专利名称：莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其表达方法和应用的制作方法
莫洛尼氏鼠白血病絲逆^^效錄其^ii^r棘应用
a^域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶 突变体及其表达方法和应用。
背f^
逆转录是逆转录病毒基因组RNA复制时，病毒RNA在逆转录酶催化下合 成DNA并整合到宿主细胞基因组中的过程。逆转录酶是此类病毒特有的酶类。 它行使了以下功能①依赖RNA或DNA为模板的DNA聚合作用；②链转 换作用；③降解RNA - DNA杂合体中RNA的RNase H功能。因此逆转录酶 常用于cDNA文库的构建。市场上莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus ,简称MMLV )逆转录酶的改造主要是针对酶的RNaseH部位 进行改造，以达到弱化对DNA-RNA杂和体中RNA的降解的功能。经过改 造后，这种酶可以逆转录出更长的单链DNA产物。由于MMLV逆转录酶在 合成DNA时会掺入错误碱基，造成了病毒基因组复制过程中的高突变率，因 此需要获得具有保真功能的逆转录酶。对逆转录酶进行改造需要保证的是需 要其行使功能的活性部位保持原有的活性和特性，需要弱化的活性部位在改造 的同时确保不影响其它功能的实行。理论上，天然酶存在很大的可变性及存在 着改进的潜力，如 一个由IOO个氨基酸组成的酶，拥有20100次方不同序列 的可能性，显然自然界是不可能存在所有序列相应的酶。同时，以如此庞大的 序列上的差异相应地必然会产生性质不同于现存的酶，也必然会存在某些方面的性质优越于天然的酶的新酶，这种序列上的可变性必然会体现在结构和功能 上。在了解催化机制的基础上，人为的提高酶的催化效率是分子酶学工程的主
要目标，并由此创造出高催化效率的经济实用的酶。过去20年，用定点突变 的技术，工程酶已经取得很大成绩，几乎所有结构与功能关系清楚的酶都被该 技术改进了。这是由于突变的定向性与取代残基的可选择性，对高级结构的干 扰性不影响或影响较小，检验手段的可靠性。这种方法可以明确指出酶分子中 的某个氨基酸残基是否参与底物结合和催化，把从其它方法得出的候选活性部 位的可疑氨基酸残基进一步验证，得出可信的结论。
目前现有的MMLV逆转录酶晶体结构包括非催化状态下含有DNA的全 长逆转录酶的晶体结构和催化状态下不含DNA的逆转录酶N端的晶体结构， 因此在基于结构和机制的酶改造方面有一定的困难。HIV-1逆转录酶的结构 研究较多，已有催化状态下含模板/引物、dNTP三重复合体的晶体结构。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种莫洛尼氏鼠白血病病毒逆 转录酶的突变体，同时提供了该突变体的制备方法及其应用。 为实现本发明的目的，采用如下技术方案
将莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶的自N端第196位脯氨酸残基取代为丙 氨酸的蛋白质。
所述莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体具有如SEQ ID N0:1所述的 氨基酸序列。
本发明提供的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体的编码基因具有如 SEQ ID NO:2所述的核苷酸序列。本发明的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体的方法是将含莫洛尼氏 鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，培养阳
性克隆，表达得到莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体。
上述含有莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的表达载体为
具有如SEQ ID NO: 2所述的核苷酸序列的质粒pET-28a。 所述大肠杆菌为_Escfc7'c/z/a co// BL21 。
本发明还保护含有莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的表 达载体及莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的宿主菌。
上述莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体可应用在RNA合成中。 本发明的另 一个目的是提供一种表达莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶的 突变体的方法。
本发明的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶改造所得到的逆转录酶的突变 体具有保真功能。
图1为^fe^^的错掺实验结果图； 图2为##^@交的4賴^延伸实1^吉果图。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应 理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例l:活性状态下含有模板-引物、 的MMLV逆转录酶结构模 型的构建及其结构分析构建含模板/引物及dNTP的结构模型目前现有的MMLV晶体结构包括含有 DNA的MMLV全长的晶体结构，此DNA远离催化位点，以及催化状态下不含 DNA的MMLV逆转录酶N端的晶体结构，因此在基于结构的酶功能改造方面有一 定的困难。HIV- l逆转录酶的结构研究较多，已有催化状态下含模板/引物、dNTP 三重复合体的晶体结构。MMLV逆转录酶和HIV-l逆转录酶的结构高度同源， 我们结合fflV - l逆转录酶三重复合体(包括酶、模板-引物、dNTP)的晶体结 构(PDB (protein data bank)号lrtd)和催化状态下MMLV逆转录酶N端的晶 体结构(PDB (protein data bank)号lmml)构建了活性状态下含有模板 - 引 物、dNTP的MMLV逆转录酶结构模型。具体方法如下将HIV-l逆转录酶的第 6、 9和10条(3折叠以及第E和F条a螺旋的Ca原子与MMLV逆转录酶的第7、 lO和ll 条(3折叠以及第H和I条a螺旋的Ca原子重叠。通过GROMOS 96进行能量最小化， 使HIV - l逆转录酶的Ca原子的催化羧基与MMLV逆转录酶对应位置羧基的均 方才艮(root mean square,简称r.m.s )偏离小于0.3A。采用Swiss-PdbViwer和Insight II分子模拟软件针对引物结合位点进行分析，模拟各类突变型逆转录酶，通过 AMBER 99力场分析进4亍迭代的最小化(iterative minimizations)直到能量变化 小于O.OOOl kcal/mol per A，预测第196位点氨基酸与MMLV逆转录酶保真性相 关。
实施例2:定存、^MMLV逆转录酶的196位脯氨酸(P)为丙氨酸(A) 定点突变MMLV逆转录酶(Genebank: AF033811 )的196位脯氨酸(P)
为丙氨酸(A)。采用融合PCR的方法进行。首先设计MMLV逆转录酶基因的
上下游引物RTUp和RTDown:
RTUp: 5， ATGCATATGACATGGCTGTCTGATTTT 3'RTDown: 5'ATTACTCGAGTTAGAGGAGGGTAGAGGTGTCTGGAGTC 3， 以及在突变位点设计引物196Up和196Down:
