一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用的制作方法

专利名称：：一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种融合表达藤黄微球菌赋活促进因子(resuscitation-promotingfactor，rpf)、新月柄杆菌cc3302基因以及芝田硫4t叶菌sshlOb基因的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株的制备方法及在铀矿浸出中的应用。
背景技术：
：氧化亚铁硫杆菌"ci力Y/w'oteci^"s/erroojrit/朋s，T.f)是重要的浸矿微生物之一，以氧化二价铁、元素硫以及还原态硫的化合物等来获得能量，在生长过程中产生三价铁、硫酸等浸出剂，因此能降低生产成本，同时，氧化亚铁硫杆菌能自我繁殖扩增，可以循环利用，这样就进一步降低了消耗。因此，利用氧化亚铁硫杆菌浸出金、银、铜、铀等的研究越来越受到重视。虽然氧化亚铁硫杆菌有着上诉优点，但其缺点同样明显，主要体现在生长速度缓'慢，高铀离子浓度下氧化能力降低甚至死亡，最适生长温度为3(TC，在高温下活性迅速下降。藤黄微球菌赋活促进因子具有促进休眠细菌复苏以及促进细菌生长的作用，cc3302基因在新月柄杆菌耐铀实验中表达增高了20余倍，与铀抗性关系密切，而sshl0b基因表达的蛋白能与核酸紧密结合，使其能在高热环境中维持螺旋状态，防止高热对核酸的破坏。
发明内容本发明的目的是提供一种氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株JW^/o6ad7^^/erroouVa/sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)，该菌株可以融合表达产生赋活促进因子、cc3302和sshl0b，与野生型氧化亚铁硫杆菌相比生长速度更快，同时耐铀和耐热能力有所提高，可以用于铀矿浸出工业应用。本发明的另一个目的是提供制备具有表达能力的穿梭质粒pJRD215-PT的方法，该方法操作简单，能较好地解决用于氧化亚铁硫杆菌接合转移质粒只具有克隆功能的问题。本发明还提供一种三基因(rpf、cc3302和sshlOb)融合表达载体构建的方法，使用柔性极高的两段GGS链将这三段基因连接在一起与pJRD215-PT连接，降低了操作难度，且由于柔性GGS链的存在保证了各蛋白的正确折叠。本发明还涉及氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株力"Vj'"j'oZ)acW"s/erroo;a'^/^QEY-6(pJRD215-PT-rcs)在铀矿浸出中的应用，可以縮短浸铀周期，提高浸出率，降低耗酸率。本发明的技术要点之一是穿梭表达载体pJRD215-PT构建。氧化亚铁硫杆菌的转化目前主要使用接合转移方式，首先将构建好的重组接合质粒转4化带mob基因的感受态大肠杆菌(如S17-1和HB101等)，然后制备2:2接合培养基，将带重组接合质粒的大肠杆菌和氧化亚铁硫杆菌一起在接合培养基上孵育进行接合反应，收集细菌，转至带相应抗生素的2:2固体培养基上培养，挑取单克隆扩增鉴定。但是目前应用于氧化亚铁硫杆菌的穿梭质粒均为克隆载体，需要先用软件预测目的基因的启动子，将目的基因与启动子一起扩增后克隆入穿梭质粒。这存在几个问题，首先启动子预测软件对启动子的预测不准确，不同软件预测的结果相差较大；其次，做不同的基因均需要进行预测，增加了工作量和难度。本发明的一个实施例中提供了一种制备具有表达能力的穿梭质粒PJRD215-PT的方法，该方法包括扩增引物合成，pJRD215和pQE30质粒的提取，T5启动子和TO终止子的扩增，目的基因片段的回收，测序鉴定。(1)扩增引物合成根据Qiagen公司提供的pQE30质粒序列设计PCR寡核苷酸扩增引物。T5启动子上游引物GGCGTCGACCTCGAGAAATCATAAAAAAT(下划线处为内切酶Sail位点)，下游引物TATCTAGAACCCGGGGTACCGAGCTC(下划线处为内切酶Xbal位点)。TO终止子上游引物GTTCTAGATAATTAGCTGAGCTTGGACTC(下划线处为内切酶Xbal位点)，下游引物GGGAATTCATTCTCACCAATAAAAAACGCC(下划线处为内切酶EcoRI位点)。