专利名称：有机钾肥菌种剂及生物有机肥的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种有机肥菌种剂，特别是一种有机钾肥菌种剂；本发明还 涉及一种生物有机肥的生产方法。
技术背景钾肥是农业三大肥料之一，对绝大多数作物都有明显的增产效果，钾肥 的原料为钾盐类物质，钾盐是含钾矿物的总称。按其可溶性可分为可溶性钾 盐矿物和不可溶性含钾的铝硅酸盐矿物。前者是自然界可溶性的含钾盐类矿 物堆积构成的可被利用的矿产资源；它包括含钾水体经过蒸发浓縮、沉积形 成的可溶性固体钾盐矿床(如钾石盐、光卤石、杂卤石等)和含钾卤水。铝硅 酸类岩石是不可溶性的含钾岩石或富钾岩石(如明矾石、霞石、钾长石及富钾 页岩、砂岩、富钾泥灰岩等)。目前，世界范围内开发利用的主要对象是可溶 性钾盐资源。目前，我国已查明的可溶性钾盐资源储量不大，尚难满足农业对钾肥的 需求。因此，钾盐矿被国家列入急缺矿种之一。许多研究人员开始着手从海 水、含钾卤水中提取氯化钾、硫酸钾等，但是传统工艺工艺复杂，耗能较高。胶质芽孢杆菌("aw77^ 7K/^7^7V7M"SJ是生产有机肥料的重要菌种， 能够应用于微生物钾肥的生产，促进经济作物的生长。但该菌的耐盐行较差， 在较高盐浓度的培养基中生长受到显著抑制。发明内容本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种含钾量高 的有机钾肥菌种剂。本发明所要解决的另一个技术问题是提供了生物有机肥的生产方法。 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是 一种有机钾肥菌剂，其特点是，其制备方法如下(1) 将胶质芽孢杆菌(Sac2'"^ yK/c^agi7 osiA^在无氮培养基上活化后，转接于抑制荚膜生长的液体培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体；用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释至106 108个/ml，得菌体悬浮液，将菌体悬浮液用辐射诱变或者化学诱变方法 进行诱变，将诱变后的菌体悬浮液离心，获得诱变菌体；取诱变菌体进 行筛选、复筛，获得耐盐性菌株；方法如下-1) 用筛选培养基悬浮诱变菌体，调整诱变菌体浓度至105 K)6个/ml，充 分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔100 20(H4;2) 25 32。C培养5 7天，用分光光度计检测96孔培养板中的诱变菌吸 光值，选取96孔培养板中的吸光值为0. 2 0. 5的诱变菌体进行复筛；3) 将吸光值为0. 2 0. 5的诱变菌体稀释至102 103个/ml，取100 200W 诱变菌体稀释液涂布于复筛培养基平板上，25 32X:培养3 5天，重复3 5 次，出现黄色晕圈菌落为目标菌落，将目标菌落在复筛培养平板上进行2 3 次单菌落纯化后获得耐盐性胶质芽孢杆菌；(2) 将耐盐性胶质芽孢杆菌在无氮培养基上活化后，转接液体培养基中培 养，离心收集菌体，再加入等量的硅藻土、活性炭或者草木灰作吸附剂， 低温干燥，即得有机钾肥菌种剂。在以上所述的有机钾肥菌剂技术方案中，还可以按照步骤(1)所述的方 法循环进行四 五级诱变、筛选、复筛，获得在不同浓度的海水或者含钾卤 水中保持活力的耐盐性胶质芽孢杆菌；其中一级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或者含钾卤水蒸馏水=1: 100;二级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 25;三级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 10;四级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 5;五级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 1;一级诱变、二级诱变、三级诱变、四级诱变、五级诱变所产生的耐盐性胶质芽孢杆菌依次命名为HLS-1、 HLS-2、 HLS-3、 HLS-4、 HLS-5。