196Up 5 ，CCA CAG GGT TTC AAA AAC AGT GCC ACC CTG TTT 3' 196Down 5, AAA CAG GGT GGC ACT GTT TTT GAA ACC CTG TGG 3'
以RTUp和196Down作为引物，MMLV逆转录酶基因片段为模板扩增N 端DNA片段。然后以RTDown和196Up为引物扩增C端DNA片段。将PCR 扩增的N端和C端DNA片段分别回收后共同作为模板，同时利用RTup和 RTDown外向引物扩增突变的全长MMLV逆转录酶。
实施例3: MMLV逆转录酶突变体的表ii^化
克隆将MMLV突变型逆转录酶基因(P196A)纯化后用Nde I/Xho I酶 切后克隆到pET-28a载体中，使得MMLV逆转录酶基因后加入His标签，产 生pET-28a-RTP196A表达质粒。重组表达质粒经过测序鉴定正确。表达重 组表达质粒转化至在E co/z'BL21。挑取单菌落37 。C培养至OD600值为0.6 时，用0.2mMIPTG诱导3小时，4200 rpm离心35分钟，收集菌液，- 80 。C保存。纯化用含10 mM咪唑的緩冲液I ( 50 mM NaH2P04 (pH 7.8)， 5% 甘油，0.3MNaCl)悬浮菌液，加入溶菌酶至终浓度lmg/ml,冰上孵育30分钟 裂解。裂解菌液35,000 rpm离心40分钟。上清过镍柱(Ni-NTA columns),用 含20 mM咪唑的緩沖液I洗柱两次。再用含250 mM咪唑的緩冲液I洗脱蛋白， 收集蛋白，用滤器Amicon 30 centricons将緩沖液I更换成緩冲液II ( 200 mM NaCl， 50%甘油)。用Bradford法测定蛋白浓度。
实施例4: MMLV逆转录酶突变体的忠实性l定确定酶活性单位以poly(rA)-(dT)18为模板-引物，32P标记的dTTP为 底物进行反应。反应体系总体积为6pL,包括50 mM Tris HC1 (pH 8.0), 100 ^g/mL BSA， 5 mM MgCl2， 1 mM DTT， 50 mM KC1, 100nM模板-引物，100|tiM dTTP， 10 nM MMLV突变型逆转录酶和50pM 32P标记的dTTP (0.4 (iCi/nmol)。 反应在37 °C下孵育15min，加入6^iL上样緩冲液终止反应，反应物在90。C 加热5分钟后进行1.4°/。琼脂糖凝胶电泳，用X光片曝光。
单核苷酸的错掺以24bp的单链DNA, 5' GCA CCG GCG CTC GAA CAGGGA CTG 3，，为模板；以"P标记的21bp的单链DNA， 3' GGC CGC GAG CTTGTC CCT GAC5'，为引物，进行单核苷酸的错摻实验。反应体系为2.5 nM 才莫4反/引物，50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 1 mM DTT, 0.01% BSA， 60 mM KC1， 5 mMMgCl2，和500pMdATP，至总体积5pL。反应在25。C进行30 min后，加 入5pl上样緩沖液终止反应。反应物通过12%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后， 用X光片曝光。图1为单核苷酸的错掺的实验结果图，由图l可见，196突变 酶和野生型酶掺入错误碱基的能力相似。
3，单核香酸的错配后延伸以24bp的单链DNA， 5，GCACCG GCG CTC GAACAG GGA CTG 3，，为模板；以32P标记的21bp的单链DNA， 3,CGC CGC GAGCTTGTCCCTGAC5，为引物，进行单核苷酸的错配后延伸实验。反应体 系为2.5 nM模板/引物，50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 1 mM DTT, 0.01% BSA, 60 mM KC1， 5 mM MgCl2，和500 pM dATP或dTTP,至总体积5 pL。反应在25°C 进行30min后，加入5pl上样緩冲液终止反应。反应物通过12%的变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳后，用X光片曝光。图2显示为单核苷酸错配后延伸的实验结 果图，图2中，1、 2为野生型酶，3、 4为193突变酶，5、 6为196突变酶。以dATP为底物进行反应(1、 3、 5、)，或以观察dTTP为底物进行反应产物 (2、 4、 6、)。可以观察到错配后野生型酶可以一定程度延伸；193突变酶可 以继续延伸，因而可以在才莫板上插入突变；196突变酶几乎不能延伸，较难在 模板上插入突变。由此看来196突变酶比野生型具有更高的保真性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表
<120> 莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其表达方法和应用 < 170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 672 <212〉 PRT
<213 > Moloney Murine Leukemia Virus <400> 1
Thr Leu Asn lie Glu Asp Glu His Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu 15 10 15
Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gin Ala 20 25 30
Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gin Ala Pro Leu
35 40 45
lie lie Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser lie Lys Gin Tyr
50 55 60
Pro Met Ser Gin Glu Ala Arg Leu Gly He Lys Pro His lie Gin Arg 65 70 75 80
Leu Leu Asp Gin Gly lie Leu Val Pro Cys Gin Ser Pro Trp Asn Thr
85 90 95
Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val 100 105 110
Gin Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp lie His Pro Thr115 120 125
Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gin
130 135 140
Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu 145 150 155 160
His Pro Thr Ser Gin Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu
165 170 175
Met Gly lie Ser Gly Gin Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gin Gly Phe 180 185 190
Lys Asn Ser Ala Thr Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala
195 200 205
