专利名称：棕果蝠瘦素蛋白及其cDNA序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及痩素蛋白，具体涉及一种来源于棕果蝠^ o^em^ /wc/zwaw/^'y*的瘦素蛋白及其cDNA序列。
背景技术：
痩素蛋白(leptin)是1994年发现的一个由167个氨基酸组成的小蛋白， 由脂肪组织分泌的蛋白质类激素，目前研究结果已经证实其它组织也能产生， 包括胎盘、大鼠的骨胳肌、大鼠的胃、人的乳腺上皮细胞、人和鼠的腺垂体等。
瘦素蛋白是肥胖相关的信号，脂肪组织的反馈信号作用到脑中心，控制饮 食行为和活动(代谢和运动)，是ob (obese)基因的产物。脂肪组织产生的痩 素蛋白经血液运输到脑，与下丘脑的受体作用后通过控制饮食摄入和能量消耗 来控制哺乳动物的体重，被认为是最具有潜力的减肥药物之一。
痩素蛋白除了能够降低食欲，控制体重，减少体内脂肪含量外，还可传递 动物体内外能量贮存信号到大脑中枢，影响神经内分泌系统，促进动物生殖系 统发育和获得生育能力，调控动物初情期的启动、性成熟和妊娠等生殖活动， 调节胎儿胎盘，使动物提前发情，縮短发情周期，调节葡萄糖代谢，脂类代谢， 调节血压、大脑和骨骼发育，伤口愈合，细胞分化增殖，参与造血作用，机体 免疫调节等功能。痩素功能的多样性尤其在能量调节方面的关键作用，也赋予 痩素更大的产品开发的价值。
瘦素蛋白的开发和利用己深入到许多领域包括减肥药物的开发以及减肥 产品的深加工，治疗糖尿病药物开发，治疗高血压药物开发，治疗脂肪肝药物开发等等，随着对其功能认识的不断深入，关于leptin产业化前景将更加广阔。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于棕果蝠O ow^m^ /Mc/zeMm^'O的痩
素蛋白，为今后开发痩素基因工程产品奠定物质基础。
本发明的另一个目的在于提供含有上述痩素蛋白完整编码区的cDNA序列。
本发明的上述目的通过如下方案予以实现
本发明提供一种痩素蛋白，该痩素蛋白为如下(i )或(ii)所述任一项
的蛋白质
(i ) 一种具有SEQIDNO: 3所示氨基酸序列的蛋白质；
(ii)在氨基酸序列(i )中，由缺失、取代或加成1个或几个氨基酸的
氨基酸序列所组成，且与氨基酸序列(i)的蛋白质具有相同功能的蛋白质。 本发明的痩素蛋白优选具有SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列。 本发明还提供编码上述痩素蛋白的cDNA序列，该cDNA序列为编码如
下(i )或(ii)所述任一项蛋白质的cDNA序列
(i ) 一种具有SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列的蛋白质；
(ii )在氨基酸序列(i )中，由缺失、取代或加成1个或几个氨基酸的氨
基酸序列所组成，且与氨基酸序列(i)的蛋白质具有相同功能的蛋白质。 上述编码痩素蛋白的cDNA序列优选其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 本发明的痩素蛋白来自于棕果蝠0 oM化m^ /Mc/zwm^/"，提取棕果蝠脂
肪组织总RNA反转录后作为模板，根据已知哺乳动物痩素蛋白序列保守区设
计简并引物进行简并PCR扩增，测序后得到本发明痩素蛋白的全长cDNA列，并对该全长CDNA序列进行氨基酸分析，得到本发明棕果蝠瘦素蛋白为
SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，总共165个氨基酸，其中前21个氨基酸 为信号肽序列。
与现有技术相比，本发明具有如下优点
本发明从棕果蝠的脂肪组织中获得了一种痩素蛋白的全长cDNA，并进行 了蛋白表达，通过利用GST重组表达技术和凝血酶酶切除去GST标记物，成 功获得了棕果蝠痩素蛋白，此外对该蛋白进行细胞活性分析，结果表明本发明 的棕果蝠痩素蛋白具有明显的脂肪降解活性，可用于制备减肥药物、治疗糖尿 病药物、治疗高血压药物以及治疗脂肪肝药物等。
图1为棕果蝠瘦素蛋白全长cDNA序列的PCR扩增电泳其中，l为分子量标记，2为PCR扩增产物；
图2为实施例2中重组质粒表达产物的SDS-PAGE检测电泳其中，1为分子量标记，2为重组表达菌未诱导对照样品，3为重组表达
菌IPTG诱导3h后样品，箭头所指处为新的表达条带；
图3为实施例3中蛋白表达的SDS-PAGE检测电泳其中，1为分子量标记，2为过柱纯化但未经凝血酶切对照样品，3为过
柱纯化且经凝血酶切的样品，4为GST， 5为瘦素蛋白； 图4为棕果蝠瘦素蛋白MTT活性检测结果柱状图； 其中，1为GST对照组，2为棕果蝠痩素蛋白组，3为空白对照组，**:
