专利名称：一种大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞培养方法，尤其是一种大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法。
背景技术：
在心血管疾病机理通常认为是由于血管中膜的平滑肌细胞的增生和迁移引起的，因 此血管平滑肌细胞成为重要的研究对象。目前，牛、猪等大型动物动脉的平滑肌细胞的 培养方法的发展则已经较为成熟。由于动脉的管壁厚，弹性大，其内膜、中膜和外膜的 分界明显，通常采用机械刮除法分离动脉的内膜和中膜，即采用内膜剥离器或玻璃棒进 行内膜刮除。
腔静脉平滑肌细胞，是与远端肺动静脉平滑肌细胞进行对比研究，探寻肺循环相关 疾病、尤其是肺动脉高压及肺静脉高压等疾病发病机制的重要细胞材料。然而，目前腔 静脉的平滑肌培养方法的报道甚少，这是由于腔静脉管壁薄且柔软，弹性小，而其管壁 内膜较薄，中膜很不发达，仅为几层排列疏松的环形平滑肌，再者它的内膜和中膜分界 不明显，二者的分离极为困难。若同样采取机械刮除法分离，稍有不慎可能会将平滑肌 细胞也刮除，或者造成平滑肌细胞的损伤，降低细胞成活率及其质量；或者没有将内膜 完全去除，降低所得平滑肌细胞的纯度。再者，在研究中通常采用大鼠动物为材料，但 是大鼠心肺组织小，用常规分离牛、猪等大型动物动脉的方法来分离大鼠的腔静脉难度 较大、且不易成功，而且细胞成活率低、质量差。
另外，现有的培养方法在对中膜组织的消化处理的时间较长，通常在20分钟以上。 然而消化时间越长，消化液会对细胞造成的伤害越大，导致培养的细胞成活率大大降低。
因此，寻找一种高效、简便、纯度高、成本低的大鼠腔静脉平滑肌细胞培养方法显 得至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法。该方法操作简单、成 本低，而且培养得到的大鼠腔静脉平滑肌细胞纯度高。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 一种大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方 法，它包括以下步骤步骤l:从腔静脉组织中分离出中膜组织进行消化得到平滑肌细胞，并进行培养，获 取原代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞，
步骤2:获取传代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞，
其中，所述步骤l从腔静脉组织中分离出中膜组织的具体步骤为从腔静脉组织中 分离出中膜及内膜，放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中4°C静置20 30min，再放入 HBSS平衡溶液中，室温静置10 20min;然后取出翻转管壁，使内表面朝外，再密封管 腔；放入消化液中35 37'C消化3-5min，使内膜被消化脱落，去除内膜，得到中膜组 织。
本发明中所述步骤1平滑肌细胞的原代培养过程为a〉将中膜组织放入含氯化钙 的HBSS平衡盐溶液中室温静置5-10min，然后用消化液在35 37'C消化10 15min，至 组织块松软、边缘发毛，呈一定程度的破碎状；吸出消化液，加入混合培养基室温放置， 然后使之成细胞悬浮液，静置至组织块沉淀，吸出细胞悬浮液收集另存；再将原消化液 加入原离心管中，重复上述步骤进行再次消化和收集细胞悬浮液；合并细胞悬浮液；
b〉对细胞悬浮液进行离心，弃上清液；经PBS清洗后，加入混合培养基，使细胞 悬浮于培养基中，调整细胞密度并种植于培养板，置于37'C、 5%0)2培养箱内静置培养， 3-4天后换培养液，当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的 大鼠腔静脉平滑肌细胞。
所述步骤a〉中混合培养基的用量为3 6ml，室温放置2 5min;并依据组织消化的 情况，重复消化中膜组织及收集细胞操作2 4次。
所述步骤b〉中细胞密度为1 2Xl()5细胞/ml。以保持细胞生长有足够的空间、营养。
本发明所采用的消化液为含6. 9-7. lmg/ml I型胶原酶、0. 3 0. 5 mg/ml木瓜酶、 1. 9 2. 1 mg/ml牛血清白蛋白和0. 13 0. 15 mg/ml 二硫苏糖醇的HBSS平衡盐溶液。
所述的步骤2的具体操作是当原代细胞达到90%融合密度后，用PBS溶液清洗， 加入0. 1 0. 25%胰蛋白酶溶液35 37'C消化2 3分钟，当细胞出现回縮、细胞间隙 增大时，除去胰蛋白酶溶液，清洗细胞，加入混合培养液，使细胞悬浮于培养基中，然 后接种于另一培养瓶中进行培养，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的大鼠腔静 脉平滑肌细胞。
5所述的步骤2中的胰蛋白酶溶液的用量为0. 3 0. 5ml,胰蛋白酶溶液中含0. 02% EDTA(乙二胺四乙酸)；所述的细胞接种密度为1 2Xl()S个/ml。
