专利名称：水稻干尖线虫的检测方法及诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测或鉴定水稻干尖线虫的方法以及一种检测或鉴定水稻干尖 线虫的试剂盒。
背景技术：
水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi Christie)，又称贝西滑刃线虫，寄 主最主要是水稻，可引起水稻干尖或白尖病，全国各水稻产区都有发生，一般可造成减产 10% -20%，严重者可达30%以上。其还会引起草莓的夏矮病，受害草莓叶片皱缩畸形、植 株矮化、开花减少，产量大大降低。同时，该线虫也是玉米、甘薯、大豆、蔬菜、兰花、菊花、大 丽花等作物或花卉的重要病害，导致经济价值降低。水稻干尖线虫主要是种子带病传播，一旦侵入植株就难以用药剂防治，只能及时 拔除，集中烧毁，因此防治的主要措施是通过检疫进行隔绝。中国专利申请98111429. 6公开了一种采用二硫氰基甲烷或其盐类化合物，通过 浸种、拌种或种子包衣技术来防治水稻干尖线虫病、恶苗病、胡麻斑病、苗稻瘟病、大、小麦、 青稞和玉米等作物条纹病、坚黑穗病、腥黑穗病、网斑病、纹枯病的方法。中国专利申请200710158025. 4公开了具毒杀植物寄生线虫作用的真菌的培 养方法及其代谢物制备方法和应用，该申请所公开的木霉菌菌株Snef85为哈茨木霉 Trichoderma harzianum，其代谢产物对植物寄生线虫，特别是对南方根结线虫、水稻干尖 线虫和大豆胞囊线虫具有毒力高，杀线虫效果明显的突出特点。中国专利申请200810010465. X则公开了具毒杀植物线虫作用的链霉菌的培养方 法及其代谢物制备方法和应用，该申请所公开的链霉菌菌株Snea253为委内瑞拉链霉菌 Streptomyces venezuelae,其代谢产物对植物寄生线虫，特别是对大豆胞囊线虫、根结线 虫和水稻干尖线虫具有很高毒力。防治水稻干尖线虫的基础是首先对水稻干尖线虫进行检测。然而，到目前为止，针 对水稻干尖线虫的检测方法仍是传统的方法，其检测手段主要是用直接浸泡法或贝曼漏斗 法分离线虫，然后镜检，根据水稻干尖线虫的形态特征进行判断。这种方法存在一定的弊 端，主要表现在一、水稻干尖线虫属于滑刃线虫属，滑刃线虫种类繁多，通常鉴定的样品中 会有多种形态相似的线虫，这就要求鉴定者具有丰富的经验；二、线虫个体间存在差异，这 需要有足够的鉴定样本；三、形态学鉴定只适用于成虫，而对于幼虫不适用。因此，研究出对水稻干尖线虫快速、准确的检测方法实为必要。
发明内容
为克服上述缺陷，本发明的目的之一在于提供一种快速、准确地检测出水稻干尖 线虫的方法。本发明的另一目的在于提供水稻干尖线虫病诊断用试剂盒。为实现上述目的，本发明提供的水稻干尖线虫的检测方法包括(a)从可疑植物材料或土样中分离出待检测线虫，提取DNA ；
(b)以步骤(a)中获得的DNA为模板，使用SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2的引物， 进行聚合酶链式反应，得到扩增产物；(c)检测步骤(b)中获得的扩增产物，根据检测结果判断水稻干尖线虫的存在。优选地，步骤(C)中所述的检测的方法为电泳检测，更优选为琼脂糖凝胶电泳。通 过琼脂糖凝胶电泳可方便、快捷地检测出扩增产物中是否含有特异性扩增的片段，以及该 片段的大小。本发明的方法利用分子生物学原理，使用发明人设计的如序列表中所列的一对特异性引物，来扩增水稻干尖线虫的基因组DNA。如果待检测的线虫确为水稻干尖线虫，则通 过聚合酶链式反应(PCR)后可获得扩增的特异性片段，当电泳检测时，会显示出特异性条 带；如果待检测的线虫非水稻干尖线虫，则通过PCR后不能获得扩增的特异性片段，当电泳 检测时，就不会显示出特异性条带。因此，可通过电泳检测结果中是否出现特异性条带来判 断出待检测线虫是否为水稻干尖线虫。为更好地实现本发明，针对不同数量的线虫，其DNA提取方法可分为(1)当所述可疑植物材料或土样中存在大量线虫时，采用酚氯仿提取法(也称作 "Miniprep 法”)分离出 DNA0(2)当所述可疑植物材料或土样中存在单条线虫时，步骤(a)中所述的提取包括 以下步骤(i)将单条线虫加入含有WLB溶液的管中；(ii)于-70°C放置 30-60min ；95°C放置 15_20min ；55_65°C放置 2min ；(3)再加入蛋白酶K，55-65°C处理30min-2h ；95°C处理15_20min，以获得作为单条 线虫DNA模板的产物。