专利名称：：棉花抗病相关基因gbnbs及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及棉花抗病相关基因GBNBS及其应用，属于植物基因工程领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。
背景技术：
：真菌、细菌、病毒以及线虫引起的植物疾病为作物生产带来了毁灭性的影响。植物抗病基因(R基因)能够识别病原菌并引起过敏性反应(HR)，从而提高作物对病害的抗性。近年来已从不同植物中克隆出多个R基因。多数R基因具有NBS-LRR结构域，根据N端信号肽的不同，NBS-LRR基因可分为TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR两类(DanglJL,JonesJD:Plantpathogensandintegrateddefenceresponsestoinfection[J].Nature2001,411:826-833.)。虽然不同NBS-LRR基因之间核苷酸序列的差异较大，但是它们的氨基酸序列存在一些保守的结构域。根据这些保守的结构域已经获得很多抗性基因类似物(RGA)(LeisterD,BallvoraA,SalaminiF,etal.APCRbasedapproachforisolatingpathogenresistancegenesfrompotatowithpotentialforwideapplicationinplants[J].1996,NatGenet14:421-429.MagoR,NairS,MohanMResistancegeneanaloguesinrice:cloning,sequencingandmapping[J].TheorApplGenet,1999,9950-57)。高等植物的诱导性防卫反应是由一系列基因和信号分子参与的信号传递过程，这个过程主要可以分为三个阶段植物细胞对病原微生物的识别；胞内信号的转换和传递；防卫反应的开启和系统获得性抗性(SAR)的产生(Kombrink和Somssich，1995)。而NBS-LRR基因的结构特征可以使信号有效传递。NBS区是NBS-LRR基因最保守的部分，NBS结构域存在于许多ATP/GTP结合蛋白中，该结构域含有3个核心区域，包括kinasela即P-Ioof，kinase2a和kinase3a。一般认为，NBS中的基序如磷酸结合环(p-loop)为ATP/GTP的特异结合位点，ATP或GTP被NBS-LRR基因结合并水解，从而将胞外信号传递并且放大，并最终激活下游的效应基因并诱发植物的抗病反应。1-2和Mi-I是番茄的2个抗病和抗线虫基因，属于NBS-LRR基因家族，通过体外过滤结合分析发现，纯化的1-2蛋白特异性结合ATP，而P-Ioof突变体蛋白的结合能力则大大下降。薄层层析分析证明1-2和Mi-I都具有ATPase活性(TamelingW.I.L.,ElzingaS.D.J.,DarminP.S.,etal.TheTomatoRGeneProductsI_2andMi-IAreFunctionalATPBindingProteinswithATPaseActivity.ThePlantCell,2002(14)=2929-2939)LRR区域是R基因中保守性最低的一个区域，不同的R基因在LRR重复序列的数目、长度及排列上存在很大差异。LRR区域参与蛋白质与蛋白质的相互作用，尤其在分子识别过程中。LRR的这种结构特征对于病原信号的专一识别起到了至关重要的作用。R基因在植物体内表达量一般都比较低。一般认为，NBS-LRR类蛋白质的负调节子通过与LRR结构域作用稳定其分子结构，使之保持非激活状态，在这种状态下的NBS-LRR类蛋白质可能有极小的活性，不会对植物体造成伤害。而在植物体内超表达NBS-LRR类蛋白质(如Rx、RPMl和RPS2等)则会引起不依赖于病原物的超敏反应，严重的还会对细胞造成致死反应。如马铃薯Rx蛋白的LRR和NBS区域发生突变，这种突变造成Rx蛋白的组成性表达，在没有病原菌外壳蛋白存在的情况下，细胞组成性死亡(BendahmaneA，FarnhamG，MoffettP,etal.Constitutivegain-of-functionmutantsinanucleotidebindingsite—leucinerichrepeatproteinencodedattheRxlocusofpotato.ThePlantjournal,2002,32(2):195-204)。