专利名称：：一种提高重组人Cu，Zn-SOD活性蛋白产量的方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及基因定点突变、基因重组、外源基因在原核细胞中的表达和目的蛋白的纯化，特别涉及一种提高重组人Cu,Zn-SOD(rhCu,Zn-SOD)活性蛋白产量的方法。
背景技术：
：1、SOD的发现和作用机理超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)具有抗幅射、抗肿瘤、抗氧化的作用，是一种疗效广泛的药用酶。该酶最初是在1938年由Mann和Kdlin首先从牛红细胞中分离出一种蓝色的含Cu蛋白质，当时仅仅认识到它是一种蛋白质。而自从1968年Fridovich等证实其具有清除生物体内氧自由基的特异性生物学活性后受到广泛重视。该酶广泛存在生物体各组织内，能够催化衰老的启动因子——超氧阴离子自由基(^)的歧化反应，并在过氧化氢酶的作用下最终转变为无毒的1102和02，抑制自由基的氧化作用，从而有效地预防超氧自由基阴离子对机体的毒害作用。2、SOD的应用SOD作为一种抗氧化、抗衰老产品的添加剂原料可以应用于医药、日用化妆品、保健品及食品等行业。在医药应用方面，SOD可以增强机体抗辐射损伤能力、防衰老、预防和治疗多种疾病，而且对人和动物无毒副作用。SOD在一些肿瘤、炎症、自身免疫疾病的治疗中有良好疗效，目前，SOD作为药用酶已经开始试用于治疗关节炎、红斑狼疮等疾病。在病毒性疾病、自身免疫性疾病、心肌缺血和缺血再灌流综合症、老年性白内障、心血管疾病、辐射病、癌症和癌症的放射治疗预防以及人类长寿等领域的研究中也己有突破性进展。国内外已有SOD制剂的出现和应用。在日用化妆品方面，在化妆品中添加SOD，可以起到防晒、抗衰老、抗炎的作用，此类产品比如SOD蜜、康妮SOD等。SOD还可以加入到牙膏、漱口水、含片等中，对预防口腔疾病有一定的疗效。在保健品及食品行业，SOD和其它抗氧化剂一样可作为罐头食品、果汁、啤酒等的抗氧化剂，防止过氧化引起的食品变质及腐败现象；还可作为水果、蔬菜的良好保鲜剂。3、SOD的结构和分类迄今为止，人们己从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内分离得到了SOD。天然存在的SOD虽然活性中心离子不同，但催化活性部位却有高度的结构同一性和进化的保守性，即活性中心金属离子都是与3或4个组氨酸(His)、咪唑基(Mn-SOD含有一个天门冬氨酸羧基配位)和1个H20分子呈畸变的四方锥或扭曲的四面体配位。SOD从结构上可分为两族Cu,Zn-SOD为第一族，Mn-SOD和Fe-SOD为第二族。按照金属辅基的不同，SOD至少可以分为5种类型Cu,Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD和Fe,Zn-SOD。其中，Cu,Zn-SOD分布最广，广泛存在于动物的血、肝，菠菜叶、刺梨等生物体中。Cu,Zn-SOD在人体内专一地清除生物体内的超氧阴离子，是平衡机体内氧自由基的主要蛋白，是SOD结构研究的主要突破口。比较不同来源的Cu,Zn-SOD的氨基酸序列可以发现，它们的同源性都很高；有些氨基酸还很保守，在所有序列中都不变，这暗示着这些氨基酸与活性中心有密切的关系。人Cu,Zn-SOD(hCu，Zn-SOD)由2个亚基组成，每个亚基含一个C^+和一个Z^+，C+与催化活性有关，Z^+与维持分子结构有关，主要存在于细胞质中，也见于过氧化物酶体中。4、现有Cu,Zn-SOD产品目前已开发的SOD产品绝大分都是Cu,Zn-SOD，主要是从动物的血、肝中分离提取的。如德国生产的Orgotein为由动物红细胞、肝等分离而得的水溶性Cu,Zn-SOD，可用作早产婴儿的氧中毒症的解毒药及治疗关节炎等炎症的非固醇类消炎药等。另外近年来一些研究者也分别研究了从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌中提取Cu,Zn-SOD的工艺。Cu,Zn-SOD的动物提取主要有以下几个步骤溶血液的制备、选择性热变性、超滤浓縮、丙酮沉淀、柱层析、冷冻干燥。上述提取方法虽然可以有效地从动、植物的组织中获得Cu,Zn-SOD，但是存在着以下几类缺陷。一、生产原料有限，成本高；二、生产需大量的有机溶剂，污染大；三、获得的产品纯度和比活性都很低；四、获得的Cu,Zn-SOD对于人体来说具有异体蛋白免疫原性，作为药品、保健品和护肤品的活性因子不可避免某些异源SOD引起的过敏反应。上述这些缺陷使得Cu,Zn-SOD在应用方面受到很大限制。因此，利用基因工程方法生产重组人Cu，Zn-SOD(rhCu,Zn-SOD)就成为了广开酶源、降低成本和获得无免疫原性产品的有效途径。