本发明所采用的混合培养液为含95 105U/ml的青霉素、95 105U/ml的链霉素和 10 20%胎牛血清的低糖DMEM(Dulbcco's Modifed Eagle Medium)培养液。
本发明所采用的HBSS平衡盐溶液为7. 55-7. 70g氯化钠、0. 37-0. 39g氯化钾、 0.24-0.26g氯化镁、1.75-1.85g葡萄糖和2.23-2.25gHEPES (羟乙基哌嗪乙硫磺酸)， 用水定容至1L。
本发明所采用的含氯化钙的冊SS平衡盐溶液为所述的HBSS平衡盐溶液与1M氯 化钙溶液按体积比1:0. 00015-1:0. 00016配制而成。
本发明方法与现有技术相比具有以下有益效果
1、 本发明的中膜及内膜的分离采用密闭管腔消化法，使用消化液进行短时间消化
3-5min，使内膜脱落，从而选择性地消化去除内膜且不会损伤平滑肌细胞，得到的平滑 肌细胞纯度为95%以上。
2、 本发明采用含较高浓度的胶原酶的消化液，其活性增强，明显縮短了腔静脉中 膜组织的消化时间，减少了消化液对平滑肌细胞的损伤，进一步提供分离细胞的纯度， 并且同时提高了细胞质量和成活量。
3、 本发明提供的培养方法稳定性好，重复性好，培养的细胞纯度高达95%以上， 形态均一，生长良好，且具有典型的平滑肌细胞的形态及特点。为进一步与肺动静脉平 滑肌细胞对比研究肺循环相关疾病、小血管相关疾病，尤其是肺动脉高压及肺静脉高压 等疾病的发病机制奠定了条件，提供了丰富的对照实验材料来源。
图1是普通倒置相差显微镜(100X)下腔静脉平滑肌细胞；
图2是荧光显微镜(400X)下腔静脉平滑肌细胞，可见核胞浆中出现绿色的阳性荧 光反应，平滑肌细胞浆平滑肌a -Actin抗原发红色阳性荧光反应
图3是荧光显微镜(400X)下腔静脉平滑肌细胞浆平滑肌a -Actin抗原发红色阳性 荧光反应；
6图4是荧光显微镜(400X)下腔静脉平滑肌细胞核胞浆中出现绿色的阳性荧光反应。
具体实施例方式
下面结合实例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于 此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明 上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。 具体步骤
一、主要实验材料
(1) 动物来源大鼠可用6 8周龄(250 300g)的雄性SD大鼠。
(2) HBSS平衡盐溶液7.6g氯化钠、0.38g氯化钾、0. 25g氯化镁、1.8g葡萄糖 和2. 24gHEPES，用三蒸水定容至1L。实验前24小时配制并过滤除菌。
(3) 消化液含7fflg/ml I型胶原酶、0. 4 mg/ml木瓜酶、2 mg/ml牛血清白蛋白 和0. 15 mg/ml 二硫苏糖醇的HBSS平衡盐溶液。
(4) 混合培养液为含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和10%胎牛血清的 低糖DMEM培养液。
(5) 1. 5mM氯化钙的HBSS平衡盐溶液100ml的HBSS平衡盐溶液加入150 u 1的 1M氯化f丐溶液。
二、培养过程
1、获取原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞
a取大鼠心肺组织在外科显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜下小心分离腔静
脉；
b将血管放入冷的HBSS中以洗去血污，于显微镜观察下用显微镊和显微剪刀小心 剥离血管外膜；
c将中膜和内膜放入1.5 mM含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中在4r下浸泡20min， 然后放入HBSS平衡盐溶液中，室温下浸泡10min;
d用显微外科镊小心翻转管壁，使内表面朝外，用小动脉夹夹紧切缘两端，使管腔 密封；再放入消化液中37。C消化3-5min，使内膜被消化脱落，去除内膜；e取出中膜组织，将其放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中室温静置5-10min，去除
动脉夹后置于离心管中，用消化液在37'C消化中膜组织10 15min，可见组织块松软、
边缘发毛，呈一定程度的破碎状；
f轻轻吸出消化液，加入混合培养基5 ml，室温放置3min，用广口巴氏吸管吹打
数次，可见液体中有絮状物，即形成细胞悬浮液；
g静置片刻使组织块沉淀于离心管底部，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中。原 消化液加回组织块中继续消化5min，按上述步骤收集细胞，再重复5min消化操作1次， 合并细胞悬浮液；