拟南芥的RPMl和RPS2基因可以特异性识别病原菌无毒蛋白并诱发超敏反应。这两个R蛋白有一个负调节因子RIN4，Mackey等认为通常情况下，植物中RIN4与RPS2结合并抑制其活性，RIN4是AvrRpt2的特异靶蛋白，当侵染发生后，RIN4被AvrRpt2降解，RPS2被激活，进而引发防御反应(MackeyD.，BelkhadirY.，AlonsoJ.M.，etal.ArabidopsisRIN4IsaTargetoftheTypeIIIVirulenceEffectorAvrRpt2andModulatesRPS2_MediatedResistance.2003，Cell,112:379_389.)。R基因编码的蛋白有2个作用，首先是识别来源于病原物的信号；第二是启动配套的植物防卫反应。这就决定了R基因在细胞中位置的特殊性，但是对于R基因的亚细胞定位研究很少。原来认为由于NBS-LRR蛋白缺乏跨膜区域或相关的信号肽，它们应该位于细胞质中。但是Boyesetal(1998)利用免疫细胞生化实验对NBS-LRR基因RPMl的研究结果却M^^^J—^vIIMSS(BoyesD.C.，NamJ,DanglJ.L.TheArabidopsisthalianaRPMldiseaseresistancegeneproductisaperipheralplasmamembraneproteinthatisdegradedcoincidentwiththehypersensitiveresponse.ProcNatlAcadSci,1998,95(26)；15849-15854)。R基因和avr基因识别后，引发过敏反应，同时通过信号传导途径诱导一系列抗病防卫反应基因表达，产生系统获得抗性(systemicacquiredresistance,SAR)。植物产生SAR后，抗病防卫反应中表达的基因主要是编码病程相关蛋白(pathogenesis-relatedproteins，PRs)和植保素合成相关酶基因。I3R蛋白在植物抗病性和系统获得抗性中起重要作用，有些I3R蛋白在体外就有抗菌活性。早期利用基因工程获得的抗病植株都为转防卫相关基因植株，如几丁质酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖氧化酶、天麻抗真菌蛋白、抗菌肽和脂质转运蛋白等，但是转化株的抗病能力提高有限，很难获得抗病植株，并不能大规模地应用于生产实践(吴家和，张献龙，罗晓丽.转几丁质酶和葡聚糖酶基因棉花的获得及其对黄萎病的抗性.遗传学报，2004，31(2)；程红梅，简桂良，倪万潮，杨红华，王志兴，孙文姬，张保龙，王晓峰，马存，贾士荣.转几丁质酶和β1，3—葡聚糖酶基因提高棉花对枯萎病和黄萎病的抗性.中国农业科学，2005，38(6)1160-116；MurraylF,LlewellynlD，McFaddenlH，JamesPeacock.ExpressionoftheTalaromycesflavusglucoseoxidasegeneincottonandtobaccoreducesfungalinfection,butisalsophytotoxic.MolecularBreeding5:219_232，1999；RajasekaranK，CaryJW,JaynesJM,ClevelandTE.Diseaseresistanceconferredbytheexpressionofageneencodingasyntheticpeptideintransgeniccotton(GossypiumhirsutumL.)plants.PlantBiotechnolJ.2005,3(6):545_554)。而利用R基因获得抗病植株效果则较为明显。Kawchuk等(2001)利用图位克隆从番茄抗黄萎病菌大丽轮枝菌材料中克隆了抗病基因Vel，Ve2，它们属于NBS-LRR基因家族。将这2个基因分别转入感病土豆中，转Vel和Ve2基因土豆表现为抗黄萎病，因此利用R基因提高抗黄萎病是可行的(KawchukLiHachey4J.LynchD.TomatoVediseaseresistancegenesencodecellsurface-likereceptors.PNAS，2001，98(11):6511_6515)。