专利名称：一种提取芹菜中celⅰ核酸酶的方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，具体涉及酶的制备。
背景技术：
CEL I核酸酶是一种单链特异性核酸酶(single-strand specific nuclease),其等电点为6.0~6.5，分子量大小为43kDa，催化活性需要Mg^和Zi^+的参与，属于S1核酸内切酶家族中的一种。CELI核酸酶是目前生物界发现的唯一能准确切割异源双链DNA中存在错配位点的酶，在遗传学研究和应用领域中扮演重要的角色，具有广阔的应用前景。
目前，CELI核酸酶的获取途径主要是从芹菜中提取。Oleykowski等人与1998年首先报道了一种从芹菜中提取CEL I核酸酶的方法，该方法方法如下首先通过连续硫酸铵沉淀，
然后经刀豆体球蛋白A-琼脂糖柱提取(用
-￡1+-甘露糖蛋白洗脱)，磷酸纤维素柱吸附(用
线性梯度的氯化钾洗脱)，最后用尺寸排阻色谱法分级分离得到CELI核酸酶。该方法需要经过多次沉淀提取、离子交换层析和凝胶过滤以及反复超高速离心，导致单位时间内的产出率很低。另外，该方法的总产率也很低，约含350g蛋白的7kg芹菜茎仅能提取得到浓度为0.1pg/nL的CELI核酸酶3ml (Nucleic Acides Res， 26， 4597-4602， 1998)。
随后，Yang等人对上述方法进行了改进(PCT/US01/05502)，采用a-甲基甘露糖苷来克服CEL I核酸酶与内源性选择素发生聚集反应的问题，从105kg芹菜所得的粗酶液中提取得到0.5mL纯酶，比酶活力由原来的x102 U/mg升至3.1xl07 U/mg，但是总酶活则从原来的1.9x107 U减至3.1x105 U,回收率仅为1.63%。但是该方法同样不能避免多次沉淀提取、离子交换层析和凝胶过滤以及反复超高速离心等操作，且提取率也不高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提高从芹菜中提取CELI核酸酶的效率。本发明解决上述问题的技术方案是；
一种提取芹菜中CELI核酸酶的方法，该方法由以下步骤组成
(1) 称取芹菜，每lkg芹菜加入80 120ml缓冲液A，捣成匀浆，压榨出液体，过滤，用lM的Tris溶液调节pH至8.0左右，得粗酶液；
(2) 将粗酶液在45 50 。C下保温15 20 min，然后3000Xg 5000Xg离心20 40 min，取上清液；
(3) 加入硫酸铵粉末至饱和度为25%， 3000Xg 5000Xg离心20 40 min，收集上清
液；所得上清液中加入硫酸铵粉末至饱和度为80%， 3000Xg 5000Xg离心20 40min，收集沉淀物；
(4) 将所得沉淀物用缓冲液B溶解，透析脱盐；
(5) 加入刀豆凝集素，混匀，4 10 'C下搅拌6 16小时使CEL I核酸酶与刀豆凝集素充分结合，然后静置20 60min;
(6) 抽滤去清液，在滤渣中加入缓冲液C溶解出CELI核酸酶，超滤浓縮。在4 1(TC条件下，上DEAE—Sepharose FF，然后依次用洗脱液D和洗脱液E各500 ml以0.5 1 ml/min的流速进行梯度洗脱；
(7) 收集洗脱液，用RF-INicking方法检测各收集管中的CELI核酸酶活力，合并酶活力在3 x 107 U/mg蛋白的洗脱液；
上述步骤中，所述缓冲液A由以下方法制备得到在pH8.0的0.1 MTris-HCl缓冲液中添加N2S03和苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)至浓度分别为0.01M和ImM;所述缓冲液B由以下方法制备得到在pH8.0的0.1 M Tris-HCl缓冲液中添加苯甲基磺酰氟至浓度为ImM;所述缓冲液C由以下方法制备得到在pH8.0的50 mM Tris-HCl缓冲液中添加甲基甘露糖苷和Triton X-100至浓度分别为30 mM和0.01%;所述洗脱液D由以下方法制备得到在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中添加甲基甘露糖苷、Triton X-100和KC1至浓度分别为10 mM、 0.01%和10 mM;所述洗脱液E由以下方法制备得到在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中添加甲基甘露糖苷、Triton X-100和KC1至浓度分别为10 mM、 0.01%和0.5M。