优选地，上述植物材料是水稻植株或种子，或是草莓、玉米、甘薯、大豆、蔬菜、兰 花、菊花或大丽花的植株。另一方面，为了更方便地使用本发明的方法，本发明还提供了一种用于诊断水稻 干尖线虫病的试剂盒，其包含SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的引物对。本发明的方法适用于土样、种子和植株样品中水稻干尖线虫的快速检测和鉴定， 与现有方法相比，本发明的优点表现在(1)结果可靠通过对水稻干尖线虫的3个不同地理种群和菊花滑刃线虫 (A. ritzemabosi)、福建滑刃线虫(A. fujianensis)、拟滑刃线虫(Paraphelenchidea sp.)、 真滑刃线虫(Apelenchus sp.)、阿苏里伞滑刃线虫(Bursaphelenchus athuri)和松材线虫 (B. xylophilus)等线虫的测试验证表明，本发明的方法检测的结果具有极高的可靠性。(2)操作简便快速应用本发明方法，对线虫样本进行简单处理、PCR扩增和常规 的琼脂糖凝胶电泳后即可判定结果，一般整个检测过程可在4小时内完成。(3)检测灵敏度高利用本发明的引物对可扩增出单条水稻干尖线虫的幼虫或成 虫的特异性片段，因此本发明的方法灵敏度高、实用性强，可满足农作物种植前和植物检疫 过程中对水稻干尖线虫快速可靠的检测和鉴定需要。
图1显示的是利用本发明的引物对，对不同滑刃线虫的基因组DNA的PCR扩增的结果；图2显示的是利用本发明的引物对，对水稻干尖线虫的单条线虫基因组DNA的PCR扩增的结果；图3显示的是利用本发明的引物对，对3个不同水稻干尖线虫地理种群的单条线 虫基因组DNA的PCR扩增的结果。
具体实施例方式以下通过具体实验例来进一步详细描述本发明。本发明提供的水稻干尖线虫基因组DNA扩增引物序列如下所示5， -TCGATGAAGAACGCAGTGAATT-3，；5， -AGATCAAAAGCCAATCGAATCAT-3，上述引物可在水稻干尖线虫基因组DNA上特异性地扩增出312bp的产物。1. _十牛微-*軒4 触白■尉牛牛“曾试验步骤采用本领域技术人员熟知的酚氯仿法(Minipr印DNA提取法)，分别提 取水稻干尖线虫、菊花滑刃线虫、福建滑刃线虫，滑刃线虫种1(A. sp. 1)，滑刃线虫种2 (Α. sp. 2)，真滑刃线虫，拟滑刃线虫，阿苏里伞滑刃线虫和松材线虫的基因组DNA。提取方法 如下(1)将线虫收集到1.5mL离心管中，用与离心管配套的锥形研磨棒研磨成粉末，加入 700 μ 1 提取缓冲液(50mM Tris-HCl, ρΗ7· 5 ；50mM NaCl ；5mM EDTA, ρΗ8· 0 ；0. 5% SDS)禾口 7 μ 1的20mg/ml蛋白酶K，轻轻混勻；(2) 50°C水浴2_5h ； (3)加入等体积的Tris饱和酚，轻 轻混勻，12000rpm，4°C下离心lOmin，取上清液转入另一灭菌的1. 5ml离心管中；(4)加入等 体积的氯仿/异戊醇(24 1)，轻轻混勻，12000rpm，4°C下离心lOmin，取上清液转入另一 灭菌的1. 5ml离心管中；(5)加入1/10体积的3M/L醋酸钠(pH5. 2)和2. 5体积经预冷的 无水乙醇，轻轻混勻，放入_20°C冰箱中放置2h以上，过夜效果更好；(6) 12000rpm，4°C下离 心IOmin以沉淀DNA ； (7)沉淀物用75%的乙醇洗涤2次，待乙醇挥发完全后，将沉淀的DNA 溶解于 20 μ 1 TEdOmM Tris-HCl ρΗ8· 0，ImM EDTA)中；(7)任选地，取 1 μ 1 在 1. 0% 的琼 脂糖凝胶上粗略检测所提DNA的量和纯度。然后，按如下PCR反应体系和条件，使用本发明 的引物对对线虫样本进行PCR扩增PCR 反应体系25μ L，包括5ng 线虫 DNA，引物各 0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs，lXPCR 缓 冲液(包括2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反应条件预变性 94 °C 3min ；32 个循环的 94 °C 40s，57°C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16 °C 保存。