(2)pJRD215和pQE30质粒的提取平板划线培养过夜，挑取单克隆接种于液体培养基中培养，集菌后按照全式金公司的EasyPurePlasmidMiniPr印Kit的说明书提取质粒。将提到的质粒溶液储存于-2(TC备用。(3)T5启动子和T0终止子的扩增94。C预变性5分钟；94'C变性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸30秒，30个循环，72。C再延伸10分钟。(4)目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit说明书回收目的基因片段。(5)目的DNA片段克隆入载体pJRD215和TO使用Xbal、EcoRI酶切回收后连接，得到的载体pJRD215-P和T5用Sall、Xbal酶切回收后连接。转化感受态细胞大肠杆菌(E.coli)JM109，挑取菌落快速提取质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，所得到的阳性克隆子是包含具有表达能力的穿梭质粒pJRD215-PT。测序结果表明扩增得到的T5启动子由186个核苷酸组成，5'端至3，端序列为T5启动子的核苷酸序列(SEQIDNo.1)GCGAGCTCGGTACCCCGGGTTCTAGATO终止子由123个核苷酸组成，5'端至3'端序列为:TO终止子的核苷酸序列(SEQIDNo.2GCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATGAATTC本发明的技术要点之二是三基因(rpf、cc3302和sshlOb)重组穿梭表达载体pJRD215-PT-rcs的构建。本发明所涉及的rpf基因来自藤黄微球菌，本发明的一个实施例中提供了一种藤黄微球菌rpf的核苷酸序列及其制备方法，该方法是以藤黄微球菌基因组DNA为模板，用特异性寡核苷酸引物，经PCR方法得到。藤黄微球菌购于国家医学菌种保藏管理中心，基因测序结果表明rpf由669个核苷酸组成，5，端至3，端序列为-藤黄微球菌rpf基因的核苷酸序列(SEQIDNo.3)TCGGCCAGGAGCTCGTCCTGCCGCAGGCC为保证融合表达的顺利进行，去掉了卬f670-672位的终止密码子。该基因编码的蛋白氨基酸序列为藤黄微球菌rpf基因的氨基酸序列(SEQIDNo.4)AAAEQAVVAEAETIVVKSGDSLWTLANEYEVEGGWTALYEANKGAVSDAA'VIYVGQELVLPQA本发明涉及的RPF蛋白分子量为23.2kD，等电点为4.20，富含丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、色氨酸和缬氨酸。在本发明的一个实施例中提供了一种藤黄微球菌rpf基因的制备的方法，该方法包括扩增引物合成，藤黄微球菌基因组DNA的提取，目的基因的PCR扩增，目的基因片段的回收，目的基因片段克隆入载体，序列测定。扩增引物合成根据GenBank中已经发表的藤黄微球菌的rpf基因序列设计PCR寡核苷酸扩增引物。上游引物(B-F):ATCGGTACCATGGACACCATGACTCTC(下划线处为内切酶Kpnl(下划线处为GGS链)。(1)藤黄微球菌基因组DNA的提取藤黄微球菌在脑心固体平板上划线培养后挑取单克隆至2ml液体培养基中培养，离心集菌后用天根公司细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取基因组DNA。将提到的基因组DNA储存于-2(TC备用。(2)目的基因的PCR扩增反应参数为95。C预变性5分钟；95。C变性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸40秒，30个循环，72。C再延伸10分钟。(3)目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit说明书回收目的基因片段。(4)目的基因片段克隆入载体回收的PCR产物与T载体连接，转化感受态细胞大肠杆菌(E.coli)JM109，挑取菌落快速提取质粒进行酶切鉴定，所得到的阳性克隆子是包括目的基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏。(5)序列测定提取质粒DNA双脱氧法测定核苷酸序列，测定引物为M13启动子引物。