Asp Phe Arg lie Gin His Pro Asp Leu lie Leu Leu Gin Tyr Val Asp
210 215 220
Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gin Gin Gly Thr 225 230 235 240
Arg Ala Leu Leu Gin Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala
245 250 255
Lys Lys Ala Gin lie Cys Gin Lys Gin Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu 260 265 270
Leu Lys Glu Gly Gin Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val
275 280 285
Met Gly Gin Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gin Leu Arg Glu Phe Leu 290 295 300Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp lie Pro Gly Phe Ala Glu Met
305 310 315 320
Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Phe Asn Trp
325 330 335
Gly Pro Asp Gin Gin Lys Ala Tyr Gin Glu lie Lys Gin Ala Leu Leu 340 345 350
Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu
355 360 365
Phe Val Asp Glu Lys Gin Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gin Lys
370 375 380
Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp 385 390 395 400
Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala lie
405 410 415
Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gin Pro Leu 420 425 430
Val lie Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gin Pro Pro
435 440 445
Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gin Ala Leu Leu
450 455 460
Leu Asp Thr Asp Arg Val Gin Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn Pro 465 470 475 480
Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gin His Asn Cys Leu485 4卯 495
Asp lie Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp Gin 500 505 510
Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Tip Tyr Thr Asp Gly Ser Ser Leu
515 520 525
Leu Gin Glu Gly Gin Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr
530 535 540
Glu Val lie Tip Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gin Arg 545 550 555 560
Ala Glu Leu lie Ala Leu Thr Gin Ala Leu Lys Met Ala Glu Gly Lys
565 570 575
Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His 580 585 590
lie His Gly Glu lie Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu Gly
595 600 605
Lys Glu lie Lys Asn Lys Asp Glu lie Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu
610 615 620
Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser lie lie His Cys Pro Gly His Gin Lys 625 630 635 640
Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gin Ala Ala
645 650 655
Arg Lys Ala Ala lie Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu lie
660 665 670<120> 莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其表达方法和应用
< 170〉 Patentln version 3.2
<210> 2
<211> 2016
<212> DNA
<213> Moloney Murine Leukemia Virus
<400> 2
accctaaata tagaagatga gcatcggcta catgagacct caaaagagcc agatgtttct60
ctagggtcca catggctgtc tgattttcct caggcctggg cggaaaccgg gggcatggga120
ctggcsgttc gccaagctcc tctgatcata cctctg犯ag caacctctac ccccgtgtcc180
ataaaacaat accccatgtc acaagaagcc agactgggga tcaagcccca catacagaga240
ctgttggacc agggaatect ggtaccctgc cagtccccct ggaacEicgcc cctgcteccc300
gttaagaaac cagggactaa tgattatagg cctgtccagg atctgagaga agtcaacaag360
cgggtggaag acatccaccc caccgtgccc sacccttaca acctcttgag cgggctccca420
ccgtcccacc agtggtacac tgtgcttgat ttaaaggatg cctttttctg cctgagactc480
caccccacca gtcagcctct cttcgccttt gagtggagag atccagagat gggaatctca540
ggacaattga cctggaccag actcccacag ggtttcaaaa acagtgccac cctgtttgat600
gaggcactgc acagagacct agcagacttc cggatccagc acccagactt gatcctgcta660