PO.01;
图5为棕果蝠痩素蛋白LDH活性检测结果柱状图；其中，1为GST对照组，2为棕果蝠痩素蛋白组，3为空白对照组，**:
PO.Ol。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但具体实施例并不对本发 明做任何限定。
实施例l棕果蝠瘦素蛋白全长cDNA序列的获得
1、 模板制备
按照RNAiso试剂盒(TakaRa公司)说明书提取棕果蝠(i ou^K^ /Mc/ze"aw加/)脂肪组织总RNA，并采用反转录试剂盒，以该总RNA为模板， 进行反转录试验得到下述PCR扩增用模板。
2、 引物设计
根据已知的哺乳动物痩素蛋白序列保守区设计简并引物，如下所示 Primer 1，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示； Primer 2，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
3、 PCR扩增
PCR扩增反应体系(50pl) : PCR扩增模板2ji1，引物Primer 1/ Primer 2 (10pM)各lpl， 10 XTaq Polymerase mix (TaKaRa公司)5pl， ddH2041nl;
PCR扩增反应条件94。C预变性5min， 94。C变性l min， 54。C退火90s， 72 'C延伸2min， 30个循环，最后72。C延伸5 min。
4、 PCR产物的连接、转化和测序
将上述PCR反应产物经胶回收、连接、转化等常规操作后克隆入pMD-19T 载体(市售)，阳性克隆经蓝白斑筛选和PCR鉴定后，送测序公司进行测序同时对测序结果进行氨基酸序列分析。
测序结果及氨基酸序列分析结果表明，本实施扩增所得棕果蝠痩素蛋白的
全长cDNA为498 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示，该cDNA序列编码 165个氨基酸编码，其氨基酸序列如SEQIDNO: 3所示，其中前21个氨基酸为 信号肽序列。
实施例2重组表达载体的构建
根据实施例l所得棕果蝠痩素蛋白基因序列设计引物(P1和P2)，扩增不 含信号肽序列的全部编码区，并引入BamH I / Sal I限制酶切位点用于重组表达 载体的构建。
Pl，其核苷酸序列如SEQIDNO: 6所示；
P2，其核苷酸序列如SEQIDNO: 7所示。
上述PCR扩增反应体系可参照PCR反应试剂盒说明书，其具体反应条件 为94。C预变性5min， 94°C变性l min， 55。C退火90s， 72。C延伸2min， 30个 循环，最后72。C延伸5min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，可见到清晰的目 的片段扩增条带，如图1所示，扩增出的片段长度约435bp，与设计的扩增片段 长度相符，且未出现非特异性扩增。
将上述PCR扩增产物经胶纯化回收后，用BamHI禾BSal I于37'C消化过夜， 随后与PGEX-4T-2载体(Invitrogen)连接构建重组表达质粒，挑选阳性克隆 进行测序，测序结果与原序列相同，表明扩增克隆后的基因未发生突变，而且 开放阅读框架(ORF)与载体ORF—致，融合蛋白约373氨基酸(含GST)，理 论分子量为41.8kDa。
将上述经测序验证序列读码框正确的阳性克隆转入大肠杆菌表达菌BL21(市售)内，经lmmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导3 h，将重组表达 菌诱导前、后菌体裂解物一起经SDS-PAGE检测，电泳检测结果如图2所示， 与重组表达菌诱导前的SDS-PAGE电泳图对比后，发现重组表达菌诱导后在42 kDa处出现了一条新的表达条带(图中箭头所指条带)，该条带的分子量大小 与理论推导值相符，说明诱导表达产物为GST-Leptin重组蛋白。
本实施例所涉及的胶回收、双酶切消化、载体连接、大肠杆菌转化以及 IPTG诱导表达等技术均采用本领域技术人员的常规操作。
实施例3蛋白表达与纯化
将实施例2中制备得到的含有棕果蝠瘦素蛋白基因重组表达质粒阳性克 隆的大肠杆菌BL21，按l: 100 (菌液LB+培养基，体积比)接种于含有氨 苄青霉素的LB+培养基(酵母提取物5g，蛋白胨10g，琼脂15g， NaC15g， ddH20至l升，pH=7.4，氨苄抗生素1%)中，37°C， 190rpm，培养约3h。当 OD600=0.6 1时，加入IPTG至工作浓度为0.6mM，于28°C， 190rpm，诱导 3h。