棉花是世界重要的经济作物。青枯病、枯萎病、黄萎病和根结线虫等棉花病害对棉花生产造成严重危害，降低棉花产量和品质。克隆抗性基因对研究棉花和病原菌互作、提高棉花抗病性具有重要意义。而海岛棉(Gossypiumbarbadense)对黄萎病、枯萎病的抗性较强，且受显性单基因或主效基因控制(房卫平，祝水金，季道藩。陆地棉和海岛棉的黄萎病抗性遗传研究.棉花学报，2003，15(1):327.)，因此，从海岛棉中分离R基因并创制基因工程抗病新种质是一个有效途径。但是由于遗传图谱的不饱和，通过图位克隆方法分离棉花R基因比较困难。RGA提供了另外一种研究抗病基因的途径。近年来很多与NBS结构域相关的棉花RGA已经分离并定位(HeLjDuC,CovaledaL，etal.Cloning,characterization,andevolutionoftheNBS-LRRencodingresistancegeneanaloguefamilyinpolyploidcotton(GossypiumhirsutumL.)[J].Mol.PlantMicrobeInteract.2004，17:1234-41)。然而，棉花NBS-LRR基因全序列的分离及功能研究目前还未见报道。本发明的发明人先前通过根据NBS-LRR蛋白的保守结构域，通过设计简并引物，从海岛棉中获得了棉花的NBS-LRR基因序列，并进而获得了该基因的全长序列，将其命名为GBNBS，其编码蛋白具有体外ATPase活性，亚细胞将其定位于细胞膜周。该基因在转基因植株中过量表达会造成转化株中防卫相关基因几丁质酶的表达量增加。GBNBS基因的研究分析深化了对棉花R基因的认知，并最终为获得抗病基因工程植株奠定基础。
发明内容技术问题本发明的目的是提供一个棉花抗病相关基因GBNBS，该基因编码一个CC-NBS-LRR蛋白，并且具有ATPase活性。该基因在细胞膜周表达。同时，该基因过量表达造成转化株中防卫相关基因几丁质酶的表达量增加。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病、抗虫性状。技术方案本发明提供了一个棉花抗病相关基因GBNBS，该基因来源于海岛棉(Gossypiumbarbadense)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列或部份DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为在0.lXSSPE(15mMNaCl,ImMNaH2PO4,0.ImMEDTA)、0.lXSSC(15mMNaCl，1.5mM柠檬酸钠)、0.SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，65°C条件下洗膜。序列表中的SEQIDNO.1由2842个碱基组成，自5，端第28位碱基为转录起始位点，记为+1；第2611位碱基为转录终止位点。完整编码框长度为2584个碱基，编码蛋白为861个氨基酸，分子量为93KD。GBNBS具有保守的P-L00F结构域，属于CC-NBS-LRR类蛋白。本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因任一片段的引物。本发明涉及棉花抗病相关基因GBNBS，该基因编码一个CC-NBS-LRR蛋白，通过原核表达分析发现，该基因编码的蛋白产物在体外具有ATPase活性。用洋葱表皮细胞瞬时表达发现该基因在细胞外表达。将GBNBS与35S启动子构建植物表达载体转化拟南芥植株，结果该基因过量表达造成转化株中防卫相关基因几丁质酶的表达量增加。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病、抗虫性状。GBNBS的功能研究可为揭示其表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于棉花抗病、抗虫基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。有益效果1.本发明获得了一个全新的棉花抗病相关基因GBNBS。