本发明方法在抽提液中采用添加少量亚硫酸钠减少和清除提取液中有色物质；采用热变性的物理方法，快速清除大量耐温性差的杂蛋白；利用CEL I是糖蛋白能与活化的刀豆凝集素结合的特点，使CELI核酸酶与刀豆凝集素结合除去其他杂蛋白，使CELI得到进一步的的纯化；最后选择DEAE-Sepharose FF作为适宜介质进行一次层析纯化出CEL I。综上，本发明方法抛弃了现有方法中的多次高速或超速离心以及多次凝胶过滤和离子交换层析的手段，采用合适的物理化学方法达到快速将CELI核酸酶从芹菜中提取出来并纯化的目的。
本发明方法提取CEL I核酸酶的效率较高，每100千克芹菜经步骤1后可得总粗酶活力1.81xl07，比活9.5xl02 U/mg蛋白的粗酶液，继续经步骤(2) (7)分离纯化后可得纯的CELI核酸酶1.545xl06 1.895xl06U，酶活回收率达到8.54 10.47%;所得酶的纯度达电泳纯，酶比活可达3xl07 U/mg蛋白。本发明方法与经典的Yang等人的方法相比，所得酶的纯度及比活没明显差异，但回收率提高了5倍以上。附图说
图1是本发明方法提取核酸酶CELI的SDS—PAGE图。图2是本发明方法提取核酸酶CEL I的酶切鉴定图。
具体实施方式
例l
1、制备
称取市场上购买的西芹(即西洋芹菜)100千克，去掉叶片，加入缓冲液A8L，捣成匀浆，搾出滤液74L。用1M Tris水溶液液调整滤液的pH至8.0 (Tris液用量为7.5 L)，然后在50。C条件下保温20分钟后置于冰水中冷却；5000Xg离心40分钟，去掉残渣，取上清液;一边搅动一边缓慢加入硫酸铵粉末(每升约加入144g)至25。/。的饱和度，5000Xg离心40min，去掉沉淀，收集上清液， 一边搅拌一边加入硫酸铵粉末至80%的饱和度(每升约加入390g)，在5000Xg条件下离心40min，去掉上清液，保留沉淀。沉淀溶于8 L缓冲液B中，用同样的Tris缓冲液透析脱盐。脱盐后溶液加入刀豆凝集素200ml (已活化，且用缓冲液B平衡)，4'C下搅拌过夜，使酶与刀豆凝集素充分结合。静置1小时，用抽滤漏斗去掉清液，加入缓冲液C300ml (分5次进行)，充分混匀，使酶溶于缓冲液中，过滤；滤液使用超滤膜浓縮(分子量截留10000道尔顿)至30 ml，上DEAE—Se'pharose FF柱(30 mmX400 mm)，以缓冲溶液D和E各500 ml作洗脱液，采用TH-500梯度混合仪(上海沪西分析仪器厂生产)进行梯度洗脱，洗脱流速为0.5 ml/min,每8 min收集一管洗脱液；用RF-I Nicking方法检测CELI活力高峰管，再用SDS-聚丙烯凝胶电泳法检测其蛋白纯度，之后合并蛋白为单一条带的活力高峰管酶液，此洗脱液即为CELI核酸酶蛋白洗脱液，共获得酶液20ml。
2、鉴定
(1) 所得酶液用SDS—PAGE检测，在4.3kDa处可见一蛋白条带，说明所得酶液应为CELI核酸酶，纯度达电泳纯(见图l)。
(2) 蛋白质含量分析按考马斯亮蓝法测定。其原理是考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内(0 100ug/ml)，蛋白质一色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。