将上述诱导后的菌液于5000g， 4"离心10min，菌体用PBS洗2遍，期 间5000g， 4。C离心10min;按照每2 5ml菌液加入28ml裂解液、50}il溶菌酶、 30 4(^l苯甲基磺酰氟(PMSF)(终浓度100piM)对菌体裂解0.5 lh;裂解好 的菌体于4"C或冰浴破碎(工作时间3s，隔时间5s， 300WM50次，约20 25min， 然后于4。C离心(12000g， 10min)收集上清；上清用0.45pm虑膜过滤后，作 为下一步GST亲和纯化的上样品。
本实施例的GST亲和纯化的填料采用High-Affinity GST Resin (市售)， 其纯化具体操作可参考相关试剂说明书填料4ml，先用25 30mlPBS洗柱，然后加入前述已制备好的上样品过柱，流速控制2 4s/滴；再用20倍柱床体积
的PBS清洗纯化柱；还原型谷胱甘肽洗脱新鲜配制0.154g谷胱甘肽+50ml Tris-HCl (50mM， PH8.0)，每次3ml，流速4 5s/滴；最后用PBS清洗纯化柱
对上述过柱样品进行超滤浓縮，可采用5000rpm， 4"C离心30min。 按照每lmg蛋白加入10U凝血酶比例，采用凝血酶(市售)对上述浓縮样 品进行常温酶切3h，酶切后的产物再次进行亲和纯化以去除GST (具体操作同 前述的GST亲和纯化)，回收过柱样品再次进行超滤浓縮(操作同前)，从而最 终得到棕果蝠痩素蛋白。将该浓縮上清液、进行凝血酶酶切的样品一起进行 SDS-PAGE检测，检测结果如图3所示，从图3可以看出，过柱纯化且经过凝血 酶酶切后的样品得到两条带， 一条在26KD位置，根据现有材料可知该条带为 GST (GST的分子量为26KD)，另外一条带在16KD的位置，这与理论值(本 发明的痩素蛋白不含信号肽的成熟肽序列为144个氨基酸，而144个氨基酸编码 蛋白约为15.8KD)相符，说明棕果蝠瘦素蛋白与GST标签成功分离，同时蛋白 浓度检测结果也表明分离、回收的棕果蝠瘦素蛋白浓度和纯度达到细胞实验要 求。
实施例4 细胞活性分析
本实施例首先采用传统细胞培养的操作培养3T3-L1前脂肪细胞，然后以 培养好的3T3-L1前脂肪细胞作为实验样品，对实施例3分离纯化出的棕果蝠 瘦素蛋白(15.8KD)进行MTT检测和LDH检测。
本实施例的MTT检测以及LDH检测，均采用本领域技术人员的常规操 作，将棕果蝠痩素蛋白(10—6M)孵育3T3-Ll前脂肪细胞24h，同时每个检测均设两个平行实验对照， 一个是不含3T3-L1前脂肪细胞的空白对照组， 一个
是采用GST (1(T6M)孵育3T3-Ll前脂肪细胞24h的对照组。 细胞活性分析结果
1. 图4给出棕果蝠痩素蛋白MTT活性检测结果，从图中可以看出，空白 对照组的数据为0，用棕果蝠痩素基因重组蛋白(10—6M)孵育3T3-L1前脂肪 细胞24h后，活细胞比率(MTT)下降16.8%，与GST对照组(6.6%)相比 差异极显著(PO.01);
2. 图5给出棕果蝠痩素蛋白LDH活性检测结果，从图中可以看出，空白 对照组的数据为0，用棕果蝠瘦素基因重组蛋白(1(T6M)孵育3T3-L1前脂肪 细胞24h后，脂肪细胞的乳酸脱氢酶释放比率(LDH)显著升高(4.5%)，明 显高于GST对照(0.2%) (PO.Ol)。
根据图4和图5的对比结果，说明本发明的棕果蝠痩素蛋白具有明显的脂 肪降解活性。棕果蝠瘦素蛋白及其cDNA序列序列表.txt SEQUENCE LISTING
<110>广东省昆虫研究所
<120>棕果蝠瘦素蛋白及其cDNA序列
<130〉
〈160〉 7
<170〉 Patentln version 3.5
<210〉 1
<211〉 498
<212> 腿一
<213> 棕果蝠(Rousettus lesche腳ltii)
<400〉 1
atgcattgtggactcctgtgccgattcctgtggctttggcctt"ttc"tcttctacattgaa60
gctgtgcccatccaaaaagtccaggertgactCCElELELElttCgatcatcacc120
aggatcaatacatgcggtcggtctcctctaaacagacggtcactggtttg180
gacttcattcctcggctccacactgatctgactttctccaagatgaaccagacattagca240
gtctaccaacagatccttgccgclxtgtcttccagaaatgtggtccaaatatccaacgac300
ctacagsacctccaggaccttctccatctgctggccctcagaagctgtcccttcctccag360
gacagccgcccgaataccttggagggcctgggtggcatcctagaaacctcattctccatg420