在以上所述的有机钾肥菌剂技术方案中，步骤(2)所述的液体培养基可 以由海水、海盐卤水或含钾卤水制备，优选用卤水制备；所述的海盐卣水为 海水经蒸发浓縮，析出大部分NaCl后的卤水，以海水浓縮到30 30.5。 Be' (浓度单位)为宜；所述的含钾卤水可以为盐湖卤水、盐井卤水或者陆地矿 产含钾卤水。本发明步骤(1)所述的辐射诱变或者化学诱变的诱变方法可以采用常规 的诱变方法。如1) Co6G诱变，诱变剂量为l 8kGy;2) 将菌液浓度为稀释至104 106万个/1111，经化学诱变处理、紫外线照射 处理。处理要点是a、紫外线照射3 8分钟，再用日光照射3 8分钟；b、 以浓度为0.2 2mg/ml的亚硝基胍处理28 30分钟；c、以1.0 1.2%的硫酸 二乙酯处理30 35分钟；d、硫酸二乙加紫外线处理，紫外线处理5分钟以 后，加硫酸二乙酯(1%)处理15 20分钟。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明还 公开了一种生物有机肥的生产方法，其特点是，取以上所述的有机钾肥菌剂技术方案的步骤(2)所述的有机钾肥菌种剂加入基肥中，或者加入经其他固 氮菌、解磷菌、木霉菌和发酵菌发酵5天以上的有机肥基肥中，混匀，发酵 处理10天以上后，经干燥、制粒后即得生物有机肥。由于耐盐性胶质芽孢杆菌的液体培养基由海水、海盐卤水或含钾卤水制 备而成，含有丰富的钾盐、镁盐等，因此基肥中无需另外加入钾盐和镁盐或 者仅加入少量镁钾等矿物质。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明还 公开了另一种生物有机肥的生产方法，其特点是，取有机钾肥菌剂技术方案 的步骤(1)所述的耐盐性胶质芽孢杆菌在无氮培养基上活化后，转接于液体 培养基中培养，在25"C 3(TC、通入空气或者氧气的条件培养3 5天，得培 养液，然后将培养液喷入基肥中，或者喷入经其他固氮菌、解磷菌、木霉菌 和发酵菌发酵5天以上的有机肥基肥中，发酵处理10天以上后，经干燥、制 粒后即得生物有机肥。在本发明技术方案中所涉及的各培养基如下1、 无氮培养基-甘露醇5.0 10.0g ; K2HP040 . 5 2. 0g; MgS04 7H20 0. 2 0. 5g ;琼脂 粉15. 0 20. 0g ;蒸馏水1000ml; pH为7. 0 7. 5。2、 抑制荚膜生长的液体培养基-麦芽糖10. 0 20. 0g; (NH4)2S04 0. 5 2. 0g;酵母粉0. 1 1. 0g; MgS04 ■ 0. 2 1.0g; K2HP040. 5 2. 0g;蒸馏水1000ml， pH为7. 0 7. 5。3、 筛选培养基蔗糖5. 0 10. 0g，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml， pH为7. 0 7. 5。4、 复筛培养基-蔗糖5.0 10.0g，琼脂粉15. 0 20. 0g;溴酚蓝或甲基红指示剂0.002 0.005g*L-l，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml， pH7.0 7. 5。5、液体培养基蔗糖5. 0 10. 0g，海水、海盐卤水或者含钾卤水稀释液1000ml， pH7. 0 7.5。适用于HLS-1、 HLS-2、 HLS-3、 HLS-4、 HLS-5的培养。液体培养基中还可以根据需要加入l-10g的杂鱼虫下匀浆与/或0. 5 2g的 酵母粉与/或者0.5 2g骨粉。所述的杂鱼虾匀浆可以用杂鱼虾和海水、海盐 卤水或者含钾卤水稀释液制成，二者的重量体积比为l: 1-3左右，也可以用 市售产品，所述的骨粉和酵母粉可以为常规的市售产品。本发明有机钾肥菌剂是通过采用海水或者卤水制备的培养基结合化学诱 变或辐射诱变、定向诱变出可以适应一定浓度的海水和含钾卤水的耐盐性胶 质芽孢杆菌制备而成。经实验对比，本发明有机钾肥菌剂含钾量较高，与普通培养基培养的未诱导变异的胶质芽孢杆菌(^s"'W^ /^cW^7'/7C^A^相比，钾含量平均分别高出5.4%、 7.8%、 11.0%、 13. 2%、 15. 0% (HLS-1、 HLS-2、 HLS-3、 HLS-4、 HLS-5)，它可以作为生物有机肥直接施用于普通土壤和盐碱 性土壤，促进植物对土壤和菌剂本身钾的吸收。也可以作为有机肥菌剂，生 产有机钾肥和复合钾肥。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一 步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例l。
