至 LB液体培养基中培养3h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样在含有氨苄青霉 素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法小量提取质粒DNA,酶切 鉴定后进行序列测定。
4.2 5'RACE获得5'端序列
(a)用上述反转录产物进行PCR，体系如下
10xEasyra《buffer 2.5 [il
dNTP mixture (10 mM) 1 pi
AAP(10岸) 1^1 5P1 (10岸) 1 pi
cDNA 1 pi
E 0.25 pi
ddH20 Up to 25 jal
(bO反应程序为
94。C 5 min
94 °C 1 min 52°C 1 min 72 。C 1 min
、
卜35个循环
72 °C 5 min(c) 同样的体系和反应程序以第一次PCR产物为模板做二次PCR，引物为 AUAP和5P2。
(d) 将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，对生长的 菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。
4.3 3'RACE获得3'端序列
(a)用上述反转录产物进行PCR，体系如下
10xEasy7b《buffer 2.5 pil
dNTP mixture (10 mM) 1 jnl
B26(10阔 1
3P1 (10 )iM) 1
cDNA 0.5 pl
7b《E 0.25 pl
ddH20 Up to 25 pi
(b)反应程序为
94 。C 5 min
94 °C 1 min
52°C 1 min ^ 35个循环
72 °C 1 min
72 °C 5 min(c) 以同样的体系和反应程序，用第一次PCR产物为模板做二次PCR，引物 为B25和3P2。
(d) 将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，对生长的 菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。
4.4 cDNA全长序列的获得
根据已测定序列及其重叠区域，拼出目的基因的全长cDNA，设计引物HP1 和引物HP2， PCR扩增全长序列作进一步的验证。， (a)反应体系
(b)反应程序:
10xEasyra《buffer2.5 |il
dNTP mixture (10 mM)1 pi
HPl(10jiM)1 jLll
HP2(10 jiM)1 pi
cDNA0.5 pi
7b《E0.25 pi
ddH20 Up to50 pi
94 °C 5 min
94。C 30 sec ，
55°C 30 sec> 35个循环
72 °C 90 sec」
72 °C 5 min(c)将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5(x感受态细胞，对生长的 菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。
5.同源检索利用BLAST软件将分离出的全长cDNA序列与GenBank中
的序列进行比较。
实施方式(二)棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因G^M4尸i^6的序列见SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2。
实施方式(三)表达载体的构建
(1) 根据分离出的棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因的核苷酸序列，设计引
物
正向引物5 '画TCTAGAGGGGCTTCCTGTTTGATGCC國3'
划横线部分为i酶切位点
反向引物5 '-GTCGACGGGGCTTCCTGTTTGATGCC-3'
划横线部分为1酶切位点
以棉花幼叶的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应。
(2) 取PCR产物4 pi与pMD18-T Simple载体连接，操作步骤按照TaKaRa 公司产品pMD18-T Simple Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞，在含有卡那霉素(50 mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取 白色菌落至LB液体培养基中培养3h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样在含 有卡那霉素(50 mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法小量提取质粒DNA， 酶切鉴定后进行序列测定。
(3) 将PCR扩增得到目的片段用^" I和5W I酶切，与用相同的限制性内 切酶酶切的pBI121表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，然后在含卡那霉素(50 mg/L)的LB固体培养基上培养，对生长的菌落进行PCR鉴 定和质粒DNA的酶切鉴定。
(4)将构建好的表达载体转化农杆菌LBA4404感受态细胞，本发明采用的 是冻融法转化农杆菌。
实施方式(四)转基因植物的获得
(1) 烟草NC89种子，播种于MS基本培养基中，至5-6片真叶期，备用。