棉花是世界重要的经济作物，棉花的真菌病害、细菌病害以及线虫都会造成产量减少以及品质下降。棉花抗病基因的克隆可以使我们更好地了解寄主与病原菌的互作并为基因工程改良奠定基础。目前为止获得的R基因中大部分都属于NBS-LRR类基因，但是棉花NBS-LRR基因全序列的分离及功能研究目前还未见报道。本发明获得的GBNBS基因是一个全新NBS-LRR类基因，在GENBANK中没有与其高度同源的相似基因。并且通过转化拟南芥分析，发现此基因的过量表达会造成转化株中防卫相关基因几丁质酶的表达量增加，说明该基因可以调控防卫基因的表达，是一个抗病相关基因。2.本发明证明了GBNBS具有ATPase活性。虽然从结构上分析，NBS-LRR基因中NBS的基序如磷酸结合环(p-loop)为ATP/GTP的特异结合位点，ATP或GTP可以被NBS-LRR基因结合并水解，从而将胞外信号传递并且放大，并最终激活下游的效应基因并诱发植物的抗病反应。但是相关的实验证明却进行的很少，本发明利用原核表达并纯化GBNBS蛋白，证明了该基因翻印的蛋白具有体外水解ATP的能力。3.本发明获得并证明了一个在细胞膜周表达的R基因。NBS-LRR基因要识别病原物或外界相关信号，并将该信号传递，所以其在细胞中的存在位置就显得极其重要。很多病原菌的Avr和相匹配的R蛋白都存在空间上的相互依赖性。由于NBS-LRR蛋白缺乏跨膜区域或相关的信号肽，一般认为它们应该位于细胞质中。但是Boyesetal(1998)利用免疫细胞生化实验对NBS-LRR基因RPMl的研究结果却显示其为一个膜周蛋白，并且是位于细胞质的这一面。本发明利用洋葱表皮细胞瞬时表达发现GBNBS基因位于膜周，进一步分析发现该基因特别是在胞间连丝处大量聚集，这在以前的研究中没有报道过。因此，该基因的亚细胞定位结果丰富了人们对于NBS-LRR基因的认知，并为更全面解释该类基因的抗病机制提供了实验基础。4.更好地了解抗病基因的作用机制及用于抗病育种。虽然目前有一些抗病基因被克隆出来，但是对抗性机制以及相关的信号通路的了解还不是很深入。对GBNBS基因的进一步研究分析深化了对R基因的认知，曾经对含有该基因的BAC克隆测序，发现该位点含有数个同源基因，是一个基因家族。GBNBS的系统研究为最终获得抗病基因工程植株奠定基石出。四图IGBNBS,RPP8(EEF33923.1)，RPMl(AAT09451.1)和NRCl(ABC26878.1)的氨基酸序列比较。图2GBNBS基因原核表达产物SDS-PAGE检测结果。20KD为空载体PET32C的诱导表达结果，60KD为含有去除LRR区部分基因序列载体NB⑶的诱导表达结果，90KD为含有基因全长载体PET3161的诱导表达结果.1,2,3为空载体PET32C分别诱导0h，4h和6h的表达结果；4，5，6为含有全长基因的融合表达载体P3161分别诱导0h，4h和6h的表达结果；7，8，9为去除LRR域部分基因的融合表达载体分别诱导0h，4h和6h的表达结果。图3原核表达产物的WesternBlot结果。图4GBNBS基因以及部分序列表达蛋白的功能分析。PET32(C)为没有插入片段的空白载体；P3161为含有GBNBS全长基因的融合表达载体；NBCD为含有去除LRR区域的部分基因序列的融合表达载体。图5GBNBS基因的亚细胞定位分析。图6GBNBS过量表达株的RT-PCR分析。NBS3，NBS4，NBS5，NBS6为GBNBS过量表达植株，CK为为转基因对照。Chitinase为几丁质酶基因，β-Tubulin为内参。五具体实施例方式下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成，所述百分含量均为质量百分含量。本实验所用的海岛棉(Gossypiumbarbadense)品种均为海7124(高玉龙，郭旺珍，王磊，张天真.海岛棉抗病基因类似物与防卫基因类似物的分离及特征分析.