专利名称：一种大豆plp类酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及与蛋氨酸合成相关的吡哆醛-5'-磷酸依赖碳-硫(C-S)裂解酶(pyridoxal-5' -phosphate-dependent carbon-sulfur(C-S) lyase, PLP)及其编码基因与应用，并涉及来源于大豆的与蛋氨酸 合成相关的PLP类酶GmCBL及其编码基因与其在培育高含量蛋氨酸植物品种中的 应用。
背景技术：
大豆[67yci; ey^x (L.) Merr.]是世界上主要的粮食和油料作物，是人类和 动物食物中高质量植物蛋白质的主要来源。随栽培条件和生长环境，大豆含有的 蛋白质为30-55%，对大豆蛋白需求超过最一般的消费食物资源。但含硫半光氨酸 和蛋氨酸含量少，是大豆蛋白质营养价值的限制因素，大豆蛋白中第一限制性氨 基酸是蛋氨酸，其限制和降低了其它氨基酸的有效性。目前大豆蛋白质改良的最 主要目标是提高蛋白质含量的同时，增加含硫氨基酸的即蛋氨酸(Met)的含量， 以提高作为人蓄植物蛋白主要来源的大豆营养价值和经济效益。利用基因工程手 段改良大豆含硫氨基酸含量，有效的途径之一是对涉及硫生物合成路径中的关键 酶进行操作。Cystathionine 0 -lyase (CBU (EC 4. 4. 1. 8)，是PLP(pyridoxal-5 'phosphate-dependent carbon-sulfur (C-S) lyase)裂解酶类a家族内的Y 亚家族，这个酶主要参与微生物和植物蛋氨酸生物合成的倒数第二步骤，其催化 裂解L型-胱硫醚生成同型半胱氨酸，丙酮酸和NH3。 CBL酶是广泛存在于植物、 酵母、细菌以及真菌中。目前主要从大肠杆菌、拟南芥、马铃薯、水稻、菠菜等 克隆出此基因。系统发育分析表明，CBL基因主要分为三种类型单子叶植物、 双子叶植物和藻类植物。
蛋白资源短缺是21世纪面临的全球性严重问题，尤其是发展中国家，因此 尽快提高大豆品种蛋白质含量的同时，积极改善蛋白质的品质，提高其营养价值， 对改善人类生活质量和畜牧产业具有积极而深远的现实意义。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种大豆PLP类酶及其编码基因与应用。技术方案
本发明所提供的大豆PLP类酶，名称为GmCBL，来源于大豆属大豆[Wyc^e 历ay ( L.)]，是具有序列表中的SEQ ID N0.2所述氨基酸序列的蛋白质。
上述的大豆PLP类酶的编码基因，其cDNA基因具有序列表中fi^瓜基因SEQ ID NO. 1的DNA序列；其中，序列表中的fiHGK基因SEQ ID NO. 1由1404个脱氧 核苷酸组成，本序列为6feG9Z基因的读码框，编码具有序列表中SEQ ID NO. 2的 氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明^C说基因SEQ ID NO. 1的表达载体是指pMDC83-fe7C瓜植物过 量表达载体，宿主菌是指将ft^瓜基因转入的根癌农杆菌菌株EHA105。
扩增6^7瓜基因的引物是， GmCBL 0RF正向引物5 '-ATGTTTTCTTCTGCMTTT-3，， GmCBL 0RF反向引物5 ' -MGAGGCCCTGTTCTAAGT-3 ，。
上述大豆PLP类酶GmCBL酶及其编码基因^CSZ基因可在培育高含量蛋氨酸 植物中得到应用。
有益效果
导入过量表达"/^vK的烟草与未转基因烟草相比，其蛋氨酸含量显著提高， 说明fiz"见基因对提高植物的蛋氨酸含量方面起着重要作用。
本发明的^H6SL对培育高含量蛋氨酸植物品种特别是高含量蛋氨酸大豆，提 高农作物特别是大豆的品质具有重要意义。
利用植物表达载体，将本发明的fi^AZ的编码基因导入植物细胞，可获得高 含量蛋氨酸的转基因细胞系及转基因植株。
使用^;G5Z构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增 强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛 选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因
(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、 卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。
携带有本发明^C弘的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病 毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植 物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水 稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜 蓿等双子叶植物。下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图1为fi^6)K基因在大豆染色体位置结构示意图
图2为含有6feGK的植物表达载体的部分结构示意图，此表达载体在大肠杆 菌和农杆菌中，抗卡那霉素(Km， 50mmol/l)、潮霉素B (hygromycin， 50咖o1/1)
图3为转6i^SZ烟草株系19、株系20、株系23与野生型植株荧光定量 (QRT-PCR)表达分析比较图