(2) 挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L卡 那霉素的YEP培养基中，28°C， 250rpm，振荡培养约48 h，至对数生长后期； 将菌液用MS培养液稀释10倍，待用。
(3) 取烟草叶片，剪成小块(0.5 x0.5cm)，将剪好的烟草叶片，置于MS 预分化培养基中，28°C，光照时间16h/d，光照强度2,000 Lux，预培养2d。
(4) 将预培养后的烟草叶片浸入菌液5-10min，然后用灭菌的滤纸吸干多 余菌液，接入MS基本培养基；弱光下，28'C共培养2d。
(5) 共培养后的外殖体先用含羧苄青霉素250 mg/L的无菌水洗涤3次，再 用含羧苄青霉素250 mg/L的MS培养液洗1次，然后用灭菌滤纸吸干，转入含 有卡那霉素100 mg/L，羧节青霉素250 mg/L的MS选择培养基上，恒温培养(条 件同预培养)；每15 d更换一次培养基。
(6) 待芽长至lcm左右时，切下，移入MS生根培养基(附加卡那霉素 50mg/L，羧苄青霉素250 mg/L)中，促其生根。
(7) 根系发育好后(5-6片叶)，移入盛有无菌土的花盆中，温室常规管理。 实施方式(五)转基因烟草抗盐能力分析
(1)将T2代转基因株系种子种在200mMNaCl的GM培养基上，观察其生长状况。
(2)观察转基因烟草与非转基因烟草在土壤中的生长状况。生长6周后对
其浇灌浓度为200 mM的NaCl溶液，每次定量浇30 ml，每周浇3次，维持3 周。然后用清水浇灌，使其恢复一周。
通过转基因烟草抗盐能力分析看出，转基因植株相对于非转基因烟草具有 明显的抗盐能力。该基因转化棉花、小麦、玉米等农作物，可提高其抗盐能力， 提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。序列表
<110>山东农业大学
<120>棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因G/zM4户iW6的克隆及其应用
<160〉2
<210〉1
<211>2030
<212>cDNA
<213>棉花((？0，/7/麵/ >加廳) <221>1國2030 <400〉1
AACTTGGTTT CTACTATTAC CAAAGTTTTG ATGCTAAGAT TTTTTCACTG AATATGGTGA AGCTATGGTG TTGTTTGTTC AAAATCAATG ATATATTTGA CTTCTCAGGC TCCTACGTCA TCAAGAAGGG AATTTAAAGA CAGGTTATCA AAGCAAATGA CTTCTTCGGG GCCTGAAATA AAAAATATCT TAGCCAATGC GTAGCTTTTA ATGACACCCC TACAGGGCTC CGGGATTGTG TGGAGCATTG GGTGCATCTT AATGTTGTCC ATCAATTGGA ATTGCTAGGG TGCGTAATGA CCAATTCCTC TCTCCCACAA
19
TTTGGGGGCT TCCTGTTTGA GCAGCCTGAT CAGAGAAGAA GGGAAGCAGG TATAGAATAG AGCGTATGAC ACTCATACTG ACATGTATCT GACGCCACCC TCCAGACMT GTTGAGATCA TATMACGTG GTATTTGAAC TGATTTGACC CCAGAACACT CATTCACACA GCTAATGTTT TGATTGCAAA CTGAAGATCT CACTGCAATA TTCTGGACGG TGGATCCTTT TTCTCCAAGT TGCTGAACTT CTAACAGGGA TCTGATGACT GATCTTTTGG GAAAGCTCGG AGATACTTGA GTTCCCTAAT GCAGATCCTC
TGCCAATTGT TTTCTGTTTC 60 AGTCAGCTGC GGATGTAGAT 120 AGGAAGTAAT TGGAAAAGGA 180 GAGAAAAGGT TGCTATTAAG 24 0 GAATCCTCAG AGAGATTAAA 300 AGCACATATT GTTCCCTCCT 360 TTATGGAATC TGATTTACAC 420 ACCAGTTTCT TCTTTATCAG 4 80 TTCATCGGGA TCTAAAGCCG 54 0 GTGATTTTGG GCTTGCAAGA 600 ACTATGTTGC AACAAGATGG 660 MACCCCAGC AATAGATATA 7 20 AACCTCTGTT TCCTGGAAAA 780 GAACACCATC TGCTGAAGCC 840 GCAGCATGCG AAAGAAAAAG则 TTGCTGTTCT TTTGTTAGAA 960AGGATGCTTG CTTTTGAACC CAAGGATCGA TATTTCAAGG GGTTGGCCAA AGTTGAAAGG GAATTTGAGT TTGAGAGACG TAGGATTACA GAAATTCTTG AGTATCATCC TAAAATGTTG GGCTTCATGT ATCCAAGTGC GGTTGACCAT CACTATGGAA ATGGTACGAC TGCAGCTCCA CCATGTGTGT TATATTCAGA TAATTCAGTA TCTAAATGTT CCATCAAGGA AACTGAGAAA ATGTCAAGGC TTCCCCCTCA AGTTCCTCAA GTAGTTGGAT CAGTATTGCG ATACAACAAT GAACAGCGAA GAATGGCTCG GAATCCTTCA TCATiVTCCAC GGAGAAATCC TGTCTGTAAA CCCCAGTACA TGGCTAGGAA AGTTGCTGCT TGACCTAATA TCAACTACAA ATGGCCAACA TGCTCTTCCT ACTGCTGGTT GAGGAAAGCT TAATTTATAG CACTAATTTC AAAGAGATGA GTGAAAGTTA GAGACTTGAG GAAAAGGCAA CTCTACTTTA TTTATTCTTT ATTAACACCC
