专利名称：一种乳腺癌的分子标志物hsa-miR-374a及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乳腺癌的分子标志物hsa-miR-374a 及其应用。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约有120万的新增乳腺癌 病例，50万的死亡病例，具有发病率高、死亡率高的特点。导致乳腺癌高死亡 率的其中一个原因就是乳腺癌的扩散转移，易发的转移部位包括肺、肝、脑、 骨、胸膜等。近年来，我国的乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，严重危害女性 的生命和健康。
微小RNA ( microRNA)是广泛存在于真核生物中一组不编码蛋白质的短序 列RNA,长度为20-24个碱基，具有高度保守性、时序性和组织特异性。它 通过与耙基因的mRNA碱基特异性配对，促进mRNA的降解或抑制其翻译，从 而实现对基因表达的调控作用。已有研究表明，microRNA在调节细胞生长、 细胞凋亡、细胞运动、细胞分化以及胚胎发育过程中发挥重要作用。 microRNA自身表达的异常在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中已经得到验证， microRNA参与了乳腺癌的发生发展，提示它们在乳腺癌诊断、预后和治疗 中可能具有广阔的应用前景。
现有技术的国内外文献检索中至今未见有关hsa-miR-374a与乳腺癌的关系 的研究报道。
发明内容
本发明的目的提供一种新的乳腺癌的分子标志物。
3本发明的乳腺癌的分子标志物为小分子非编码RNA基因hsa-miR-374a。发 明人首先利用microRNA芯片技术检测了 13例乳腺癌组织和两个正常乳腺组织 中microRNA的表达镨，选取了其中的hsa-miR-374a，在临床切片中进一步验证 hsa-miR-374a与乳腺癌的相关性，并在体外细胞培养水平进行深入的功能探讨。
本发明提出以小分子非编码RNA基因hsa-miR-374a作为乳腺癌的分子标志 物，该分子标志物能诱导乳腺癌上皮细胞发生上皮间质转化，从而促进乳腺癌 上皮细胞的浸润和转移能力。本发明的小分子非编码RNA基因hsa-miR-374a 在乳腺癌组织中的表达显著高于正常乳腺组织，而且与乳腺癌的临床分勤目关， 同时，hsa-miR-374a在体外培养的乳腺癌细胞系中的表达显著高于正常的乳腺上 皮细胞以及永生化的正常乳腺上皮细胞，提示了该基因在乳腺癌的临床诊断方 面可能成为 一种有效的标志物。该基因成熟体序列如SEQ ID NO. 1所示的序列
5 ，-UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG誦3 ，。
本发明还提供了本发明的乳腺癌的分子标志物在制备抗乳腺癌肿瘤药物中 的应用，所述药物包含有效量的阻断剂，所述阻断剂能阻断小分子非编码RNA 基因hsa-miR-374a的表达。hsa-miR-374a的核苷酸序列为SEQ ID NO.l所示的 序列。由于本发明的小分子非编码RNA基因hsa-miR-374a可以诱导乳腺癌上皮 细胞发生上皮间质转化，可以促进乳腺癌上皮细胞的浸润和转移能力，当阻断 hsa-miR-374a在乳腺癌上皮细胞中的表达时，可能可以有效抑制上皮间质转化的 发生，甚至使已经发生上皮间质转化的细胞恢复上皮细胞特性，并且有效抑制 乳腺癌上皮细胞的浸润和转移能力。
本发明为乳腺癌的诊断提供了一种新的分子标志物，即小分子非编码RNA 基因hsa-miR-374a，而且利用寡义核苷酸技术开发出阻断hsa-miR-374a在乳腺 癌上皮细胞中的表达的阻断剂作为全新的抗乳腺癌肿瘤药物，为乳腺癌的治疗 提供新的有效途径。hsa-miR-374a分子还可能参与了乳腺癌发生发展过程中的其 他环节，如细胞生长、细胞凋亡、血管生成等等，以及参与了其他类型肿瘤的 发生发展过程。因此，本发明还对以后深入研究hsa-miR-374a的功能以及与其 他肿瘤的关系提供了 一定的经验和lJf出。