图4为转基因株系19、株系20、株系23和野生型植株蛋氨酸相对含量的统 计分析
(*，尸《0. 05; **，,《0. 01)
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。 一、大豆GmCBL及其编码基因的cDNA克隆与鉴定
大豆(67j^'"e鹏x(L ) Merr.)材料南农88-31 (简写NN88-31)(余本水， 中国种植科技育种成果指南，2003， 237)由南京农业大学国家大豆改良中心种 质资源研究室提供，材料种植于网室，常规田间管理。依据模式植物拟南芥
(AtHCBL， L40511)上报道鉴定的胱硫醚P-裂解酶(cystathionine 3-lyase) 基因，并依据大豆的EST信息，及物种间氨基酸序列的同源性分析，序列拼接、 分析，其具有序列表中SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，编码具有序列表中序列2 的氨基酸残基序列。氨基酸序列分析表明，在序列表中序列2由468个氨基酸残 基组成，自氨基端(N端)预测出GmCBL基因从1-33具有叶绿体转运肽结构，第 81位点具有亮氨酸富集核输出信号特点，第134位是糖基化位点(0 -(alpha)-GlcNAc glycosylation sites)。第81位K为赖氨酸残基，为辅因子 磷酸吡多醛的结合位点。GmCBL蛋白有多个磷酸化作用位点。
用Peimer3程序根据GmCBL基因序列设计引物
GmCBL 0RF sense: 5ATGTTTTCTTCTGCMTTT-3，，
GmCBL 0RF antisense: 5AGAGGCCCTGTTCTAAGT-3，应用RT-PCR方法，从大 豆总RNA中扩增GmCBL基因。取大豆88-31叶片，置于液氮中研碎，RNA提取依 据TIANGEN总RNA提取试剂盒RNA Plant Extraction kit DP417进行。cDNA第 一链合成依据TaKaRa试剂公司cDNA第一链合成试剂盒TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit D6110A，具体详见操作说明。以得到的cDNA片段 为模板进行PCR扩增反应。25|ilu 1PCR反应体系为一链cDNA(O. 05y g)、lpl引物(10yM) 、 2.5fil IOXPCR缓冲液、2. 5^1 Mg2+、 4fi1 dNTP(10mM)和1. 25U LA Taq DNA聚合酶，用超纯水补足25)11。反应在BIO-RAD PTC-200型PCR仪上 进行，其程序为95。C变性5min;再94°C 30sec， 56°C 50sec， 72°C lmin30sec， 共30个循环；然后72°。延伸10 min; 4。C保存。PCR产物回收后经链接pGEM-T Easy 载体、转化大肠杆菌DH5a、蓝白斑筛选、摇菌、测序、序列分析，结果表明该 PCR产物具有序列表中SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，命名为6iz7G见基因，然后将 SEQ ID NO. 1序列放入大豆基因组数据库中Blast,确定SEQ ID NO. 1在大豆染 色体中的位置(图1)。
二、 ^C觅基因编码蛋白的功能鉴定
利用Invitrogen公司的Gateway②Technology with Clonase II试剂盒， 将fiwfiK基因正向插入到表达载体pMDC83 (Sokolov et al, 2005, PNAS， 103:9732-9737)(图2)中，得到pMDC83-^HC5Z植物过量表达载体，用冻融法将 pMDC83-ftz^诺入根癌农杆菌菌株EHA105 (Avsian-Kretchmer et al， 2004, Plant Physiology, 135:1685-1696)中。pMDC83-fiffGBZ通过农杆菌EHA105的介 导转化烟草，PCR检测结果表明获得30株阳性植株，结合QRT-PCR分析结果，根据 fiz;Cffl:基因表达量选择了表达量高的3个阳性转基因株系(株系19、株系20、株系 23) ， fiffC^基因在3个阳性转基因株系中表达极显著(图3)。取十个星期左右 的株系19、株系20、株系23和野生型株系的叶片用A200 amino acid Nova analyzer 氨基酸分析仪测定自由氨基酸含量，检测和判定依据标准为JY/Y 019-1996氨基 酸分析方法通则，结果如图4所示，转基因株系与野生型烟草相比蛋氨酸含量均 极显著提高，其中株系19(0. 404%)比野生型(0. 196%)增长0. 208%、株系20(0. 741%) 增长0.545%、株系23 (0.515%)增长O. 319%。说明过量表达fiffC^:基因能提高转基 因烟草的蛋氨酸含量。转基因株系(19、 20、 23)与野生型株系在表型上没有差 异。序列表
<110〉南京农业大学
<120> —种大豆PLP类蛋白及其编码基因与应用 〈130>说明书
〈160〉 4
〈170〉 Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 1404
<212> 腿
<213> 大豆属大豆(Glycine max L.) <220>
<221> GmCBL基因读码框(0RF)
〈222〉 (1),.(1404)
<223>
<400〉 1
atgttttcttctgcaatttctccgaagcccttccttcggtccctcgtcattgatcgttac60