中国科学C辑，2006，36(2):97108)，拟南芥品种为哥伦比亚型(LinX,KaulS,RounsleyS,SheaTP,BenitoMI,TownCD,FujiiCY,MasonΤ,BowmanCL,BarnsteadΜ,FeldblyumTV,BuellCR,KetchumKA,LeeJ,RonningCM,KooHL,MoffatKS,CroninLA,ShenM,PaiG,VanAkenS,UmayamL,TallonLJ,GillJE,AdamsMD,CarreraAJ,CreasyTH,GoodmanHM,SomervilleCR,CopenhaverGP,PreussD,NiermanWC,White0,EisenJA,SalzbergSL,FraserCM,VenterJC.Sequenceandanalysisofchromosome2oftheplantArabidopsisthaliana.Nature1999;16;402(6763):761-8.)。棉花与拟南芥都在培养箱中生长。光照强度为130ymolphotonsHT2s-1,湿度为65%。(一)棉花GBNBS基因克隆以及序列分析根据水稻和烟草NBS结构域的P-Ioop和GLPL氨基酸保守区设计简并引物。引物序列为5‘-GGNGGNAT(T/C/A)GGIAA(A/G)ACIAC-3‘，5‘-NA(G/A)NGCIA(G/A)IGGIA(G/A)ICC。PCR扩增获得一500bp的双引物扩增条带，回收并送多个克隆测序。结果获得了多个含有NBS结构域的EST序列，且这些序列之间具有极高的同源性。选择其中一个EST用TailPCR和Race技术扩增全序列。N端特异性引物是5'-CCCATAGTTGAGTTTCTTCTACACCG-3'，5'-CTTCTCACCCAACTTCACATCGTC-3‘，5'-TATCAGTTCCGAAAGGATGGCT-3‘。C端特异性引物是5'-GGAAGCAGACTGTTATTAACTACTCGC-3‘，5'-TCAAAGAATGTGGCTTCACTGGC-3‘，5'-TTGATGATGAAGCAAGGTGGG-3‘,5'-GATTGACATTACAATGCAAACATTTCTC-3‘,5‘-CGAGACTCAAAGTGTTGGATTTAGGA-3‘,5‘-GTCCTTATTTAAGCAGTCTACCTCG-3‘.参照Paterson等的方法(PatersonAH,BrubakerCL,WendelJF.Arapidmethodforextractioncotton(Gossypiumspp.)GenomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolBiolRep1993,11:122-127.)提取棉花叶片的核基因组DNA。TAILPCR的方法参照(LiuY.G.，MitsukawaN.OosumiT.,WhittierR.F.PlantJ,1995,8:457_463·)进行。3'-RACE方法参照Clontech公司的SmartRacecDNAAmplificationKit进行。利用TAILPCR在5’端获得了一730bp的片段，序列分析发现其具有启始密码子ATG和部分5'UTR序列。利用TAILPCR在3'端获得了一570bp的片段，但是序列分析表明并没有达到基因的3'末端，根据此序列设计3'RACE引物并进行扩增，获得了一850bp的片段，BLAST分析发现其含有PolyA序列，说明已经到达基因的3'末端。根据拼接得到的序列设计特异引物5，gagtcgacgactaaaaagttaggga3，与UPM(CL0NTECH)配对用于扩增海岛棉cDNA，将扩增获得的片段测序后发现，该片段长为2842bp(SEQIDNO.1)，含有完整的开放阅读框，阅读框长为2584bp，5'UTR为27bp，编码蛋白含有861个氨基酸。将该基因命名为GBNBS。用DNAMAN进行序列比较分析，通过氨基酸序列比较，可以将GBNBS归为CC-NBS-LRR类型蛋白。GBNBS除NBS区域外，与已登录的R基因相似度都不高，相似度最高的蓖麻的RPPR8(登录号:EEF33923.1)，NRCl(登录号:ABC26878.1)相似度也只有27%。与RPMl(登录号AAT09451.1)的相似度为26%(图1)。(二)GBNBS基因原核表达载体的构建与表达产物的Western杂交分析GBNBS基因原核表达载体的构建与表达产物的功能分析方法参照Tamelingetal的方法进行(TamelingW.I.L.,ElzingaS.D.J.,DarminP.S.,etal.TheTomatoRGeneProductsI_2andMi-IAreFunctionalATPBindingProteinswithATPaseActivity.ThePlantCell,2002(14)=2929-2939)为了构建原核表达载体，以海岛棉cDNA为模板，分别构建GBNBS全长片段(约2600bp)以及去除LRR区域后的剩余片段(约2000bp)的融合表达载体。