图1是本发明实施例1中用实时定量RT-PCR方法检测hsa-miR-374a的表 达水平；A:检测hsa-miR-374a在不同乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达水平；
Nl、 N2表示2例正常乳腺组织，T1-T13表示13例乳腺癌组织；B: hsa-miR-374a 在体外培养的各种乳腺癌细胞系和正常的乳腺上皮细胞以及永生化的正常乳腺
上皮细胞中的表达水平；
图2是本发明实施例2中用原位杂交技术对不同临床级别的乳腺癌石蜡包 埋组织切片的染色图3是本发明实施例3中hsa-miR-374a的过表达对乳腺上皮细胞MCF-7 形态的影响；A:建立稳定it^达hsa-miR-374a的MCF-7细胞林(MCF-7-374a); B: MCF-7过表达hsa-miR-374a后由上皮细胞形态向间质细胞形态转变，并由 克隆性生长向散落性生长转变；
图4是本发明实施例4中用western blotting检测上皮细胞和间质细胞标志 物的表达水平；
图5是本发明实施例5中相对于MCF-7,检测MCF-7-374a浸润和转移能 力的变化；A:过表达hsa-miR-374a显著增强MCF-7在基质胶中的浸润能力； B:过表达hsa-miR-374a显著增强MCF-7在穿过小室中的迁移能力。
具体实施例方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应 理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例 中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1 hsa-m股-374a表达水平的检测
经过中山大学伦理委员会及病人家属的同意，收集临床上13例乳腺癌组织 和2例正常乳腺组织的新鲜标本，用Trizol法提取组织RNA，利用ABI 7500荧光 定量PCR仪器系统检测hsa-miR-374a的表达水平，每个样品有三个复孔。各组织中hsa-miR-374a的表达以其中的1例正常乳腺组织RNA做为标准化内参。实验结
果见图1中的图A，图1A为检测hsa-miR-374a在不同乳腺癌组织和正常乳腺组织
中的表达水平；Nl、 N2表示2例正常乳腺组织，Tl-T13表示13例乳腺癌组织；
可以看出，hsa-miR-374a在乳腺癌组织中的表达显著高于正常乳腺组织，提示
hsa-miR-374a可能与乳腺癌的发生发展相关。
体外培养的各种乳腺癌细胞系和正常的乳腺上皮细胞以及永生化的正常乳
腺上皮细胞利用同样的Trizol法提取RNA,并检测在各种细胞系中hsa-miR-374a 的表达水平。实验结果见图1B,图lB显示了hsa-miR-374a在体外培养的各种乳 腺癌细胞系和正常的乳腺上皮细胞以及永生化的正常乳腺上皮细胞中的表达水 平。可以看出，hsa-miR-374a^体外培养的乳腺癌细胞系中的表达均显著高于正 常的乳腺上皮细胞以及永生化的正常乳腺上皮细胞。提示hsa-miR-374a可能与乳 腺癌的发生发展相关。
实施例2利用原位杂交技#测不同临床鈒别的乳腺癌石蜡包埋组织切片 中hsa-miR-374a的表达
随意选取不同临床级别的乳腺癌石蜡包埋组织切片，烤箱45。C烤片2hrs, 二甲苯脱蜡，100%、 100%、 75%、 50%、 25%梯度酒精及清水清洗二甲苯，各 5mins; 0.2M HC1 5mins; PBS 5mins; 40|ig/ml蛋白酶K25。C 20mins; 0.2%甘 氨^BS 5mins; PBS 5mins， 2次；4%曱醛10mins; PBS 5mins, 2次；无水醋 紛三乙醇胺5mins; PBS 5mins，4次；5 x SSC, 5mins，2次；预杂交，2hrs;孵 育探针40hrs左右；5 x SSC， 5mins,2次；50%甲酰胺，2 x SSC 30mins， 2次； 0.1%PBST， 5mins,5次；封闭液(Roche)封闭2hrs;抗DIG抗体(Roche), 16hrs，4 °C; 0.1%PBST, 10mins,4次；染色液，10mins， 2次；孵育NBT/BCIP， 12hrs; PBST终止反应；25%、 50%、 75%、 100%酒精；37。