5、rhCu，Zn-SOD的研究进展通过对hCu,Zn-SOD基因序列的分析发现，该酶含有4个Cys残基，分别位于6、57、111和146位，其中Cys57和Cysl46形成的二硫键是hCu,Zn-SOD中的一对链内二硫键，Cys6和Cyslll保持-SH基团为游离状态。目前利用基因工程方法生产rhCu,Zn-SOD主要集中在两个方面，一方面是通过对Cu,Zn-SOD进行修饰来提高其稳定性；另一方面是利用不同的表达系统来提高其产量。在对Cu,Zn-SOD进行修饰来提高其稳定性方面，将天然的hCu，Zn-SOD的Cy^和、或Cysm改变为其他的氨基酸残基可能增加它的稳定性，而事实也证明了这一点。如Kanematsu将rhCu，Zn-SOD中的Cys6改为Ala6，该突变基因在大肠杆菌中表达后，表达产物经纯化后鉴定，与天然的hCu,Zn-SOD6相比活性是一致的，而且Tm值提高了l(TC。施惠娟等在此基础上将hCu，Zn-SOD的Cys6改为Ala6，并在细胞中得到表达的突变hCu,Zn-SOD，其SOD酶活性较稳定。周赞虎等通过将hCu，Zn-SOD基因中非活性中心第111位活跃的Cys转换成相对惰性的Ala,在无毒的聚球藻中表达改良后的hCu,Zn-SOD，表达量为占藻体可溶性蛋白的3.61%，具有相应酶活，且比天然hCu，Zn-SOD的热稳定性有了一定的提高。在利用不同的表达系统来提高其产量方面，Hallewell等人报道hCu,Zn-SOD的cDNA的核苷酸序列，并使其在大肠杆菌中获得高效表达，表达的蛋白可溶性为5%;他们还研究了hCu,Zn-SOD基因在酵母菌中的表达，其产生的hCu,Zn-SOD是可溶的，具正常的酶比活。赵敏顺等人工合成了Cu,Zn-SOD基因，并在五.co//中进行了有效表达，表达量占菌体总蛋白的13%。医学科学院基础医学研究所和海军总医院分子生物学研究室将hCu，Zn-SOD在基因克隆到大肠杆菌中，表达率高达50%。施惠娟等以RT-PCR法获得hCu,Zn-SOD并使之表达，分别获得了38%和50%的高表达率且表达的蛋白具有SOD有酶活性。对hCu，Zn-SOD进行重组就是为了获得高表达的活性蛋白，克服传统工艺的缺陷，因此在表达成功的基础上，表达的活性蛋白占总蛋白的比例对重组方案的影响是很重要的。而以上所述的对hCu,Zn-SOD进行修饰或者选择不同的表达载体，虽然获得具有活性的重组蛋白，但是最终所获得的活性蛋白的产量不高。
发明内容本发明解决的问题在于利用基因工程方法获得具有生物活性的rhCu,Zn-SOD蛋白，提高活性蛋白的产量；同时提供活性蛋白的制备纯化工艺，降低生产成本，为rhCu，Zn-SOD的广泛应用和大规模工业化生产奠定基础。本发明是通过以下技术方案来实现的一种提高重组人Cu，Zn-SOD活性蛋白产量的方法，对编码人Cu，Zn-SOD蛋白的基因序列进行定点突变，构建人Cu,Zn-SOD重组表达载体以转化宿主细胞，提高其所表达的可溶性重组蛋白的比例；所述的定点突变为人Cu，Zn-SOD蛋白的第6位和第111位半胱氨酸残基定点突变为亲水性氨基酸残基。所述人Cu，Zn-SOD蛋白的第6位和第111位半胱氨酸残基均定点突变为丝氨酸残基；所述构建人Cu,Zn-SOD重组表达载体所引入的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。上述的提高重组人Cu,Zn-SOD活性蛋白产量的方法，包括以下步骤a、通过基因定点突变，将编码rhCu,Zn-SOD蛋白111位和6位的Cys残基突变为Ser残基首先构建rhCu,Zn-SOD第111位突变体rhCu,Zn-SODCys6'se出i，在突变体rhCu,Zn-SODCys6'se"n的基础上构建rhCu,Zn-SOD第6、111位突变体rhCu,Zn-SODS^Se"u;根据上述突变位点，设计了5条引物，分别为Pl:gtacatatggcgacgaaggccgtgtg26P2:gtacatatggcgacgaaggccgtgagcgtgctgaag36P3:cgagtcgacttattgggcgatcccaattac30P4:aatgatggaatggtctcctgagagcgag28P5:gaccattccatcattggccgcacactg27其中，Pl和P2含有NdeI的酶切位点，P3含有终止密码子和SalI的酶切位点；分别以P1、P4和P3、P5为前后引物对，人Cu,Zn-SOD基因为模板，进行两次PCR，所得产物互为模板和引物进行第三次PCR，最后再以P1、P3为前后引物对，第三次PCR定点突变所得产物为模板进行第四次PCR，最终获得111位的Cys突变为Ser