(3) 所得酶液采用RF-I Nicking方法测定酶活。该方法以pUC 19为底物，用不同浓度的酶液切割，切割产物经电泳后用Gel-PRO Analyzer凝胶定量分析软件分析RF I、 RP II和RF III各区带荧光强度响应值。如图2所示，栏1为Lambda DNA/Hind IIIDNA分子量标样，栏2为RFI形式的pUC19质粒对照，用2 pl水代替酶液；栏3~7分别为反应体系中加入2 pl不同浓度的CEL I提取酶液。由于在一定酶浓度范围内区带的荧光强度与酶活性线性相关，利用公式I计算得出CELI核酸酶的比活。
酶活力(U/mg) =w(ri+2xr2-A:)x^xi...................................................I
/ v
结果计算结果，所提取酶液每毫升含蛋白3.158 P g、酶活力为94750 U，酶的比活为3.032Xl(^U/mg蛋白；20ml提取液中酶的总活力1.895X 106U， CELI核酸酶回收率达到10.47%。
例2
称取市场上购买的本芹(即中国芹菜)IOO千克，去掉叶片，加入缓冲液A12L，捣成匀浆，榨出滤液77 L。用1M Tris水溶液液调整滤液的pH至8.0 (Tris液用量为7.3 L)，然后在50'C条件下保温15分钟后置于冰水中冷却；3000Xg离心20分钟，去掉残渣，取上清液； 一边搅动一边缓慢加入硫酸铵粉末(每升约加入144g)至25%的饱和度，3000Xg离心20min，去掉沉淀，收集上清液， 一边搅拌一边加入硫酸铵粉末至80%的饱和度(每升约加入390g)，在3000Xg条件下离心20min，去掉上清液，保留沉淀。沉淀溶于8.2 L缓冲液B中，用缓冲液B透析脱盐。脱盐后溶液加入刀豆凝集素200ml (所用刀豆凝集素已活化，且用缓冲液B平衡)，4'C下搅拌过夜，使酶与刀豆凝集素充分结合。静置20分钟，用抽滤漏斗去掉清液，加入缓冲液C280ml (分7次进行)，充分混匀，使酶溶于缓冲液中，过滤；滤液使用超滤膜浓縮(分子量截留10000道尔顿)至30 ml，上DEAE—Sepharose FF柱柱场为30mm (直径)X400mm (高)，采用TH-500梯度混合仪(上海沪西分析仪器厂生产)进行梯度洗脱，洗脱流速为1 ml/min，每8 min收集一管洗脱液；用RF-I Nicking方法检测CEL I活力高峰管，再用SDS-聚丙烯凝胶电泳法检测其蛋白纯度，之后合并蛋白为单一条带的活力高峰管酶液，此洗脱液即为CELI核酸酶蛋白洗脱液，共获得酶液24ml。按例1方法检测，每毫升酶液含蛋白2.138 yg、酶活力为64400 U，酶的比活力为3.01 X 107; 24ml提取液酶的总活力为1.545xl06U， CELI核酸酶回收率为8.54%。用SDS—PAGE检测，达电泳纯核酸酶CELI。
例3
称取市场上购买的西芹100千克，去掉叶片，加入缓冲液A10L，捣成匀浆，榨出滤液。用lMTris水溶液调整滤液到pH至8.0，然后在5(TC下保温18分钟后置于冰水中冷却；4000Xg离心30分钟，去掉残渣，取上清液； 一边搅动一边缓慢加入硫酸铵粉末至25%的饱和度，4000Xg离心30min,收集上清液， 一边搅拌一边加入硫酸铵粉末至80%的饱和度，在4000Xg条件下离心30min，去掉上清液，保留沉淀。沉淀溶于7L缓冲液B中，用同样的Tris缓冲液透析脱盐。脱盐后溶液加入刀豆凝集素200mL (已活化，且用缓冲液B平衡)，4'C下 搅拌过夜，使酶与刀豆凝集素充分结合。静置40分钟，抽滤去掉清液部份，加入缓冲液C300 ml(分5次进行)，充分混匀，使CELI核酸酶溶于缓冲液中，过滤；滤液使用超滤膜浓縮(分 子量截留10000道尔顿)至100 ml，上DEAE—Sepharose FF柱柱场为30 mm (直径)X 400 mm (高)，采用TH-500梯度混合仪(上海沪西分析仪器厂生产)进行梯度洗脱，洗脱 流速为0.6ml/min，每8 min收集一管洗脱液；用RF-I Nicking方法检测CEL I活力高峰管， 再用SDS-聚丙烯凝胶电泳法检测其蛋白纯度，之后合并蛋白为单一条带的活力高峰管酶液， 此洗脱液即为CEL I核酸酶蛋白洗脱液，获得酶液19.2 1111。按例l方法检测，每ml酶液含 蛋白3.09mg、酶活力为92687 U，测得酶比活为3xl07 U/mg蛋白；19.2 ml酶提取液酶的总 活为1.78xl06U， CELI核酸酶回收率达9.83%。用SDS—PAGE检测，达电泳纯核酸酶CEL