C干燥，封片。显微镜观察， 采用双盲方法打分，结杲见图2。可以看出，相对于正常的乳腺组织，hsa-miR-374a 在乳腺癌组织中呈强阳性表达，而且，随着乳腺癌组织临床分级增加， hsa-miR-374a表达增强。实施例3稳定it^达hsa-miR-374a对乳腺癌上皮细胞MCF-7形态的影响
建立稳定过表达hsa-miR-374a的细胞林
磷酸钙转染制备逆转录病毒转染前24h，将293FT传代至所需盘数；转染 当天将需要感染的细胞(MCF-7 )传代至所需的密度；转染时，将20昭(l|ig^l) pMSCV-puro、 20jug (ljug/pl)包装质粒pIK、 380^1 lxTE、2M CaCl2混匀 后逐滴緩慢加入480nl 2xHEPES，室温静止30min后将混合液均匀加入24h前 传代的293FT的培养基内，加入氯喹5)Lil并轻柔混匀。置入37。C、 5%C02、恒 温、恒湿细胞培养箱培养6h后用lx溶液A ( 1L溶液A中含7.149g HEPES， 1.802gD-葡萄糖、0.2236gKCl、 7.697g NaCl、 0.142g NaHC03)洗细胞2次， 小心加入适量培养基后置入37°C、 5%C02、恒温、恒湿细胞培养箱培养；次日 8时、12时、16时、20时、24时收集病毒液并用0.22nm孔径滤器过滤，其中 8时、12时、16时、20时收集的病毒液加入聚凝胺(polybrane) (lpl/ml)立 即感染待感染细胞，24时收集的病毒液冻存于-80。C以备病毒液不足时使用。24 时将感染的细胞的培养基换为正常培养基过夜。连续感染三天；感染结束后用 含有嘌呤霉素(0.5吗/ml)的培养基筛选阳性细胞；待细胞生长稳定后收集细胞 的RNA,用实时定量RT-PCR检测hsa-miR-374a的表达情况。
图3是hsa-miR-374a的过表达对乳腺上皮细胞MCF-7形态的影响。其中， 图3A是建立稳定过表达hsa-miR-374a的MCF-7细胞林(MCF-7-374a)，该图 说明了细胞林MCF-7-374a的hsa-miR-374a的表达量比正常表达的细胞抹 MCF-7-V的hsa-miR-374a的表达量要高出很多；图3B是MCF-7过表达 hsa-miR-374a后由上皮细胞形态向间质细胞形态转变，并由克隆性生长向散落性 生长转变的显微镜观察图片。
实施例4检测上皮细胞和间质细胞标志物的表达
细胞生长密度达到80%后弃去培养液;用4。C预冷的lxPBS洗2次；每P100 培^jnL中加入400pl lx细胞裂解液(10%甘油、3%SDS、 lx上层Tris);迅速覆盖整个培养皿并混匀；将培养孤倾斜用细胞刮将混合液刮向一边；充分吸出混 合液并移入1.5ml离心管，超声波破碎打断DNA后-20。C保存或立即测蛋白浓 度；SDS变性蛋白质后电泳，10.5%的分离胶和5%的浓缩胶，电泳时，分离胶 用100V电压，浓缩胶用80V电压；约2小时后，20%的甲醇转膜緩沖液转膜， 70V电压；3小时后，PVDF膜浸入封闭液中，37。C平緩摇动1小时；孵育一抗， 4。C过夜，上皮细月包的才示志物有E曙cadherin、 a-catenin、 ！3-catenin、 y-catenin， 间 质细胞标志物有vimentin、 N-cadherin、 fibronectin; 0.1%PBS/T漂洗10min,共 3次；孵育二抗，37。C平緩摇动1小时；0.1%PBS/T漂洗10min，共3次；ECL 化学发光及胶片曝光。western blotting的检测结果见图4，图4是用western blotting检测上皮细胞和间质细胞标志物的表达水平的结果。其中，MCF-7-V是 非过量表达hsa-miR-374a的细月包才朱，MCF-7-374a是过量表达hsa-miR-374a的细 胞株。该结果表明，MCF-7过表达hsa-miR-374a后，间质细胞标志物表达显著 增加，上皮细胞标志物显著减少。结果提示了 hsa-miR-374a能促进乳腺癌细胞 系的浸润和转移的能力。