gaggtggtgaccctgagcaggctgcagggg■tttctgcaggacatgttacagcagctggac■
ctcagccctggatgctga498
<210〉 2
<211〉 498
〈212〉 DNA 一
〈213〉 棕果蝠(Rousettus lesche腿ltii)
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (495)
〈400〉 2 atg cat tgt Met His Cys 1
gga Gly
etc Leu 5
ctg Leu
tgc Cys
cga Arg
Uc Phe
ctg Leu 10
Trp
ctt Leu
tgg Trp
Pro
Phe 15
etc Leu
48
ttc tac att gaa get gtg ccc at:c caa aaa gtc cag ga/t gac tec aaa Phe Tyr lie Glu Ala Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Ser Us 20 25 30
96
att etc ate aag acg ate ate acc agg ate aat aat att cca cac atg lie Leu lie Lys Thr lie lie Thr Arg lie Asn Asn lie Pro His Met 35 40 45
144
egg teg gtx tec tct aaa cag acg gtc act ggt ttg gac ttc att cct Arg Ser Val Ser Ser Lys Gin Thr Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro 50 55 60
192
egg etc cac act gat ctg act ttc tec aag atg aac cag aca tta gca Arg Leu His Thr Asp Leu Thr Phe Ser Lys Met Asn Gin Thr Leu Ala 65 70 75 80
240
gtc tac caa cag ate ctt gcc get ctg "tct tec aga aat gtg gtx caa Val Tyr Gin Gin lie Leu Ala Ala Leu Ser Ser Arg Asn寸al Val Gin 85 90 95
288
ata tec aac gac eta cag aac etc cag gac ctt etc cat ctg ctg gcc lie Ser Asn人sp Leu Gin Asn Leu Gin Asp Leu Leu His Leu Leu Ala 100 105 110
336棕果蝠瘦素蛋白及其cDNA序列序列表.txt
etc aga age tgt ccc ttc etc cag gac age cgc ccg aat acc ttg gag Leu Arg Ser Cys Pro Phe Leu Gin Asp Ser Arg Pro Asn Thr Leu Glu
115
120
125
ggc ctg ggt ggc ate eta gaa acc tea ttc tec atg gag gtg gtg acc Gly Leu Gly Gly lie Leu Glu Thr Ser Phe Ser Met Glu Val Val Thr
130
135
140
ctg age agg ctg cag ggg ttt ctg cag gac atg tta cag cag ctg gac Leu Ser Arg Leu Gin Gly Phe Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu人sp
145
150
155 160
etc age cct gga tgc tga Leu Ser Pro Gly Cys 165
<210> 3 <211〉 165 <212> PRT 一
<213〉 棕果蝠(Rousettus leschenaultii) <400〉 3
Met His Cys Gly Leu Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Pro Phe Leu
1
5
10
15
Phe Tyr lie Glu Ala Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Ser Lys 20 25 30