一种有机钾肥菌剂，其制备方法如下(1)将胶质芽孢杆菌(勘ci^"s搬c^艰i/7oms;)在无氮培养基上活化后，转接于抑制荚膜生长的液体培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体；用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释至106 108个/ml，得菌体悬浮液，将菌体悬浮液用辐射诱变或者化学诱变方法 进行诱变，将诱变后的菌体悬浮液离心，获得诱变菌体；取诱变菌体进 行筛选、复筛，获得耐盐性菌株；方法如下1) 用筛选培养基悬浮诱变菌体，调整诱变菌体浓度至105 106个/1111，充 分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔100W;2) 25'C培养5天，用分光光度计检测96孔培养板中的诱变菌吸光值， 选取96孔培养板中的吸光值为0. 2 0. 5的诱变菌体进行复筛；3) 将吸光值为0. 2 0. 5的诱变菌体稀释至102 103个/1111，取10(￥1诱 变菌体稀释液涂布于复筛培养基平板上，25。C培养3 5天，重复3次，出现 黄色晕圈菌落为目标菌落，将目标菌落在复筛培养平板上进行2次单菌落纯 化后获得耐盐性胶质芽孢杆菌；(2)将耐盐性胶质芽孢杆菌在无氮培养基上活化后，转接液体培养基中培 养，离心收集菌体，再加入等量的硅藻土、活性炭或者草木灰作吸附剂， 低温干燥，即得有机钾肥菌种剂。 实施例2。 一种有机钾肥菌剂，其制备方法如下(1)将胶质芽孢杆菌(SaC^^A 7Z7"C^a《i'/70^/W在无氮培养基上活化后，转接于抑制荚膜生长的液体培养基中培养至对数生长期，离心收集菌 体；用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释至106 108个/1111，得菌体悬浮液，将菌体悬浮液用辐射诱变或者化学诱变方法 进行诱变，将诱变后的菌体悬浮液离心，获得诱变菌体；取诱变菌体进 行筛选、复筛，获得耐盐性菌株；方法如下1) 用筛选培养基悬浮诱变菌体，调整诱变菌体浓度至105 106个/1111，充 分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔200W;2) 32。C培养7天，用分光光度计检测96孔培养板中的诱变菌吸光值， 选取96孔培养板中的吸光值为0. 2 0. 5的诱变菌体进行复筛；3) 将吸光值为0. 2 0. 5的诱变菌体稀释至102 103个/1111，取200W诱 变菌体稀释液涂布于复筛培养基平板上32C培养5天，重复5次，出现黄色 晕圈菌落为目标菌落，将目标菌落在复筛培养平板上进行3次单菌落纯化后获得耐盐性胶质芽孢杆菌； (2)将耐盐性胶质芽孢杆菌在无氮培养基上活化后，转接液体培养基中培 养，离心收集菌体，再加入等量的硅藻土、活性炭或者草木灰作吸附剂， 低温干燥，即得有机钾肥菌种剂。 实施例3。
一种有机钾肥菌剂，其制备方法如下(1) 将胶质芽孢杆菌(&ci"M鹏Ci7艰i加^A^在无氮培养基上活化后， 转接于抑制荚膜生长的液体培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体；用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释至106 1()8个/ml，得菌体悬浮液，将菌体悬浮液用辐射诱变或者化学诱变方法 进行诱变，将诱变后的菌体悬浮液离心，获得诱变菌体；取诱变菌体进 行筛选、复筛，获得耐盐性菌株；方法如下1) 用筛选培养基悬浮诱变菌体，调整诱变菌体浓度至105 106个/1111，充 分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔150W;2) 28'C培养6天，用分光光度计检测96孔培养板中的诱变菌吸光值， 选取96孔培养板中的吸光值为0. 2 0. 5的诱变菌体进行复筛；3) 将吸光值为0. 2 0. 5的诱变菌体稀释至102 103个/1111，取诱 变菌体稀释液涂布于复筛培养基平板上，28。C培养4天，重复4次，出现黄 色晕圈菌落为目标菌落，将目标菌落在复筛培养平板上进行3次单菌落纯化 后获得耐盐性胶质芽孢杆菌；(2) 将耐盐性胶质芽孢杆菌在无氮培养基上活化后，转接液体培养基中培 养，离心收集菌体，再加入等量的硅藻土、活性炭或者草木灰作吸附剂， 低温干燥，即得有机钾肥菌种剂。