将5 μ L PCR产物用1. O % (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色 后于紫外凝胶成像系统下显像。实验结果结果如图1所示，其中各泳道分别为M:DNA标记DL 2000 (Takara Biotech,大连，中国)(其条带大小由上至下分别对应为2000bp、1000bp、750bp、500bp、 250bp 和 IOObp) ；1 水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi) ；2 菊花滑刃线虫 (A. ritzemabosi) ；3 福建滑刃线虫(A. fujianensis) ；4 滑刃线虫种群 1 (A. sp. 1)； 5 滑刃线虫种群2 (A. sp. 2) ;6 拟滑刃线虫(Paraphelenchidea sp. ) ;7 真滑刃线 虫(Apelenchus sp.) ；8:阿苏里伞滑刃线虫(Bursaphelenchus athuri) ；9:松材线虫(B.xylophilus)。从图中可看出，只在水稻干尖线虫上扩增出特异性条带(对应于第1泳道)，经分析为312bp的产物。因此，可看出本发明的方法使用的引物对具有高度的特异性，从而保证了检测结 果的高准确性。2. 灵敏度实验－对单条水稻干尖线虫的扩增
实验步骤在解剖镜下分离出的单条成虫或幼虫，将其加入含有8 μ LffLB溶液 (2. 5mmol/L 二硫苏糖醇，1. 125%吐温 20,0. 25g/L 明胶，125mmol/L 氯化钾，3. 75mmol/L 氯 化镁，25mmol/L Tris-Cl (pH 8.3))的 PCR 管中，然后-70°C放置 45min ;95°C放置 15min ； 65°C放置2min ；再加入20mg/mL的蛋白酶K 1 μ L，65°C处理Ih ；95°C处理15min后，作为单 条线虫DNA模板直接用于PCR扩增。PCT反应体系和条件如下PCR反应体系25μ L，包括2μ L单条线虫裂解DNA，引物各0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs, IXPCR缓冲液(含2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反应条件预变性 94 °C 3min ；32 个循环的 94 °C 40s，57°C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16°C 保存；将5 μ L PCR产物用1. 0 % (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色 后于紫外凝胶成像系统下显像。实验结果结果如图2所示，其中泳道M :DNA标记DL 2000 (TakaraBiotech，大连， 中国)；泳道1-12为单条水稻干尖线虫裂解DNA扩增；泳道13 清水对照。从图中可看出， 实验泳道都扩增出特异性条带，经分析为312bp的产物，而对照组则没有特异性条带。因此，本发明的方法灵敏度非常高，即使单条水稻干尖幼虫亦能准确检测出，大大 方便了实际应用。3.可靠性实验_对水稻干尖线虫不同种群的单条线虫的扩增实验步骤对采集于福建、浙江和云南的水稻上的水稻干尖线虫的3个种群单条 线虫，按上述灵敏度实验中的方法裂解DNA，以进行PCR扩增。PCR反应体系和条件如下PCR反应体系25μ L，包括2μ L单条线虫裂解DNA，引物各0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs, IXPCR缓冲液(含2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反应条件预变性 94 °C 3min ；35 个循环的 94 °C 40s, 57 °C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16 °C 保存。将5 μ L PCR产物用1. 0 % (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色 后于紫外凝胶成像系统下显像。实验结果结果如图3所示，其中泳道M :DNA标记DL2000 (TakaraBiotech，大连， 中国)；泳道1-2 福建水稻干尖线虫裂解DNA扩增；泳道3-4 浙江水稻干尖线虫裂解DNA 扩增；泳道5 云南水稻干尖线虫裂解DNA扩增；泳道6 清水对照。