的突变体基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示；以P2、P3为前后引物对，SEQIDNO.l所示的基因序列为模板进行PCR，获得第6位、111位的Cys突变为Ser的突变体基因，其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示；b、通过NdeI的酶切位点、SalI酶切位点分别将上述两种突变体基因克隆入原核表达载体pET22b中构建表达载体，分别转化感受态细胞，挑取单克隆培养过夜；提取质粒，经SalI和NdeI双酶切鉴定确认插入片段；c、挑取重组单菌落接种于10mL含Ampl00mg/mL的LB培养液中，37r摇床培养过夜，次日以1:100的比例转接到含AmplOOmg/mL的LB培养液中，在37"摇床培养3.5h至对数生长中期，加入终浓度为lmmol/L的IPTG，继续培养4h，离心收集菌体；d、收集的菌体裂菌并离心后，上清加入质量分数30。/。的(NH02SO4沉淀，再加入硫酸铜至终浓度为lmmoL/L，然后透析至O.OIM、pH8.0的Tris-Hcl缓冲液中，过DEAE柱进行纯化，采用含0.2MNaCl的O.OIM、pH8.0的Tris-Hcl洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。本发明有益的技术效果本发明将天然hCu,Zn-SOD的基因序列插入到pET22b原核表达载体中，构建天然hCu，Zn-SOD的重组表达载体；另外以天然hCu，Zn-SOD的基因序列为模板，对hCu,Zn-SOD做定点突变，构建突变的hCu,Zn-SOD重组表达载体。上述表达载体不仅可以在BL21(DE3)中高效表达，而且与未突变体比较，突变体在总体表达量不变的情况下(占菌体蛋白总量的50%)，裂菌上清中的重组蛋白占重组蛋白总体表达的比例由40%提高到80%，并且从上清中纯化的突变体rhCu，Zn-SOD的比活性与上清中纯化的未突变rhCu,Zn-SOD的相当。比较从上清中纯化的rhCu,Zn-SOD和从沉淀中纯化的rhCu,Zn-SOD的比活性，发现从上清中纯化的rhCu，Zn-SOD的比活性为从沉淀中纯化的rhCu,Zn-SOD的45倍，因此增加rhCu，Zn-SOD蛋白在裂菌上清中的表达比例可以大幅提高rhCu,Zn-SOD的活性产量。确定的上清表达量大量增加的rhCu,Zn-SOD突变体的氨基酸序列通式为hCu,Zn-SOD天然氨基酸序列的6位、111位的半胱氨酸突变丝氨酸，或者6位、lll位的半胱氨酸突变为其他亲水性氨基酸。其中6位、111位双突变为亲水性丝氨酸使得裂菌上清中的重组蛋白占重组蛋白总体表达的比例由40%提高到80%，并且从上清中纯化的突变体rhCu,Zn-SOD的比活性与上清中纯化的未突变rhCu,Zn-SOD的相当。另一方面，本发明提供的制备纯化工艺，不但使发酵后得到的活性蛋白量产量增加，而且使下游的纯化工艺大大简化，有效地降低了rhCu,Zn-SOD生产成本，提高了其产量，为rhCu，Zn-SOD的广泛应用和大规模工业化生产奠定了基础。图l是三种rhCu,Zn-SOD突变体表达载体的双酶切鉴定结果其中，泳道1为DL2000;泳道2为pET22b-rhSOD双酶切；泳道3为pET22b-rhSODGys6'Serlll双酶切；泳道4为pET22b-rilSOD双酶切；泳道5为对照载体。图2是rhCu,Zn-SOD突变体和rhCu,Zn-SOD的诱导表达SDS凝胶电泳鉴定结果其中泳道1为蛋白分子量标准；泳道2为pET22b-rhSOD/BL21未诱导；泳道3为pET22b-rhSOD/BL21IPTG诱导；泳道4为pET22b-rhSOD6'm/BL21IPTG诱导。图3是rhCu-ZnSOD突变体和rhCu-ZnSOD的WesternBlot鉴定结果其中，泳道1为蛋白分子量标准；泳道2为pET22b-rhSOD/BL21未诱导；泳道3为pET22b-rhSOD/BL21经IPTG诱导；泳道4pET22b-rhSOD6'm/BL21经IPTG诱导。图4是rhCu,Zn-SOD突变体和rhCu，Zn-SOD裂菌沉淀蛋白SDS凝胶电泳结果泳道1为蛋白分子量标准；泳道2为诱导pET22b-rhSOD/BL21裂菌沉淀；泳道3为诱导pET22b-rhSOD6'm/BL21裂菌沉淀。图5是rhCu,Zn-SOD突变体和rhCu，Zn-SOD裂菌上清蛋白SDS凝胶电泳结果泳道1为蛋白分子量标准；泳道2为诱导pET22b-rhSOD/BL21裂菌上清；泳道3为诱导pET22b-rhSOD6'm/BL21裂菌上清。