实施例4。实施例1或2或3所述的有机钾肥菌剂中，按照步骤(1)所 述的方法循环进行四 五级诱变、筛选、复筛，获得在不同浓度的海水或者 含钾卤水中保持活力的耐盐性胶质芽孢杆菌；其中一级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 100;二级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 25;三级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 10;四级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 5;五级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 1;一级诱变、二级诱变、三级诱变、四级诱变、五级诱变所产生的耐盐性胶质芽孢杆菌依次命名为HLS-1、 HLS-2、 HLS-3、 HLS-4、 HLS-5。实施例5。实施例1-4任何一项所述的有机钾肥菌剂中，步骤(2)所述 的液体培养基由海水、海盐卤水或含钾卤水制备；所述的海盐卤水为海水经 蒸发浓縮，析出大部分NaCl后的卤水；所述的含钾卤水为盐湖卤水、盐井卣 水或者陆地矿产含钾卤水。实施例6。实施例1-5任何一项所述的有机钾肥菌剂中，步骤(2)所述 的液体培养基为蔗糖5.0 10.0g，海水、海盐卤水或者含钾卤水稀释液 1000ml， pH7. 0 7. 5。实施例7。实施例6所述的有机钾肥菌剂中，在液体培养基中还加入以下三种成分中的一种杂鱼虾匀浆l 10g;酵母粉0.5 2g;骨粉0. 5 2g。实施例8。实施例6所述的有机钾肥菌剂中，在液体培养基中还加入以下三种成分中的任意二种杂鱼虾匀浆l 10g;酵母粉O. 5 2g;骨粉0. 5 2g。实施例9。实施例6所述的有机钾肥菌剂中，在液体培养基中还加入以下三种成分杂鱼虾匀浆l 10g;酵母粉0.5 2g;骨粉0. 5 2g。实施例10。 一种生物有机肥的生产方法，取实施例1-9任何一项所述的 有机钾肥菌剂中的步骤(2)所述的有机钾肥菌种剂加入基肥中，或者加入经 其他固氮菌、解磷菌、木霉菌和发酵菌发酵5天以上的有机肥基肥中，混匀， 发酵处理10天以上后，经干燥、制粒后即得生物有机肥。实施例ll。 一种生物有机肥的生产方法，取实施例1-4任何一项所述的 有机钾肥菌剂中的步骤(1)所述的耐盐性胶质芽孢杆菌在无氮培养基上活化 后，转接于实施例5-9任何一项中所述的液体培养基中培养，在25"C、通入 空气或者氧气的条件培养3天，得培养液，然后将培养液喷入基肥中，或者 喷入经其他固氮菌、解磷菌、木霉菌和发酵菌发酵5天以上的有机肥基肥中， 发酵处理10天以上后，经干燥、制粒后即得生物有机肥。实施例12。 一种生物有机肥的生产方法，取实施例1-4任何一项所述的 有机钾肥菌剂中的步骤(1)所述的耐盐性胶质芽孢杆菌在无氮培养基上活化 后，转接于实施例5-9任何一项中所述的液体培养基中培养，在30"C、通入 空气或者氧气的条件培养5天，得培养液，然后将培养液喷入基肥中，或者 喷入经其他固氮菌、解磷菌、木霉菌和发酵菌发酵5天以上的有机肥基肥中， 发酵处理10天以上后，经干燥、制粒后即得生物有机肥。实施例13。 一种生物有机肥的生产方法，取实施例1-4任何一项所述的 有机钾肥菌剂中的步骤(1)所述的耐盐性胶质芽孢杆菌在无氮培养基上活化 后，转接于实施例5-9任何一项中所述的液体培养基中培养，在28'C、通入 空气或者氧气的条件培养4天，得培养液，然后将培养液喷入基肥中，或者 喷入经其他固氮菌、解磷菌、木霉菌和发酵菌发酵5天以上的有机肥基肥中， 发酵处理10天以上后，经干燥、制粒后即得生物有机肥。
权利要求