h将收集的细胞悬浮液离心(800rpm， 3min)，吸除上清液，加PBS清洗1次并 500r/min离心5min，吸除上清液，再加入混合培养液调整细胞密度以2Xl()5细胞/ml 的密度种植于6孔培养板中(其中2孔放入盖玻片，鉴定时用)。置37。C、 5%0)2培养箱 内静置培养，3-4天后换培养液。当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获 得原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞。
2、 获取传代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞
当原代细胞生长密度达90%后，即可传代。届时，用2mlPBS溶液清洗细胞3次，加 入0. 5ml 0. 25% (m/v)胰蛋白酶溶液(含0. 02%EDTA) 37。C消化3分钟，当细胞出现回 縮、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，用2mlPBS溶液清洗细胞3次，加入5ml混 合培养液，轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬浮液，以2Xl()5个/ml的细胞密度 接种于新的培养瓶中，置于37。C、 5%二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞 生长至对数生长期，获得传代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞。
3、 培养结果
(1)倒置相差显微镜下观察，刚种植的细胞呈圆形、透亮、单个均匀分布。原代培 养的大鼠腔静脉平滑肌细胞生长2-3天左右可见部分细胞贴壁、展开细胞形态多样，呈 棱形、多角形、星形或不规则形，大小略有差异；胞浆丰富；胞核多为卵圆形多数细胞 为单核，少数细胞有双核或三核，有一个或多个核仁。4-6天后细胞数量明显增多呈积 聚性生长，细胞间常有突起相连。7-10天细胞生长达到对数期生长，部分区域细胞重叠 堆积生长形成"峰"，"峰"与"峰"之间细胞层数渐少，形成"谷"。当细胞生长至 融汇后，细胞间相互平行排列成束，高低起伏，形成典型的平滑肌细胞生长特征"峰" "谷"状生长。(2)倒置相差显微镜下观察，传代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞(图1)。细胞生长 速度较原代培养细胞明显加快。传代后2天细胞贴壁、展开可见细胞呈棱形、多角形、 星形或不规则形，4天后细胞数量明显增多呈积聚性生长，细胞间常有突起相连。7天 后细胞生长至融汇，形成典型的平滑肌细胞生长特征"峰""谷"状生长。原代培养的 细胞与传代细胞形态一致。
(3)平滑肌a-Actin抗原的免疫荧光检测采用平滑肌a-Actin单克隆抗体对 培养的细胞进行鉴定，并采用国际常用的复染法进行染色，用Yo-pro I对所有细胞核进 行染色，保证细胞纯度计算的可靠性。在荧光显微镜下观察，可见Cy3标记的细胞浆平 滑肌a-Actin抗原发红色荧光，Yo-proI标记的细胞核发绿色荧光(图2)。高倍镜下观 察，平滑肌细胞胞浆中的肌丝平行于细胞长轴呈细丝状表达(图3)。阴性对照无加一 抗，仅检测到Yo-pro I标记的细胞核没有检测Cy3标记的平滑肌a -Actin，所以仅见发 绿色荧光(图4)。低倍镜计算细胞纯度，每张片随机取5个视野，每个视野至少检测 200个细胞。计算每个视野中a-Actin表达阳性细胞占该视野总细胞数的比例，为平滑 肌细胞纯度平均达95%以上。
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权利要求
1、一种大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，它包括以下步骤步骤1从腔静脉组织中分离出中膜组织进行消化得到平滑肌细胞，并进行培养，获取原代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞，步骤2获取传代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞，其特征是，所述步骤1从腔静脉组织中分离出中膜组织的具体过程为从腔静脉组织中分离出中膜及内膜，放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中4℃静置20～30min，再放入HBSS平衡溶液中，室温静置10～20min；然后取出翻转管壁，使内表面朝外，密封管腔；放入消化液中35～37℃消化3-5min，使内膜被消化脱落，去除内膜，得到中膜组织。