用基因特异引物SNsall582:GAGTCGACGACTAAAAAGTTAGGGAGGATGGAAG；Ansal4221CAGTCGACAGATGCCTTCAATAAAGAAGCCACTC扩增GBNBS基因全长。用引物SNsal1582:GAGTCGACGACTAAAAAGTTAGGGAGGATGGAAG；Antixhol368:CACTCGAGGCTTTTGACCTCATTGTGTCTTCTAT，扩增去除LRR区域片段的GBNBS基因部分序列。引物末端都含有限制性内切酶的识别位点。用相应的内切酶同时酶切扩增产物以及大肠杆菌表达载体PET32(C)(MERCK)，将酶切产物分别割胶回收，并将相对应的目的片段用T4LigaSe进行连接。连接产物转化原核表达专用菌株大肠杆菌BL21(大连宝生物公司)。PCR，酶切以及测序鉴定插入的目的片段。将含有GBNBS基因全长序列以及去除LRR区域片段的这两个融合表达载体分别命名为P3161和NBCD。取Iml含有GBNBS-His融合的表达载体的菌株转入IOOmL新鲜的LB培养基中，37°C培养约2h后，加入ImMIPTG诱导4h，6h。取l_2ml菌液SDS-PAGE电泳检测目的基因的表达情况，发现空白载体可以诱导出20KD的蛋白，而P3161和NBCD分别表达出90KD和60KD的蛋白，并且表达量随着诱导时间的增加而增加(图2)。这与预期大小都是一致的。Westernblot参照《分子克隆实验指南》进行。SDS-PAGE电泳结束后，通过湿转法将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜(罗氏)，封闭液用3%的BSA，一抗(His-TagMonoclonalAntibody,MERCK)稀释2000倍，将膜至于一抗稀释液中室温下孵育3_4h后，用用TBST在室温下脱色摇床上洗3-4次，每次lOmin，加入到适当体积的二抗(羊抗鼠IgG-HRP，天根生物)溶液中，室温室温下孵育3-4h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次lOmin。用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒(天根生物)进行显色。结果表明，出现了60KD和90KD两条明显的杂交信号，进一步说明表达出的条带就是目标蛋白(图3)。8(三)GBNBS基因原核表达产物的功能分析将构建好的融合表达载体P3161和NB⑶的菌液离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，发现表达蛋白位于包含体中。必须将包含体裂解并将目的蛋白复性才能获得有活性的目的蛋白。将IOOmL菌液离心，收集菌体并用一系列buffer洗涤包含体，具体步骤参照Tamelingetal(2002)的方法进行。用含有8M尿素的buffer溶解包含体。用特异性吸附His标签的镍柱将目的蛋白纯化，具体操作按照试剂盒说明书进行(Ni-NTAHis·BindResins，Merck，德国)。将用镍柱纯化后的目的蛋白用透析袋(上海生工)进行复性处理。将目的蛋白置于透析袋中，分别用含有6M，4M，2M,IM和OM尿素的缓冲液进行复性，每种浓度复性时间超过8h。将复性得到的蛋白做功能分析，具体操作参照试剂盒说明书进行(超微量ATP酶试剂盒，南京建成生物工程研究所购买)。样品分别为空载体PET32(C)(MERCK)，含有部分片段的NBCD和全长片段的P3161，反应时间分别为15min，30min，60min，并设置反应时间为Omin的对照。结果表明，反应时间为15minP3161的ATP酶活力为1.58U/mgprot,而NBCD活力仅为0.lU/mgprot；反应时间为30minP3161的ATP酶活力为1.63U/mgprot,而NBCD活力仅为0.66U/mgprot；反应时间为60minP3161的ATP酶活力为2.42U/mgprot,而NBCD活力仅为0.40U/mgprot(图4)。因此，GBNBS完整基因具有ATP酶活力，去除LRR区域的基因片段丧失了大部分酶活。