cagtacgtgg atgacttact gctggccgcc acttctgagc tagactgcca acaaggtact720
cgggccctgt tacaaaccct agggaacctc gggtatcggg cctcggccaa gaaagcccaa780
atttgccaga aacaggtcaa gtatctgggg tatcttctaa aagagggtca gagatggctg840
actgaggcca gaaaagagac tgtgatgggg cagcctactc cgaagacccc tcgacaacta卯Oagggagttcc tagggacggc aggcttctgt cgcctctgga tccctgggtt tgcagaaatg 960
gcagccccct tgtaccctct caccaaaacg gggactctgt ttaattgggg cccagaccaa 1020
caaaaggcct atcaagaaat caagcaagct cttctaactg ccccagccct ggggttgcca 1080
gatttgacta agccctttga actctttgtc gacgagaagc agggctacgc caaaggtgtc 1140
ctaacgcaaa aactgggacc ttggcgtcgg ccggtggcct acctgtccaa aaagctagac 1200
ccagtagcag ctgggtggcc cccttgccta cggatggtag cagccattgc cgtactgaca 1260
aaggatgcag gcaagctaac catgggacag ccactagtca ttctggcccc ccatgcagta 1320
gaggcactag tcaaacaacc ccccgaccgc tggctttcca acgcccggat gactcactat 1380
caggccttgc ttttggacac ggaccgggtc cagttcggac cggtggtagc cctgaacccg 1440 gctacgctgc tcccactgcc tgaggaaggg ctgcaacaca actgccttga tatcctggcc 1500 g￡iagcccacg gaacccgacc cgacctaacg gaccagccgc tcccagacgc cgaccacacc 1560
tggtacacgg atggaagcag tctcttacaa gagggacagc gtaaggcggg agctgcggtg 1620 accaccgaga ccgaggtaat ctgggctaaa gccctgccag ccgggacatc cgctcagcgg 1680
gctgaactga tagcactcac ccaggcccta aagatggcag aaggtaagaa gctaaatgtt 1740
tatactgata gccgttatgc ttttgctact gcccatatcc atggagaaat atacagaagg 1800 cgtgggttgc tcacatcaga aggcaaagag atcaaaaata aagacgagat cttggcccta 1860 ctaaaagccc tctttctgcc caaaagactt agcataatcc attgtccagg acatcaaaag 1920 ggacacagcg ccgaggctag aggc犯ccgg atggctgacc aagcggcccg犯aggcagcc 1980 atcacagaga ctccagacac ctctaccctc ctcatEi 201权利要求
1、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，是将莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶的自N端第196位脯氨酸残基取代为丙氨酸的蛋白质。
2、 根据权利要求1所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征 在于，所述莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体具有如SEQ ID NO:l所述的 氨基 酸序列。
3、 权利要求1或2所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体的编码基因。
4、 根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因具有如 SEQ ID NO:2所述的核苷酸序列。
5、 一种表达权利要求1所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体的方 法，其特征在于，将含有权利要求1所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突 变体编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，培养阳性克隆，表达得到莫洛尼 氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含有权利要求l所述的 莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的表达载体为具有如SEQ ID NO: 2所述的核苷酸序列的质粒pET-28a。
7、 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为Esc/2en'cWa co// BL21。
8、 含有权利要求3或4所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码 基因的表达载体。
9、 含有权利要求3或4所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码 基因的宿主菌。
10、 权利要求1或2所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体在合成 RNA中的应用。
全文摘要
本发明提供一种莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶的突变体及其制备方法和应用。该突变体为将莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶的自N端第196位脯氨酸残基取代为丙氨酸的蛋白质。本发明的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体的方法是将含莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，培养阳性克隆，表达得到莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体。该突变体可应用在RNA合成中。本发明的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶改造所得到的逆转录酶的突变体具有保真功能。
文档编号C12N9/00GK101613680SQ200910036929
公开日2009年12月30日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月23日
发明者荣 周, 张芃伟, 涛 彭 申请人:广州华银医药科技有限公司;中国科学院广州生物医药与健康研究院