从图中可看出，实验泳 道均显示出特异性条带，经分析对应大小为312bp，而对照组则未显示。因此，本发明的方法具有很高的可靠性，对于不同地区的水稻干尖线虫均能非常 灵敏地检测出。因而，本发明的方法适用范围广，不受局部地区的限制。另一方面，为更加方便地实施本发明的方法，本发明还提供一种用于诊断水稻干 尖线虫病的试剂盒，其包含如序列表中SEQ ID NO 1和SEQID NO 2所提供的引物对、PCR 反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和DNA提取液。
利用本发明提供的方法或试剂盒检测或鉴定水稻干尖线虫，具有很高的可靠性和 灵敏度，且操作方便，不依赖操作人员的经验，准确度高，实用性强，可满足农作物种植前和 植物检疫过程中对水稻干尖线虫快速可靠的检测和鉴定需要。虽然本发明只对水稻上的水稻干尖线虫的检测作出介绍，但本领域的技术人员在 阅读本发明的内容后，将容易地意识到，本发明的方法和试剂盒当然也可适用于任何感染 了水稻干尖线虫的植株或种子(例如，草莓等)的检测、鉴别或诊断。序列表<110> 崔汝强<120>水稻干尖线虫的检测方法及诊断试剂盒<160>2<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1tcgatgaaga acgcagtgaa tt<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2agatcaaaag ccaatcgaat cat
权利要求
一种检测水稻干尖线虫的方法，其包括(a)从可疑植物材料或土样中分离出待检测线虫，提取DNA；(b)以步骤(a)中获得的DNA为模板，使用SEQ ID NO1和SEQID NO2的引物对，进行聚合酶链式反应，得到扩增产物；(c)检测步骤(b)中获得的扩增产物，根据检测结果判断水稻干尖线虫的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述可疑植物材料或土样中存在大量线 虫时，采用酚氯仿提取法提取DNA。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述可疑植物材料或土样只存在单条线 虫时，步骤(a)中所述的提取包括以下步骤(1)将单条线虫加入含有WLB溶液的管中；(2)于_70°C 放置 30-60min ；95°C 放置 15_20min ；55-65 °C 放置 2min ；(3)再加入蛋白酶K，55-65°C处理30min-2h；95°C处理15_20min，以获得作为单条线虫 DNA模板的产物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物材料为水稻植株或种子。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物材料是草莓、玉米、甘薯、大豆、蔬 菜、兰花、菊花或大丽花的植株。
6 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述检测步骤(b)中获得的扩增 产物的方法为电泳检测。
7.一种用于诊断水稻干尖线虫病的试剂盒，其包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的引 物对。
全文摘要
本发明公开了一种水稻干尖线虫的检测方法，该方法使用序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2作为引物对，进行聚合酶链式反应，通过电泳分析可得知是否得到特异性片段，从而检测或鉴定出是否为水稻干尖线虫。本发明还提供了一种诊断水稻干尖线虫病的试剂盒，该试剂盒包含上述引物对。本发明的方法和试剂盒具有很高的可靠性和灵敏度，且操作方便，不依赖操作人员的经验，准确度高，实用性强，可满足农作物种植前和植物检疫过程中对水稻干尖线虫快速可靠的检测和鉴定需要。
文档编号C12Q1/68GK101812501SQ20091003729
公开日2010年8月25日 申请日期2009年2月20日 优先权日2009年2月20日
发明者卓侃, 孙晓棠, 崔汝强, 廖金铃, 王卫芳, 胡学难, 郭权, 钟国强 申请人:崔汝强