2、 根据权利要求1所述的大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所述步 骤1平滑肌细胞的原代培养过程为a>将中膜组织放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中室温静置5-10^in，然后用消化 液在35 37'C消化10 15min，吸出消化液，加入混合培养基室温放置，然后使之成细 胞悬浮液，静置至组织块沉淀，吸出细胞悬浮液收集另存；再将原消化液加入原离心管 中，重复上述步骤进行再次消化和收集细胞悬浮液；合并细胞悬浮液；b>对细胞悬浮液进行离心，弃上清液；经PBS清洗后，加入混合培养基，使细胞 悬浮于培养基中，调整细胞密度并种植于培养板，置于37X:、 5%0)2培养箱内静置培养， 3-4天后换培养液，当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的 大鼠腔静脉平滑肌细胞。
3、 根据权利要求2所述的大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所述步 骤a〉中混合培养基的用量为3 6ml，室温放置2 5min;重复消化中膜组织及收集细胞 操作2 4次。
4、 根据权利要求3所述的大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所述步 骤b〉中细胞密度为1 2Xl()5细胞/ml。
5、 根据权利要求1或2所述的大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所 述的消化液为含6. 9-7. lmg/ml I型胶原酶、0. 3 0. 5 mg/ml木瓜酶、1. 9 2. 1 mg/ml 牛血清白蛋白和0. 13 0. 15 mg/ml 二硫苏糖醇的HBSS平衡盐溶液。
6、 根据权利要求1所述的大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所述的 步骤2的具体操作是当原代细胞达到90%融合密度后，用PBS溶液清洗，加入0. l 0.25%胰蛋白酶溶液35 37匸消化2 3分钟，除去胰蛋白酶溶液，清洗细胞，加入混 合培养液，使细胞悬浮于培养基中，然后接种于另一培养瓶中进行培养，至细胞生长至 对数生长期，获得传代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞。
7、 根据权利要求6所述的大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所述的 步骤2中的胰蛋白酶溶液的用量为0. 3 0. 5ml，胰蛋白酶溶液中含0. 02%EDTA;所述 的细胞接种密度为1 2X105个/ml。
8、 根据权利要求2或3或6所述的大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是， 所述的混合培养液为含95 105U/ml的青霉素、95 105U/ml的链霉素和10 20%胎牛 血清的低糖DMEM培养液。
9、 根据权利要求1或2所述的大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所 述的HBSS平衡盐溶液为7.55-7.70g氯化钠、0. 37-0. 39g氯化钾、 24-0. 26g氯化 镁、1.75-L85g葡萄糖和2. 23-2. 25g HEPES，用水定容至1L。
10、 根据权利要求1或2所述的大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所 述的含氯化钙的HBSS平衡盐溶液为权利要求1所述的HBSS平衡盐溶液与1M氯化钙 溶液按体积比1:0.00015-1:0. 00016配制而成。
全文摘要
本发明公开了一种大鼠腔静脉平滑肌细胞的培养方法，它包括以下步骤步骤1从腔静脉组织中分离出中膜组织进行消化得到平滑肌细胞，并进行培养，获取原代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞；步骤2获取传代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞；其中，所述步骤1从腔静脉组织中分离出中膜组织的具体步骤为从腔静脉组织中分离出中膜及内膜，放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中4℃静置20～30min，再放入HBSS平衡溶液中，室温静置10～20min；然后取出翻转管壁，使内表面朝外，再密封管腔；放入消化液中35～37℃消化3-5min，使内膜被消化脱落，去除内膜，得到中膜组织。本发明提供的培养方法稳定性好，重复性好，培养的细胞纯度高，形态均一，生长良好，且具有典型的平滑肌细胞的形态及特点。
文档编号C12N5/06GK101492653SQ20091003742
公开日2009年7月29日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月26日
发明者万丽梅, 冉丕鑫, 卢文菊, 健 王, 艳 田, 宁 赖, 陈新宇, 陈豫钦 申请人:广州医学院