图6是rhCu,Zn-SOD和rhCu,Zn-SOD6，111纯化结果的鉴定泳道1为蛋白分子量标准；泳道2为rhCu,Zn-SOD6'111纯化结果；泳道3为rhCu,Zn-SOD纯化结果。具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。为了解决利用基因工程获得具有生物活性的rhCu，Zn-SOD蛋白，提高活性蛋白的产量，本发明采用的方案是提高可溶性蛋白占总蛋白的比例，通过以下方案来实施1、首先确定增加rhCu，Zn-SOD在裂菌上清中的比例可以大幅提高rhCu，Zn-SOD的活性产量。将hCu,Zn-SOD基因克隆入原核表达载体pET22b中，经诱导后使其在大肠杆菌中得到有效表达，表达量占菌体总量的50%左右。经过溶菌酶裂菌，目的蛋白在裂菌上清中的比例约占总目的蛋白量的40%，在裂菌沉淀中的比例约占总目的蛋白量的60%。同时从上清和沉淀中进行纯化，均获得纯度大于90%的rhCu,Zn-SOD。活性测定结果显示，从上清中纯化的rhCu,Zn-SOD的比活性为13000U/mg，从沉淀中纯化rhCu，Zn-SOD的比活性为3200U/mg，ii从裂菌上清中纯化的目的蛋白的比活性是从裂菌沉淀中纯化的目的蛋白的比活性的4倍。也就是说在表达相同量的重组蛋白情况下，与沉淀的重组蛋白相比，可溶性的重组蛋白中活性蛋白所占的比例高。所以提高rhCu,Zn-SOD在菌体表达上清(可溶性)中的比例能够大大提高rhCu,Zn-SOD的活性产量。2、通过对rhCn,Zn-SOD和其突变体可溶性目的蛋白占目的蛋白表达总量的比例比较分析，确定了上清表达量大量增加的rhCu，Zn-SOD突变体的氨基酸序列通式为hCu，Zn-SOD天然氨基酸序列的6位、111位的半胱氨酸突变为亲水性氨基酸丝氨酸，或6位、111位的半胱氨酸突变为其他亲水性氨基酸。采用点突变技术对hCu,Zn-SOD的6位和111位半胱氨酸进行定点突变为亲水的丝氨酸残基，获得lll位突变变体(命名为rhCu,Zn-SOD111)，6位和111双突变体(命名为rhCu，Zn-SOD6.川)系列基因；将rhCu,Zn-SOD、rhCu，Zn-SOD6'111基因插入pET22b原核表达载体中，转化大肠杆菌，使其高效表达。对表达菌体裂菌上清中目的蛋白比例进行比较分析，发现6位、111位突变为丝氨酸可以大幅提高目的产物在裂菌上清中的比例，而且与未突变体比较，在重组蛋白总体表达量不变的情况下(占菌体蛋白总量的50%)，6位、111位双突变把裂菌上清的重组蛋白占重组蛋白总体表达的比例由40%提高到80%，并且从上清中纯化的rhCu,Zn-SOD突变体的比活性与从上清中纯化的未突变rhCu/Zn-SOD的相当。分析上述结果得出使rhCu，Zn-SOD表达在上清中比例提高、活性蛋白总产量提高的突变体通式为hCu,Zn-SOD天然氨基酸序列的6位、111位的半胱氨酸突变为丝氨酸残基；由于第6位、111位半胱氨酸的丝氨酸突变并没有引起重组蛋白活性的变化，说明第6位、111位并不是影响hCu,Zn-SOD的关键位点；鉴于为了提高重组蛋白的可溶性，推定当第6位、111位的半胱氨酸突变为其他亲水性氨基酸残基同样能够实现相同的技术效果。3、用基因工程方法对上述的rhCu,Zn-SOD突变体进行了高效表达，并进行了鉴定、纯化和活性检测，获得了高溶解性、高活性产量的rhCu/Zn-SOD突变体的制备工艺。下面对上述的实施方案做详细说明(DhCu,Zn-SOD基因的获取按照基因Bank中天然hCu，Zn-SOD的基因序列，进行全基因合成，其基因序列如下atggcgacg3aggccgtgtgcgtgctgaagggcgacggcccagtgcagggcatcatcaat60ttcgagcag33gg333gt33tgg3CC3gtgaaggtgtgggg33gC3tta33gg3Ctg3Ct120gaaggcctgcatggattccatgttcatgagtttgg3g3t33teicagcaggctgtaccagt180gcaggtcctcactttaatcctctatccagaaaacacggtgggCC肪3gg3tg卿卿gg240catgttggagacttgggcaatgtgactgctgacaaagatggtgtggccgatgtgtctatt300gaagattctgtgatctcgctctcaggagaccattgcatcattggccgcacactggtggtc360catgaaaaagcagatgacttgggcaiaaggtgga肪tgaaggacgggaaac420gctggaagtcgtttggcttgtggtgtaattgggatcgccc465②rhCu，Zn-SOD及其突变体的表达系统的构建通过将hCu，Zn-SOD第6位、111位的Cys突变为Ser，构建hCu,Zn-SOD的突变体，突变位点分别为(Cys6，Serlll)和(Ser6，Serlll)。