gctc3gagc3caactactgc犯CC3ggtgtgagtgcttggggttt犯c肌gtc8g肌aM120
ttcagtaccagtgtgctgaggggttc卿ctg犯ttgcttggttg犯犯t180
ag卿gatgg3tgtgg3gtCtcatctttggtggalg3tgcttccttgagc240
3ggsttt鄉ggagcctagtatctcaacattggtgatgaatttcgagagt300
aagttcgatccttttggagcaattagtacccctctttacctttt38gC3g360
ccttctgcaacccctatgactataccagaagtggaaatcc420
gcttta^g3gi3gtttactagcaaagcttgatgsgccctgtgcttcaccagt■
gg组ggctgCtttg3gtgCtgttgttcgtcttgttggaactggcg鄉aaattgtcgcc540
gg卿tg8tgtatotggtggctcagataggttgctgtctcaagtggttcc犯gg3Ctgg3600
3ttgtggtga3gCgggC犯8tacstgtgatct肌stgaggttgC3gC3gCcattggaccc660
aagscta^gcttgtgtggcttg3g3gtCC3accaatcctcggcta^c肌3tttctgatett720
caaaaaatatC8ga^t8gctcattcacatggtgctcttgtgttagtggacaatagtata780
atgtcacctgtgttgtctcggCC3ttgg肌cttggagcagatattgtcatgcactctgct840
acaaaatttattgCtgg3C8tagtgacatt3tggCtggtgtgcttgctgtg犯gggtgaa900
卿ttggga3tttcttgcaaaatgc卿gggttcaggcttagcaccattt960
gactgttggctttgtttgcgaggaatcaagacaatggccctgcgaattg31020
ga^t犯tgc3caga3gattgctgagttccttgcctcccatcctcgagtgaagaaagtgaat1080
tatgctggcttgcctggtcatcctggtcgtgatttacactattctcaggca^agggtgc31140
ggatctgtgcttagcttcttgactggttcattggaacttttgttg犯3Ct1200
ac c aaa t ac tcgtcagctttgggagtgtgsagtcccttattagcatgcca1260
tgctttatgtcacatgcaagcatacctgctgcagttcgtg鄉cc聊ggttt肌Ctg381320
gatcttgtacgtatatctgtgggaattga^ggstgtg犯tgatctcattgctgatcttgac1380
g犯cagggcctctt1404
<210> 2
<211〉 468
<212> PRT
<213> 大豆属大豆(Glycine max L ) <220>
<221〉 GmCBL蛋白序列
<222> (1)..(468)〈223〉
<400> 2 Met Phe Ser 1
lie Asp
Leu Gly
Ala Glu
50 Val Glu 65
Leu Ser
Asn Phe
Tyr Gin
Tyr Asp 130 Leu Leu 145
Gly Met
Glu lie
Ser Gin
Cys Asp 210 Val Trp 225
Gin Lys
Asp Asn
Ala Asp
Asp lie 290 Glu Leu 305
Asp Cys Glu Lys His Pro Gly Arg
Arg
Phe
35
Gly
Ser
Glu
Glu
Thr 115 Tyr
Ala
Ala
Val
Val 195 Leu
Leu
lie
Ser
lie 275 Met
Tyr
Trp
Gin
Arg 355 Asp
Ser
Tyr
20
Asn
Phe
Ser
Glu
Ser 100 Ala
Thr
Lys
Ala
Ala 180 Val
Asn
Glu
Ser
lie 260 Val
Ala
Phe
Leu
Gin 340 Val
Leu
Ala 5
Ala
Lys
Lys
Ser
Asp
85
Lys
Thr
Arg
Leu
Leu 165 Gly
Pro
Glu
Ser
Glu 245 Met
Met
Gly
Leu
Cys 325 Asp
Lys
His'
lie
Gin
Ser
Leu
Ser
70
Leu
Phe
Phe
Ser
Asp 150
Ser
Asp
Arg
Val
Pro 230 lie
Ser
His
Val
Gin 310 Leu
Asn
Lys
Tyr
Ser
Ser
Glu
Asn
55
Ser
Gly
Asp
Lys
Gly 135 Lys
Ala
Asp
Thr
Ma 215 Thr
Ala
Pro
Ser
Leu 295 Asn
Arg
Ala
Val
Ser
Pro
Thr
Asn
40
Cys
Ser
Glu
Pro
Gin 120 Asn
Ala
Val
Val
Gly 200 Ma
Asn
His
Val
Ala 280 Ala
Ala
Gly
Gin
Asn 360 Gin
Lys
Thr
25
Phe
Leu
Leu
Pro
Phe 105 Pro
Pro
Asp
Val
Tyr 185 lie
Ala
Pro
Ser
Leu 265 Thr
Val
Glu
lie
Lys 345 Tyr
Ala