1、一种有机钾肥菌剂，其特征在于，其制备方法如下(1)将胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)在无氮培养基上活化后，转接于抑制荚膜生长的液体培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体；用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释至106～108个/ml，得菌体悬浮液，将菌体悬浮液用辐射诱变或者化学诱变方法进行诱变，将诱变后的菌体悬浮液离心，获得诱变菌体；取诱变菌体进行筛选、复筛，获得耐盐性菌株；方法如下1)用筛选培养基悬浮诱变菌体，调整诱变菌体浓度至105～106个/ml，充分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔100～200μl；2)25～32℃培养5～7天，用分光光度计检测96孔培养板中的诱变菌吸光值，选取96孔培养板中的吸光值为0.2～0.5的诱变菌体进行复筛；3)将吸光值为0.2～0.5的诱变菌体稀释至102～103个/ml，取100～200μl诱变菌体稀释液涂布于复筛培养基平板上，25～32℃培养3～5天，重复3～5次，出现黄色晕圈菌落为目标菌落，将目标菌落在复筛培养平板上进行2～3次单菌落纯化后获得耐盐性胶质芽孢杆菌；(2)将耐盐性胶质芽孢杆菌在无氮培养基上活化后，转接液体培养基中培养，离心收集菌体，再加入等量的硅藻土、活性炭或者草木灰作吸附剂，低温干燥，即得有机钾肥菌种剂。
2、 根据权利要求1所述的有机钾肥菌剂，其特征在于，按照步骤(1)所 述的方法循环进行四 五级诱变、筛选、复筛，获得在不同浓度的海水 或者含钾卤水中保持活力的耐盐性胶质芽孢杆菌；其中一级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或者含钾卤水蒸馏水=1: 100;二级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 25;三级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 10;四级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 5;五级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为海水或 者含钾卤水蒸馏水=1: 1;一级诱变、二级诱变、三级诱变、四级诱变、五级诱变所产生的耐盐性胶质芽孢杆菌依次命名为HLS-1、 HLS-2、 HLS-3、 HLS-4、 HLS-5。
3、 根据权利要求1所述的有机钾肥菌剂，其特征在于，步骤(2)所述的 液体培养基由海水、海盐卤水或含钾卤水制备；所述的海盐卤水为海水 经蒸发浓縮，析出大部分NaCl后的卤水；所述的含钾卣水为盐湖卣水、 盐井卤水或者陆地矿产含钾卤水。
4、 根据权利要求1或2或3所述的有机钾肥菌剂，其特征在于，步骤(2) 所述的液体培养基为蔗糖5.0 10.0g，海水、海盐卤水或者含钾卤水 稀释液1000ml， pH7. 0 7. 5。
5、 根据权利要求4所述的有机钾肥菌剂，其特征在于，在液体培养基中还加入以下三种成分中的至少一种杂鱼虾匀浆1 10g;酵母粉O. 5 2g;骨粉0.5 2g。
6、 一种生物有机肥的生产方法，其特征在于，取权利要求1的步骤(2) 所述的有机钾肥菌种剂加入基肥中，或者加入经其他固氮菌、解磷菌、 木霉菌和发酵菌发酵5天以上的有机肥基肥中，混匀，发酵处理10天 以上后，经干燥、制粒后即得生物有机肥。
7、 一种生物有机肥的生产方法，其特征在于，取权利要求1的步骤(1)所述的耐盐性胶质芽孢杆菌在无氮培养基上活化后，转接于权利要求5 所述的液体培养基中培养，在25。C 30'C、通入空气或者氧气的条件培 养3 5天，得培养液，然后将培养液喷入基肥中，或者喷入经其他固 氮菌、解磷菌、木霉菌和发酵菌发酵5天以上的有机肥基肥中，发酵处 理10天以上后，经干燥、制粒后即得生物有机肥。
全文摘要
本发明是一种有机钾肥菌剂，其特征在于，其制备方法如下将耐盐性胶质芽孢杆菌在无氮培养基上活化后，转接液体培养基中培养，离心收集菌体，再加入等量的硅藻土、活性炭或者草木灰作吸附剂，低温干燥，即得有机钾肥菌种剂。本发明还步及生物有机肥的生产方法。本发明有机钾肥菌剂是通过采用海水或者卤水制备的培养基结合化学诱变或辐射诱变、定向诱变出可以适应一定浓度的海水和含钾卤水的耐盐性胶质芽孢杆菌制备而成，其含钾量较高，它可以作为生物有机肥直接施用于普通土壤和盐碱性土壤，促进植物对土壤和菌剂本身钾的吸收。也可以作为有机肥菌剂，生产有机钾肥和复合钾肥。
文档编号C12R1/07GK101608168SQ20091003169
公开日2009年12月23日 申请日期2009年6月24日 优先权日2009年6月24日
发明者温扶辉, 程昌林, 君 肖 申请人:君 肖