根据上述突变位点，设计了5条引物，分别为Pl:gtacatatggcgacgaaggccgtgtg26P2:gtacatatggcgacgaaggccgtgagcgtgctgaag36P3-cgagtcgacttattgggcgatcccaattac30P4:aatgatggaatggtctcctgagagcgag28P5:gaccattccatcattggccgcacactg27其中，Pl和P2含有NdeI的酶切位点，P3含有终止密码子和SalI的酶切位点。以上引物由上海生工生物技术有限公司合成。分别以P1、P4和P3、P5为前后引物对，rhCu,Zn-SOD基因为模板，进行两次PCR，所得产物互为模板和引物进行第三次PCR。最后再以P1、P3为前后引物对，第三次PCR所得产物为模板进行第四次PCR，获得rhOi,Zii-SODeys6'Seml突变体基因。其四次PCR反应条件分别为<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>分别得到大小为300bp(产物A)、lOObp(产物B)左右的目的条带；以其互为模板和引物进行第三次PCR反应，其PCR反应条件为C.2XTaqPC腹asterMix1OjxL产物AlfxL产物BlpLddH208pL94。C5min—94。C50s--61°Clmin-10个循环20|uL-72。Clmhr-72°ClOmin——4。CD.得到产物C，以其为模板进行第四次PCR反应'2XPremixTaq10引物Pl0.5pL引物P30.5fiL产物Cl|uLddH2Q94。C5min——94°C30s——62°C50s_20|liL-72°Clmin-画72。ClOmin——4°C30个循环通过上述四次PCR反应，获得rhCu，Zn-SODc^'s"m突变体基因，其基因序列如SEQIDNO.l所示。以P2、P3为前后引物对，hCu,Zn-SODCys6'Sed11基因为模板进行PCR定点突变，获得hCu,Zn-SODSer6'Sef111突变体基因。其PCR反应条件为2XTaqPCRMasterMix1OfiL引物P20.5|iL引物P30.5nLpET22b-rhCu,Zn-SODSct6'Sef1111pLddH208pL20(iL94°C5min——94°C30s——58。C30s——72°Clmin——72°ClOmin——4°C_35个循环_所得hCu,Zn-SODSw6，s"m基因序列如SEQIDNO.2所示。通过NdeI的酶切位点、SalI酶切位点分别将hCu，Zn-SOD及2种突变体基因克隆入原核表达载体pET22b中，将上述重组载体分别转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆培养过夜；提取质粒，经SalI和NdeI双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图1所示，对照泳道1和5，泳道2、3、4经酶切鉴定都获得预期460bp大小的插入片段，说明上述载体构建并转化成功。对引入pET22b的hCu，Zn-SOD及其突变体分别进行测序，引入的hCu,Zn-SOD与天然hCu,Zn-SOD的基因序列相同，2个突变体(Cys6，Ser111)和(Ser6，Serlll)的基因序列分别如SEQIDNO.l、SEQIDNO.2所示。其突变位点分别为111位单点、6位和111位双点。将hCu,Zn-SOD及其2个突变体(Cys6，Serlll)和(Ser6，Serlll)的重组质粒分别命名为pET22b-rhSOD、pET22b-rhSODSw6'Cys111、和pET22b-rhSODSer6'Serlll。hCu,Zn-SOD和其突变体(Ser6，Serlll)所得工程菌分别命名为pET22b-rhSOD/BL21、pET22b-rhSOD6，m/BL21。③rhCu,Zn-SOD及其突变体的表达16挑取riiCu，Zn-SOD和其突变体工程菌的单菌落接种于10mL含100mg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB的培养液中，37""C摇床培养过夜，次日以l:lOO的比例转接到含Amp的LB培养液中，37。C摇床培养3.5h至对数生长中期(OD6o。为0.40.6)，加入终浓度为lmmol/L的IPTG，继续培养4h。离心收集菌体。④表达产物的鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)取少许菌体加入50nL水和50^iL2x载样缓冲液，混匀。