lie Leu lie Lys Thr lie lie Thr Arg lie Asn Asn lie Pro His Met 35 40 45
Arg Ser Val Ser Ser Lys Gin Thr Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro 50 55 60
Arg Leu His Thr Asp Leu Thr Phe Ser Lys Met Asn Gin Thr Leu Ala
65
70
75
80
Val Tyr Gin Gin lie Leu Ala Ala Leu Ser Ser Arg Asn Val Val Gin 85 90 95
lie Ser Asn Asp Leu Gin Asn Leu Gin Asp Leu Leu His Leu Leu Ala 100 105 110
Leu Arg Ser Cys Pro Phe Leu Gin Asp Ser Arg Pro Asn Thr Leu Glu 115 120 125
Gly Leu Gly Gly lie Leu Glu Thr Ser Phe Ser Met Glu Val Val Thr 130 135 140
Leu Ser Arg Leu Gin Gly Phe Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp
145 150
Leu Ser Pro Gly Cys 165
〈210〉 4
<211〉 27
<212〉 腿 <213>人工序列
〈400〉 4
155 160
384
432
480
498棕果蝠瘦素蛋白及其cDNA序列序列表.trt aagaagmmsa tccyrggrag gaaaatg 27
<210> 5
<211> 25
<212〉 DNA <213>人工序列
<400> 5
wgrccttyra rrcytcagca yycag 25
〈210〉 6
<211> 35
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<400〉 6
ccggatccgt gcccatccaa aaagtccagg atgac 35
<210> 7 -
<211> 25
〈212〉 腿 <213〉人工序列
<400〉 7
ccgtcgactc agcatccagg gctga 2权利要求
1、一种瘦素蛋白，该瘦素蛋白为如下(i)或(ii)所述任一项的蛋白质(i)一种具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的蛋白质；(ii)在氨基酸序列(i)中，由缺失、取代或加成1个或几个氨基酸的氨基酸序列所组成，且与氨基酸序列(i)的蛋白质具有相同功能的蛋白质。
2、 根据权利要求1所述瘦素蛋白，其特征在于该瘦素蛋白具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。
3、 根据权利要求2所述痩素蛋白，其特征在于该蛋白质氨基酸序列中的 前21个氨基酸为信号肽序列。
4、 一种编码痩素蛋白的cDNA序列，其特征在于该cDNA序列编码如下 (i )或(ii)所述任一项蛋白质(i ) 一种具有SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列的蛋白质； (ii)在氨基酸序列(i )中，由缺失、取代或加成1个或几个氨基酸的氨 基酸序列所组成，且与氨基酸序列(i )的蛋白质具有相同功能的蛋白质。
5、 根据权利要求4所述的cDNA序列，其特征在于该cDNA序列具有SEQ ID NO: l所示核苷酸序列。
6、 一种含有权利要求4所述cDNA序列的质粒。
7、 一种含有权利要求6所述质粒的转化体。
全文摘要
本发明公开一种棕果蝠的瘦素蛋白及其cDNA序列，该瘦素蛋白为一种具有SEQ ID No3所示氨基酸序列的蛋白质，或在氨基酸序列(i)中，由缺失、取代或加成1个或几个氨基酸的氨基酸序列所组成，且与氨基酸序列(i)的蛋白质具有相同功能的蛋白质。本发明采用GST重组表达技术和凝血酶酶切除去GST标记物，从棕果蝠中提取得到瘦素蛋白，细胞活性分析结果表明该棕果蝠瘦素蛋白具有明显的脂肪降解活性，可用于制备减肥药物、治疗糖尿病药物、治疗高血压药物以及治疗脂肪肝药物等。
文档编号C12N15/16GK101544692SQ200910039440
公开日2009年9月30日 申请日期2009年5月13日 优先权日2009年5月13日
发明者何灵江, 原丽红, 左学国, 张树义, 林本夫, 陈金平 申请人:广东省昆虫研究所