Pro
10
Thr
Ser
Val
Val
Ser
90
Gly
Ser
Thr
Arg
Arg 170 Gly
Val
lie
Arg
His 250 Ser
Lys
Lys
Gly
Lys 330 lie
Ala
Lys
Phe
Ala
Thr
Glu
Asp
75
lie
Ala
Ala
Arg
Ala 155 Leu
Gly
Val
Gly
Leu 235 Gly
Arg
Phe
Gly
Ser 315 Thr
Ala
Gly
Gly
Leu
Thr
Lys
Asn
60
Asp
Ser
lie
lie
Asp 140 Leu
Val
Ser
Lys
Pro 220 Gin
Ala
Pro
lie
Glu 300 Gly
Met
Glu
Leu
Ala
Arg
Arg
Arg
45
Arg
Ala
Thr
Ser
Glu 125 Ala
Cys
Gly
Asp
Arg 205 Lys
lie
Leu
l>eu
Ala 285 Lys
Leu
Ala
Phe
Pro 365 Gly
Ser
Cys
30
Glu
Glu
Ser
Leu
Thr 110 Asn
Leu
Phe
Thr
Arg 190 Ala
Thr
Ser
Val
Glu 270 Gly
Leu
Ala
Leu
Leu 350 Gly
Ser
Leu Val 15
Glu Cys
Leu Cys
Met Asp
Leu Ser
80 Val Met 95
Pro Leu
Gly Pro
Glu Ser
Thr Ser 160 Gly Glu 175
Leu Leu
Asn Thr
Lys Leu
Asp lie 240 Leu Val 255
Leu Gly
His Ser
Gly Lys
Pro Phe 320 Arg lie 335
Ala Ser His Pro Val Leu370 375 380
Ser Phe Leu Thr Gly Ser Leu Glu Leu Ser Lys His lie Val Glu Thr 385 390 395 400
Thr Lys Tyr Tyr Ser lie Thr Val Ser Phe Gly Ser Val Lys Ser Leu
405 410 415
lie Ser Met Pro Cys Phe Met Ser His Ala Ser lie Pro Ala Ala Val
420 425 430
Arg Glu Ala Arg Gly Leu Thr Glu Asp Leu Val Arg lie Ser Val Gly
435 440 445
lie Glu Asp Val Asn Asp Leu lie Ala Asp Leu Asp Asn Ala Leu Arg
450 455 460
Thr Gly Pro Leu 465
<210〉 <211〉 〈212〉 〈213〉
<220〉 <221〉 <222〉 <223>
3
19
DNA
人工合成
GmCBL ORF正向引物 (l).. (19)
〈400〉 3
atgttttctt ctgcaattt
<210〉 <211〉 <212〉 <213>
〈220〉 〈221〉 <222〉 <223>
4
19
腿
人工合成
GmCBL ORF反向引物 (l).. (19)
<400> 4
aagaggccctgttctaagt
19
19
权利要求
1、一种大豆吡哆醛-5′-磷酸依赖碳-硫(C-S)裂解酶PLP类酶，命名为GmCBL酶，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。
2、 编码权利要求1所述的大豆PLP类酶的基因。
3、 根据权利要求2所述的编码基因，为大豆PLP类酶的cDNA基因，具有序 列表中fiwG5Z基因SEQ ID NO. 1的DNA序列。
4、 含有权利要求2或3所述基因的表达载体。
5、 根据权利要求4所述的表达载体，是指pMDC83-6fe62Z植物过量表达载体。
6、 含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。
7、 根据权利要求6所述的宿主菌，是指将6^6S^基因转入的根癌农杆菌菌 株EHA105。
8、 扩增权利要求2或3所述基因的引物，其特征是， GmCBL 0RF正向引物5ATGTTTTCTTCTGCMTTT-3， GmCBL 0RF反向引物5AAGAGGCCCTGTTCTAAGT-3，。
9、 权利要求1所述的大豆PLP类酶在培育高含量蛋氨酸植物中的应用。
10、 权利要求2或3所述的大豆PLP类酶编码基因在培育高含量蛋氨酸植物 中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种大豆PLP类酶及其编码基因与应用，属于生物技术领域。该大豆PLP类酶，命名为GmCBL酶，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。其编码基因为GmCBL基因SEQ ID NO.1的DNA序列。本发明大豆PLP类酶及其编码基因可用于培育高含量蛋氨酸植物品种特别是高含量蛋氨酸大豆品种。过量表达GmCBL的烟草与未转基因烟草相比，其蛋氨酸含量显著提高，说明GmCBL基因对提高植物的蛋氨酸含量能力方面起着重要作用。
文档编号C12N15/11GK101532005SQ200910029450
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月14日 优先权日2009年4月14日
发明者喻德跃, 瑶 姚, 宁慧霞 申请人:南京农业大学