实施例5细胞浸润实验和细胞迁移实验
细胞浸润实验基质胶置于冰中，4°C，过夜至完全融解；以9份无血清培 养基和l份基质胶稀释，充分混合，每个穿过小室中加入5(^1稀释液，铺满孔 底，37。C3-4小时；消化计数细胞，用无血清重悬细胞，混匀，每个小室中加入 200ul悬液，含50000个细胞，勿产生气泡；孔外加入10%FBS培养基500pl， 观察后力t^v37。C孵育箱；24小时后，取出小室，吸出孔内的基质胶，lxPBS洗 2次；用棉签小心擦拭小室孔内残留的细胞和基质胶；3份的甲醇和1份的水醋 酸固定膜上细胞，常温放置10-15mins; lxPBS—次；苏木素复染；自来水冲洗； 观察，任意取十个视野计算细胞数，并拍照。细胞迁移实验过程与细胞浸润 实验相同，但是整个过程不用加基质胶。图5的实验结果显示了相对于MCF-7， MCF-7-374a浸润和转移能力的变化；其中图A显示了过表达hsa-miR-374a显著 增强MCF-7在基质胶中的浸润能力；图B显示了过表达hsa-miR-374a显著增强MCF-7在穿过小室中的迁移能力。结果表明了 hsa-miR-374a能促进乳腺癌细胞 系的浸润和转移的能力。
综上实验结杲，hsa-miR-374a在乳腺癌组织中的表达显著高于乳腺正常组 织，在体外培养的各种乳腺癌细胞系中，其表达显著高于正常乳腺上皮细胞以 及永生化的正常乳腺上皮细胞，过表达hsa-miR-374a能诱导乳腺癌上皮细胞发 生上皮间质转化，促进其浸润和转移能力。因此，实验表明hsa-miR-374a有望 成为临床上乳腺癌诊断中的有效标志物。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表
< 120>—种乳腺癌的分子标志物及其应用
<160> 1 <210> 1 <211>22 <212>RNA <213>人工序列 <222>(1)...(22) <400> 1
uuauaauaca accugauaag ug 2权利要求
1、一种乳腺癌的分子标志物，其特征在于，所述乳腺癌的分子标志物为小分子非编码RNA基因hsa-miR-374a。
2、 根据权利要求1所述的一种乳腺癌的分子标志物，其特征在于，所述 hsa-miR-374a的核苷^列为SEQIDNO.l所示的序列。
3、 权利要求1所述的乳腺癌的分子标志物在制备抗乳腺癌肿瘤药物中的应 用，其特征在于，所述药物包含有效量的阻断剂，所述阻断剂能阻断小分子非 编码RNA基因hsa-miR-374a的表达。
4、 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述hsa-miR-374a的核苷酸 序列为SEQ ID NO. 1所示的序列。
全文摘要
本发明提供了一种新的乳腺癌的分子标志物，即小分子非编码RNA基因hsa-miR-374a作为乳腺癌的分子标志物，该分子标志物在乳腺癌组织中的表达显著高于正常乳腺组织，而且与乳腺癌的临床分级相关，hsa-miR-374a在体外培养的乳腺癌细胞系中的表达显著高于正常的乳腺上皮细胞以及永生化的正常乳腺上皮细胞。本发明还提供了该乳腺癌的分子标志物在制备抗乳腺癌肿瘤药物中的应用，该药物包含有效量的阻断剂，能阻断小分子非编码RNA基因hsa-miR-374a的表达。本发明为乳腺癌的诊断及治疗提供新的有效途径。本发明还对以后深入研究hsa-miR-374a的功能以及与其他肿瘤的关系提供了一定的经验和基础。
文档编号C12N15/11GK101633922SQ20091004200
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月24日 优先权日2009年8月24日
发明者吴珏珩, 隽 李, 蔡俊超, 洁 袁, 黄勇波, 黎孟枫 申请人:中山大学