沸水中煮5min，12000rpm离心5min，取4.5pL上清加样于15°/。分离胶6%浓縮胶，电压160V，电泳lh。用0.5。/。考马斯亮兰R-250振荡染色lh，脱色直至背景清晰后制备干胶保存。结果如图2所示，泳道3、4在20.1KD附近有新生电泳条带，上述菌体的表达载体均得到表达。凝胶扫描分析表达量，结果显示rhCu，Zn-SOD、rhCu，Zn-SOD6'111总体表达量占菌体蛋白总量的50%。免疫印迹反应SDS-PAGE结束后，按Bio-Rad产品说明，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维膜(NC膜)靠近阳极一侧，置转移缓冲液中(25mmol/LTris、192mmol/LGlycine、20%甲醇)，100V恒压lh，将蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转移结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST(含0.02mol/LpH7.4TBS、0.4%Tween20)室温洗3次，浸入封闭液(含2%BSA的TBST)中37。C条件下1h，洗涤液(TBST)室温洗3次，加小鼠抗人SOD单克隆抗体，37'C孵育1h，TBST室温洗膜3次，加入羊抗小鼠IgG-AP二抗，37。C孵育lh，TBST室温洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入显色液中，室温避光显色5min，蒸馏水冲洗终止反应。结果如图3所示，诱导后的蛋白(泳道3、4)均可以特异性的与小鼠抗人SOD单克隆抗体特异性结合，且显色条带位置与预期结果相符，说明rhCu,Zn-SOD及其突变体经诱导后得到表达。表达菌体的裂解及表达产物结果分析取rhCu,Zn-SOD及其突变体的发酵菌体各1克加入到10mL裂解Buffer中，4'C搅拌得到菌悬液，然后加入0.5mg溶菌酶；4'C搅拌20分钟，加入7mg脱氧胆酸钠，室温搅拌至粘稠，加入MgCl2至终浓度为10mmoL/L，加入DNasel5(iL,搅拌至不粘稠。取50pL裂菌后的溶液，4°C，15,000rpm离心30min，吸出上清加入50pL2x载样缓冲液，混匀；裂菌沉淀样品加入50pL水，混悬后再加入50|iL2x载样缓冲液混匀。沸水中煮5min，12000rpm离心5min。制得的样品取4.5pL上清进行SDS-PAGE。用0.5%考马斯亮兰R-250振荡染色1h，脱色直至背景清晰后制备干胶，结果如图4、图5所示；目的蛋白rhCu,Zn-SOD在裂菌上清和沉淀中均有分布。凝胶扫描分析rhCu，Zn-SOD及其突变体裂菌上清和沉淀中目的蛋白的比例。结果显示rhCu,Zn-SOD在裂菌上清中的比例为蛋白表达总量的40%，rhCu，Zn-SOD6'111在裂菌上清中的比例为蛋白表达总量的80%。rhCu,Zn-SOD蛋白的纯化同时从上清和沉淀中进行纯化，均获得纯度大于90%的rhCu,Zn-SOD。活性测定结果显示，从上清中纯化的rhCu,Zn-SOD的比活性为13000U/mg，从沉淀中纯化rhCu,Zn-SOD的比活性为3200U/mg，从裂菌上清中纯化的目的蛋白的比活性是从裂菌沉淀中纯化的目的蛋白的比活性的4倍。rhCu,Zn-SOD和rhCu,Zn-SOD6'111的裂菌上清分别经30%硫酸铵沉淀后，加入硫酸铜至终浓度lmmoL/L，然后透析至O.OIM、pH8.0的Tris-Hcl缓冲液中，过DEAE柱进行纯化，采用0.2MNaCl，0.01MpH8.0Tris-Hcl洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。对纯化的rhCu，Zn-SOD进行SDS-PAGE和比活性测定。SDS-PAGE结果如图6所示，泳道2、3所示的目的蛋白峰处于20.1KD附近，与预期结果相符。⑦rhCu,Zn-SOD及其不同突变体的活力测定根据GB/T5009.171-2003，采用修改的Marklund方法进行纯化的rhCu，Zn-SOD及rhCu，Zn-SOD6，111的活力测定。试剂-A液pH8.2，O.lmoL/LTris-HCl(含lmmoL/LEDTA2Na)。称取1.2114gTris和37.2mgEDTA2Na，溶于62.4mLO.lmoL/LHC1溶液中，蒸馏水定容至100mL;B液4.5mmoL/L邻苯三酚溶液。称取邻苯三酚(AR)56.7mg先溶于10mmoL/L盐酸溶液中，再用其定容至100mL。方法a.在25。