CCTAGTGCTG AAGAGGCCCT AGCTGATCCA 1020 GAGCCTTCCG CACAACCAGT TACCAAGATG 1080 AAGGAAGATG TTAGGGAGCT CATATACCGT 114 0 AAAGAGTATC TGGAAGGATC AGAGCCAACT 1200 TTCAAGAAGC AGTTTGCCTT CCTTGAGGAG 1260 CTTGAGAGAC AACATGCATC TTTGCCAAGG 1320 CAAAACTCAA CAGATGTGAC AGATAACTTA 1380 CCCCAACCAG AGAGAAGCTT TCCAATCCCT 14 4 0 AGCATCCAAG GTGCTGCCAG ACCTGGGAAA 1500 TGTGGGGCAG TAGCCGCAGG TGAGGCTCTT 1560 GTTCCAACTC AGTATACTGC CACAAATTGT 1620 GATGATGAAG AAAATGAATT GCAGCCAAAA 1680 GCCCAAGGTG GATCAAGAAG TCAGTGGTAT 17 4 0 AAAAAGGCCG GTGAGGATTT ACTCCCAAAT 1800 CAGACAAGTT ACAAGTGAAG CTATGCATTG 18 60 AACTGTGCCT TCTTATCCTT CATAAGATAT 1920 AAGTGAACTC TGTAACTTAT GAAGTTGGTT 1980 TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2030
<210>2
<211>554
<212>PRT
<213>棉花((？,，',
<221>l-554
<400>2
Met Gin Pro Asp Gin Arg Arg Lys Ser Ala Ala Asp Val Asp Phe Phe 15 10 15Gly Val Val
Ala工le !Lys
Arg
lie
Lys 100 Val
lie Leu
70 Val Glu 85
Asp 工le
Lys 55 Arg
lie
Tyr
工le Lys Ala
Thr Glu Tyr Gly Glu Gly Ser 20
Lys Gly Ser Ty;t 35
Glu Lys Val 50
Asp Ala Thr 65
His Pro Asp
Arg Glu Phe
Ijeu His Gin 115
Gin Phe Leu 130
Ala Asn Val 145
Ala Asp Cys
Phe Asn Asp
Arg Trp Tyr 195
Thr Pro Ala
210 Leu Thr Gly 225
Asp Leu Met
Leu Tyr Gin
Phe
Lys
Thr 180 Arg
His Arg 150 Leu Lys 165
Pro Thr
Leu 135 Asp
工le
Ala
Ala Pro Gly
Arg Tyr Arg lie Glu
25
Cys Ser Ala Tyr Asp 40
工le Asn Asp工le Phe 60
Glu 工le Lys Leu Leu 75
Lys His lie Leu Phe 90
Val Val Phe 105
Asn Asp Asp 120
Leu Arg Gly
Glu Val lie Gly 30
Thr
45
Glu
His
Thr Gly
His Val Ser
Arg Leu
Pro Pro
Glu Leu Met
Leu Arg
80 Ser Arg 95
Ser Asp
Glu 110
Leu Thr Pro Glu His Tyr
125 Tyr
Leu Lys 140
Leu Lys Pro Lys Asn lie Leu 155
Gly L eu
lie His Thr
Cys Asp Phe 170
工le Phe Trp 185
Leu Cys Gly 200
Ser lie Gly
Ala Arg
Thr Asp Tyr
Ala Asn 160 Val Ala 175
Ala Thr
Val 190
Ser Phe Phe Ser Lys Tyr 205
Phe Ala Glu Leu
lie Asp lie Trp Ser lie Gly Cys lie
215 220 '
Lys Pro Leu Phe Pro Gly Lys Asn Val Val His Gin Leu 230 235 240
Thr Asp Leu Leu Gly Thr Pro Ser Ala Glu Ala工le AlaArg Val Arg
Lys Lys
Ala Val 290 Pro Ser 305
Lys Val
Pro 275 Leu
Asn 260 lie
245 250 Glu Lys Ala Arg Arg Tyr 265
Ser His Lys
280 Arg Met
Pro Leu
Leu Ljeu Glu
Ala Glu
Glu Arg