(四)GNBS-YFP在洋葱表皮细胞瞬时表达构建35SGNBS-YFP表达载体对洋葱表皮细胞进行瞬时表达来检测GBNBS基因的亚细胞定位。洋葱表皮细胞瞬时表达参照Varagonaetal.(1992)进行。用引物xBFN56:5，GGTCTAGAAAAAGTTAGGGAGGATGGAAGC3，，RxbnM:5’GATCTAGAAAATGTATTTGGACTTCACATCG3’扩增海岛棉的cDNA。将PCR产物(SEQIDNO.1)和载体P35S-YFP(CL0NTECH)分别用XbaI进行酶切，回收相应的目的片段并用T4DNAIigase连接。DNA的金粉包埋按照BiolisticPDS-1000/HeParticleDeliverySystem的方法(XUSP,WEIZM.Introductiontomethodofmicroprojectilebombardmentanditsapplication.PlantPhysiologyCommunications,1998,34(1)41-43).具体操作为将洋葱表皮细胞剥离并放置在湿滤纸上，将约Iyg/μL的融合蛋白表达质粒5μL与50μL金粉(Bio-RAD，美国)悬浮液在悬浮状态下包被，同时依次加50μL2.5ΜCaC12,20yL0.IM亚精胺，离心，无水乙醇洗涤沉淀，重新悬浮沉淀于50μL无水乙醇中。利用基因枪(PDS-1000/HeBiolisticParticleDeliverySystem,Bio-Rad，加拿大)将包被质粒的金粉打进洋葱表皮细胞内，可裂膜压力为1.3kPa，28°C暗培养824h，先在莱卡激光共聚焦显微镜下压片寻找能激发荧光区域，然后在压片中用30%蔗糖溶液置换水，约35min后再放置在激光共聚焦显微镜下观察、摄像。结果表明，在细胞膜周围有一圈明显的荧光信号，因此确定GBNBS基因是一个膜周蛋白。进一步分析发现，荧光信号在胞间连丝处最强(图5)。胞间连丝(plasmodesma)是穿越细胞壁，连接相邻细胞原生质(体)的管状通道。胞间连丝运输的物质不仅包括一些诸如矿质离子、糖、氨基酸和有机酸等小分子物质，而且含有诸如蛋白质和核酸等大分子物质。另外，胞间连丝还是病毒侵染的必要通道。植物病毒需要从一个感染细胞移到邻近的细胞中，然后从一个感染器官转移到另一个器官。由于细胞壁是阻止病毒胞间移动的障碍，所以它必须借助胞间连丝从一个细胞移到另一个细胞，并利用韧皮部运输从一个器官到另一个器官。(五)构建GBNBS基因过量表达载体并转化拟南芥用HindIII-EcorI双酶切PWMlOl(南京助研生物)，获得的含有CaMV35S启动子片段与对应酶切过的PCAMBIA2301(CAMBIA)连接，构建成新的植物表达载体QVB。用含有SalI和XbaI内切酶识别位点的引物xBFN565'-GGTCTAGAAAAAGTTAGGGAGGATGGAAGC-3‘禾口Ansal42215'-CAGTCGACAGATGCCTTCAATAAAGAAGCCACTC-3‘扩增海岛棉的cDNA。获得的GBNBS基因序列与载体QVB分别用SalI和XbaI酶切，回收相应的目的片段并用T41igaSe连接。将以上获得的含有CaMV35S启动子和GBNBS基因片段连接获得重组载体，命名为QVB-35S-GBNBS，用冻融法将重组载体转化农杆菌LBA4404。用花浸染方法(CloughSJ，BentAF.Floraldip:ASimplifiedMethodforAgrobacterium-MediatedTransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ1998；16735-743)转化拟南芥，分单株收获拟南芥种子。将所有种子在含有40mg/L卡那霉素的MS培养基上进行筛选，挑选绿色植株移栽至营养土中生长。用PCR方法进一步检测转基因植株。收获转基因工程植株种子。将转基因工程植株种子播种于含有40mg/L卡那霉素的MS培养基。挑选绿色植株移栽至营养土中生长并用于基因功能以及特征研究。六拟南芥转化株中相关防卫基因的表达变化R基因和avr基因识别后，引发过敏反应，同时通过信号传导途径诱导一系列抗病防卫反应基因表达，产生系统获得抗性(systemicacquiredresistance，SAR)。