C左右，于10mL比色管中依次加入A液2.35mL，蒸馏水2.00mL，B液0.15mL，加入B液后立即混匀，开始计时，lmin后于325nm处测定邻苯三酚的自氧化速率吸光值；b.在25T左右，于10mL比色管中依次加入A液2.35mL，蒸馏水1.8mL，待测SOD溶液20uL，B液0.15mL，加入B液后立即混匀，开始计时，lmin后于325nm处测定样品的吸光值，取吸光值约为邻苯三酚的自氧化速率的1/2的值为样品测定值代入下式进行计算-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>其中U/mL—SOD酶活力单位△A325—邻苯三酚自氧化速率△A'325—SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率V—SOD酶液体积(mL)D~SOD酶液的稀释倍数4.5—反应总体积(mL)计算结果为rhCu,Zn-SOD活力(U/mL)=4000U/mLrhCu，Zn-SOD6'111活力(U/mL)=11000U/mL比活性计算染料法(杨安钢等，《生物化学与分子生物学实验技术》，高等教育出版社)检测纯化的目的蛋白的蛋白浓度，用测定的活力和蛋白浓度计算rhCu,Zn-SOD及rhCu,Zn-SOD6，111的比活性。试剂考马斯亮蓝染液称取0.1g考马斯亮蓝G-250溶解于95。/。乙醇中，加入100mL85。/。磷酸，加水稀释至1000mL。方法标准曲线绘制在试管中分别加入0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的0.1mg/mL牛血清白蛋白标准溶液(购自西安舟鼎国生物技术有限公司)，用水补足到1.0mL，加入5.0mL考马斯亮蓝染液，混匀后室温放置5min，在595nm处比色测定，制作的标准曲线为y=0.0272x+0.1221(其中y为样品在595nm处的吸光度，x为蛋白含量ug);在试管中分别加入待测酶液0.8mL，用水补足到1.0mL，加入5.0mL考马斯亮蓝染液，混匀后室温放置5min，在595nm处比色测定吸光值，计算蛋白浓度和蛋白比活性。具体结果见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>结果显示从上清中纯化获得的rhCu,Zn-SOD6'111的活力是rhCu,Zn-SOD的3.2倍。从rhCU,Zn-SOD6'111突变体上清中获得的目的蛋白的总活力要远远高于未突变的rhCu,Zn-SOD。核苷酸序列表<110>陕西省微生物研究所〈12O—种提高重组人Cu，Zn-S0D活性蛋白产量的方法<160>2<210>1<211>465<212>DNA<213>人工合成<400>1atggcgacgaaggccgtgagcgtgctgaagggcgacggcccagtgcagggCEitcatcaat60ttcgagcagatggaccagtga郷tgtggggaagcattaaaggactgact120gaaggcctgcatggattccatgttcatgagtttgg3g3t3atacagcaggctgtaccagt180gcaggtcctcactttaatcctctatccagaaaacacggtgggccaemggatga卿gagg240catgttggagacttgggcaatgtgactgctgacaaagatggtgtggccgatgtgtctatt300gaag3ttctgtgatctcgctCtC3gg3g3Ccattccatcattggccgcacactggtggtc360cagatgacttgggcaeiaggtggaaatgaag3肪gt3c犯agscgggaa^c420gctgg卿tcgtttggcttgtggtgtaattgggatcgccc465<210>2<211>465<212>DNA<213>人工合成<400>2atggcgacgaaggccgtgagcgtgctg肪gggcgacggcccagtgcagggcatcatcaat60ttcg3gc恥33gg朋agt幼tggaccagtgaaggtgtggggaagcattaaaggactgact120gaaggcctgcatggattccatgttcatgagtttggagataatacsgcaggctgtaccagt18022gcaggtcctcactttaatcctctatccagaaaacacggtgggccaaaggatgaagagagg240catgttggagacttgggcaatgtgactgctgacaaagatggtgtggccgatgtgtctatt300ga卿ttctgtgatctcgctctcaggagaccattccatcattggccgcacactggtggtc360catgaaaaagcagatgacttgggcaaaggtggaaatgaagaaagtacaaagacgggaaac420gctggaagtcgtttggcttgtggtgtaattgggatcgcccaataa46权利要求1、一种提高重组人Cu，Zn-SOD活性蛋白产量的方法，其特征在于，对编码人Cu，Zn-SOD蛋白的基因序列进行定点突变，构建人Cu，Zn-SOD重组表达载体以转化宿主细胞，提高其所表达的可溶性重组蛋白的比例；所述的定点突变为人Cu，Zn-SOD蛋白的第6位和第111位半胱氨酸残基定点突变为亲水性氨基酸残基。