Glu Phe Glu
Tyr Arg
Glu Gly
370 Phe !Lys 385
Thr Ala
Glu 355 Ser
Arg 340 工le
Glu Ala 310 Glu Pro 325
Arg Arg
295 Leu
Glu Pro Thr
Lys Gin
Ala Pro
Val Leu Tyr
Asn Leu
Arg Ser 450 Ser工le 465
Ser 435 Phe
Ser 420 Lys
Phe Ala 390 Leu Glu 405
Asp Asn
Gly 375 Phe
Cys Ser工le
Pro 工le Pro
Gin Gly
Ala Ala 470
Met 455 Arg
Ala Asp Pro
Ser Ala Gin
lie Thr
Leu Glu Tyr
His 360 Phe
Pro 330 !Lys Glu 345
Pro !Lys Met Tyr
!Leu Glu Glu
Arg Gin
Ser Val
His Ala 410 Gin Asn 425
!Lys Glu Thr 440
Ser Arg Leu Pro Gly Lys
Leu Ser Ser
Phe Pro Asn
Leu Ala
Phe Glu 300 Tyr Phe 315
Val Thr
Ala 285 Pro
Met 27〇 Asp
255 Arg
Lys
Pro ;Leu
Lys Asp Arg
Lys Gly Leu
Lys Met
Asp Val Arg
Met Leu
Pro Ser 380 His Tyr 395
Ser Leu
Lys 365 Ala
Glu 350 Glu
Glu 335 Leu
Ala 320 Phe
工le
Tyr Leu
Val Asp His
Gly Asn Gly
Pro Arg
Ser Thr Asp
Glu L'ys
Pro Pro 460 Val Val 475
Pro 445 Gin
Val 430 Gin
Pro 415 Thr
Thr 400 Cys
Asp
Pro Glu
Val Pro Gin
Gly Ser Val
Leu 480Arg Tyr Asn Asn Cys Gly Ala Val Ala Ala Gly Glu Ma Leu Glu Gin
485 490 495
Arg Arg Met Ala Arg Asn Pro Ser Val Pro Thr Gin Tyr Thr Ala Thr
500 505 510
Asn Cys Ser Tyr Pro Arg Arg Asn Pro Val Cys Lys Asp Asp Glu Glu
515 520 525
Asn Glu Leu Gin Pro Lys Pro Gin Tyr Met Ala Arg Lys Val Ala Ala
530 535 540
Ala Gin Gly Gly Ser Arg Ser Gin Trp Tyr 545 550
权利要求
1.一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16，其特征在于它具有核苷酸序列SEQ.ID.NO.1；具有氨基酸序列SEQ.ID.NO.2。
2. 根据权利要求l所示的核苷酸序列，其特征在于该基因选自棉花。
3. 实现权利要求1所述的一种克隆棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因的方 法，步骤为A、根据国际基因库中已发布的其它植物中促丝裂原活化蛋白激酶基因的保 守氨基酸序列，设计兼并引物；B、棉花幼叶中提取总RNA，进行常规反转录-聚合酶链式反应；C、将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞，筛选重组子，进行序列分析；D、通过3'和5'末端快速扩增技术分 别获得3'和5'端序列，并拼接成完整的cDNA序列。
4. 根据权利要求1所述的编码促丝裂原活化蛋白激酶基因G/zM4Pia(5的应 用，其特征在于该基因在烟草栽培品种NC89中过量表达，能提高转基因烟草抗 盐能力，该基因可应用在农作物中以提高其抗盐能力。
全文摘要
本发明涉及一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因的克隆、重组及抗盐性功能分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。本发明从棉花幼叶中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据其它植物中促丝裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，设计兼并引物，进行常规聚合酶链式反应，将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，进行序列分析，再通过3′和5′末端快速扩增技术获得全长cDNA。进一步构建植物正义表达载体，转化烟草栽培品种NC89，转基因烟草具有明显的抗盐能力，将该基因转化棉花、小麦、玉米等农作物，可提高作物抗盐能力，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。
文档编号C12N15/54GK101608184SQ200910019779
公开日2009年12月23日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者良 张, 静 石, 郭兴启 申请人:山东农业大学 被以下专利引用 (2),