植物产生SAR后，抗病防卫反应中表达的基因主要是编码病程相关蛋白(pathogenesis-relatedproteins,PRs)和植保素合成相关酶基因。所以R基因的过量表达往往会造成相应的防卫反应相关基因的上调表达。根据GenBank中拟南芥的几个防卫相关基因序列，设计引物PR1F5‘GGAGCTACGCAGAACAACTAAGA3‘，PRlR5‘CCCACGAGGATCATAGTTGCAACTGA3‘检测PRl基因(登录号At2gl4610)的表达情况；ChiF5‘CTACCACTACCATCATGGC3',ChiR5'GTGCTGTAGCCCATCCACCTG3'检测几丁质酶(登录号At3gl2500)的表达情况。根据β-Tubulin设计内参引物TubF:5'GAGGGAGCCATTGACAACATCTT3'，TubR5'GCGAACAGTTCACAGCTATGTTCA3'。用Trizol(invitrogen)提取拟南芥叶片总RNA，总RNA提取后用RQlDNAase(Promega，America)消化污染的DNA。用OligodT将各个器官的总RNA反转录成cDNA模板备用。电泳结果表明，PRl表达量在转基因植株中并没有明显上升，而几丁质酶表达量则明显增加(图6)。说明几丁质酶为GBNBS基因的下游防卫基因，GBNBS的过量表达可以有效地诱导抗病防卫基因的表达。序列表<110>江苏省农业科学院<120>棉花抗病相关基因GBNBS及其应用<130>说明书<140>00<141)2009-09-20<160>12<170>PatentInversion3.110tatttgaagttgaataatcctaatttgagcagtcttcctcgcatcttgttcagtctccctI8600097]aatttaatgacacttgatattaaaaacacttgtgttatacttccatgcttgcctagtggg19200098]atttggaaaatgcagaacttaaggcatcttttgttacctccacataccacgttgcctaaa19800099]tgtcctgatcatcaaactcgtttatggcatctacaaactctttcaacaataactcctaat20400100]gaggacactgcagcactcatctttggttctaagtttccgagcttgattaagttgacttta21000101]aatagtcaaaacatggagcagacaaagagatgtttggaatggctctacaagttggattgt21600102]taaagattatcaatccaactaagtttccaacagcaaggacatcattccca22200103]gcaagtcttgttaaggtaagcttggtgaaaaccgacctagttgctgatgatgtaatgaaa22800104]atgctggagtgtttggatcaccttcaggtcttgaaactgctaaaaaagtccattagggga23400105]cccaagctggaaatgacacccaactcatttcctcaactcagattccttttcatggaagaa24000106]atacttgttaaaacatggaggatgggtgatgaagccatgggcagccttgaagacttgacc24600107]attactcgttgccatgaactagaatcacttccaaagcagctttggcaactccataacata25200108]cgccaggtaaaggtgaattctccctctcaatgcttgagacgagagcttgagcaaccaagt25800109]gtgcagcgatgtgaagtccaaatacatttttgatgacaagaagagtggcttctttattga26400110]aggcatctaatcagtcaaattaatcatttttctaattttcttttttattttgtatgttat27000111]atcctgatatatattatcgaagagtggtttggattgtctacttaatttatctttgtttcg27600112]attatcaattaatcgaatagattttatacagcgatgaaaa28200113]&￡l￡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