2、如权利要求1所述的提高重组人Cu，Zn-SOD活性蛋白产量的方法，其特征在于，人Cu,Zn-SOD蛋白的第6位和第111位半胱氨酸残基均定点突变为丝氨酸残基。3、如权利要求2所述的提高重组人Cu,Zn-SOD活性蛋白产量的方法，其特征在于，构建人Cu，Zn-SOD重组表达载体所引入的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。4、如权利要求2所述的提高重组人Cu,Zn-SOD活性蛋白产量的方法，其特征在于，包括以下步骤a、通过基因定点突变，将编码rhCu，Zn-SOD蛋白111位和6位的Cys残基突变为Ser残基首先构建rhCu，Zn-SOD第111位突变体rhCu，Zn-SODCys6's"m，在突变体rhCu,Zn-SODCys6'^"的基础上构建rhCu,Zn-SOD第6、111位突变体rhCu，Zn-SODS^se"u;根据上述突变位点，设计了5条引物，分别为Phgtacatatggcgacgaaggccgtgtg26P2:gtacatatggcgacgaaggccgtgagcgtgctgaag36P3:cgagtcgacttattgggcgatcccaattac30P4:aatgatggaatggtctcctgagagcgag28P5:gaccattccatcattggccgcacactg27其中，Pl和P2含有NdeI的酶切位点，P3含有终止密码子和SalI的酶切位点；分别以Pl、P4和P3、P5为前后引物对，人Cu,Zn-SOD基因为模板，进行两次PCR，所得产物互为模板和引物进行第三次PCR，最后再以P1、P3为前后引物对，第三次PCR定点突变所得产物为模板进行第四次PCR，最终获得111位的Cys突变为Ser的突变体基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示；以P2、P3为前后引物对，SEQIDNO.l所示的基因序列为模板进行PCR，获得第6位、111位的Cys突变为Ser的突变体基因，其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示；b、通过NdeI的酶切位点、SalI酶切位点分别将上述两种突变体基因克隆入原核表达载体pET22b中构建表达载体，分别转化感受态细胞，挑取单克隆培养过夜；提取质粒，经SalI和NdeI双酶切鉴定确认插入片段；c、挑取重组单菌落接种于10mL含Ampl00mg/mL的LB培养液中，37。C摇床培养过夜，次日以l:100的比例转接到含Ampl00mg/mL的LB培养液中，在37"C摇床培养3.5h至对数生长中期，加入终浓度为lmmol/L的IPTG，继续培养4h，离心收集菌体；d、收集的菌体裂菌并离心后，上清加入质量分数30。/。的(NH4)2SO4沉淀，再加入硫酸铜至终浓度为lmmoL/L，然后透析至O.OIM、pH8.0的Tris-Hcl缓冲液中，过DEAE柱进行纯化，采用含0.2MNaCl的O.OIM、pH8.0的Tris-Hcl洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。全文摘要一种提高重组人Cu，Zn-SOD活性蛋白产量的方法，对编码人Cu，Zn-SOD蛋白的基因序列进行定点突变，构建人Cu，Zn-SOD重组表达载体以转化宿主细胞，提高其所表达的可溶性重组蛋白的比例；所述的定点突变为人Cu，Zn-SOD蛋白的第6位和第111位半胱氨酸残基定点突变为亲水性氨基酸残基。第6位、111位双突变为亲水性丝氨酸使得裂菌上清中的重组蛋白占重组蛋白总体表达的比例由40％提高到80％，并且从上清中纯化的突变体rhCu，Zn-SOD的比活性与上清中纯化的未突变rhCu，Zn-SOD的相当。文档编号C12N15/74GK101525600SQ20091002172公开日2009年9月9日申请日期2009年3月27日优先权日2009年3月27日发明者一万,琨张,张月娟,琰王申请人:陕西省微生物研究所