Io
权利要求
1、一种提取芹菜中CEL I核酸酶的方法，该方法由以下步骤组成(1)称取芹菜，每1kg芹菜加入80～120ml缓冲液A，捣成匀浆，压榨出液体，过滤，用1 M的Tris溶液调节pH至8.0左右，得粗酶液；(2)将粗酶液在45～50℃下保温15～20min，然后3000×g～5000×g离心20～40min，取上清液；(3)加入硫酸铵粉末至饱和度为25％，3000×g～5000×g离心20～40min，收集上清液；所得上清液中加入硫酸铵粉末至饱和度为80％，3000×g～5000×g离心20～40min，收集沉淀物；(4)将所得沉淀物用缓冲液B溶解，透析脱盐；(5)加入刀豆凝集素，混匀，4～10℃下搅拌6～16小时使CEL I核酸酶与刀豆凝集素充分结合，然后静置20～60min；(6)抽滤去清液，在滤渣中加入缓冲液C溶解出CEL I核酸酶，超滤浓缩。在4～10℃条件下，上DEAE-Sepharose FF，然后依次用洗脱液D和洗脱液E各500ml以0.5～1ml/min的流速进行梯度洗脱；(7)收集洗脱液，用RF-I Nicking方法检测各收集管中的CEL-I核酸酶活力，合并酶活力在3×107U/mg蛋白的洗脱液；上述步骤中，所述缓冲液A由以下方法制备得到在pH8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液中添加N2SO3和苯甲基磺酰氟至浓度分别为0.01M和1mM；所述缓冲液B由以下方法制备得到在pH8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液中添加苯甲基磺酰氟至浓度为1mM；所述缓冲液C由以下方法制备得到在pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液中添加甲基甘露糖苷和Triton X-100至浓度分别为30mM和0.01％；所述洗脱液D由以下方法制备得到在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中添加甲基甘露糖苷、Triton X-100和KCl至浓度分别为10mM、0.01％和10mM；所述洗脱液E由以下方法制备得到在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中添加甲基甘露糖苷、TritonX-100和KCl至浓度分别为10mM、0.01％和0.5M。
全文摘要
本发明方法抛弃了现有方法中的多次高速或超速离心以及多次凝胶过滤和离子交换层析的手段，在抽提液中采用添加少量亚硫酸钠减少和清除提取液中有色物质；采用热变性的物理方法，快速清除大量耐温性差的杂蛋白；利用CEL I是糖蛋白能与活化的刀豆凝集素结合的特点，使CEL I核酸酶与刀豆凝集素结合除去其他杂蛋白，使CEL I得到进一步的纯化；最后选择DEAE-Sepharose FF作为适宜介质进行一次层析纯化出CEL I。这样，我们的提取方法代替现采用多次高速甚至超速冷冻离心、多次凝胶过滤和离子交换层析等费时且昂贵的手段，达到快速将CEL I核酸酶从芹菜中提取出来并纯化的目的。
文档编号C12N9/22GK101538561SQ20091003872
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月17日 优先权日2009年4月17日
发明者李荣华, 郭培国 申请人:广州大学