rpf序列测定结果序列长669个核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鸟嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为A-99、C-262、G-223、T-85。本发明所涉及的cc3302基因来自新月柄杆菌，本发明的一个实施例中提供了一种新月柄杆菌cc3302基因的核苷酸序列及其制备方法，该方法是以新月柄杆菌基因组DNA为模板，用特异性寡核苷酸引物，经PCR方法得到。新月柄杆菌购于DSMZ，基因测序结果表明cc3302由477个核苷酸组成，5'端至3'端序列为新月柄杆菌cc3302基因的核苷酸序列(SEQIDNo.5)为保证融合表达的顺利进行，去掉了cc3302的478-480位的终止密码子，并将GTG起始密码子换成了ATG。该基因编码的蛋白氨基酸序列为新月柄杆菌cc3302基因的氨基酸序列(SEQIDNo.6)本发明涉及的RPF蛋白分子量为16.9kD，等电点为9.87，富含丙氨酸、精氨酸和甘氨酸。在本发明的一个实施例中提供了一种新月柄杆菌cc3302基因的制备的方法，该方法包括扩增引物合成，新月柄杆菌基因组DNA的提取，目的基因的PCR扩增，目的基因片段的回收。(1)扩增引物合成根据GenBank中已经发表的新月柄杆菌的cc3302基因序列设计PCR寡核苷酸扩增引物。上游引物(C-F):ggtggUcaggtggttca収tggttcaggtggttca7ATGTGGCGGTCGCCTGTG(下划线处为GGS链)，下游引物(C-R):agatcctccagatcctcc观atcctccagatcctccATTACGCGTCATGACTGAG(下戈機处为GGS链)。(2)新月柄杆菌基因组DNA的提取新月柄杆菌在固体平板上划线培养后挑取单克隆至2ml液体培养基中培养，离心集菌后用天根公司细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取基因组DNA。将提到的基因组DNA储存于-2(TC备用。(3)目的基因的PCR扩增反应参数为95°。预变性5分钟；95r变性30秒，65'C退火30秒，72。C延伸30秒，30个循环，72。C再延伸10分钟。(4)目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit说明书回收目的基因片段。(5)目的基因片段克隆入载体回收的PCR产物与T载体连接，转化感受态细胞大肠杆菌(E.coli)JM109，挑取菌落快速提取质粒进行酶切鉴定，所得到的阳性克隆子是包括目的基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏。(6)序列测定提取质粒DNA双脱氧法测定核苷酸序列，测定引物为M13启动子引物。cc3302序列测定结果序列长477个核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鸟嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为A-69、C-136、G_169、T_103。本发明所涉及的sshlOb基因来自芝田硫化叶菌，本发明的一个实施例中提供了一种芝田硫化叶菌sshlOb基因的核苷酸序列及其制备方法，该方法是以芝田硫化叶菌基因组DNA为模板，用特异性寡核苷酸引物，经PCR方法得到。芝田硫化叶菌购于DSMZ，基因测序结果表明sshl0b由270个核苷酸组成，5'端至3'端序列为.芝田硫化叶菌sshlOb基因的核苷酸序列(SEQIDNo.7)TCCACMTCGAAATAATTCTTTTTAAATM该基因编码的蛋白氨基酸序列为芝田硫化叶菌sshlOb基因的氨基酸序列(SEQIDNo.8)STIEIILFK本发明涉及的RPF蛋白分子量为9.9kD，等电点为5.887，富含天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。在本发明的一个实施例中提供了一种芝田硫化叶菌sshlOb基因的制备的方法，该方法包括扩增引物合成，芝田硫化叶菌基因组DNA的提取，目的基因的PCR扩增，目的基因片段的回收。(1)扩增引物合成根据GenBank中已经发表的芝田硫化叶菌的sshlOb基因序列设计PCR寡核苷酸扩增引物。上游引物(D-F):ggaggatctggaggatctggaggatctggaggatctATGGACAATATTGTTTAC(下划线处为GGS链)，下游引物(D-R):CTGTCTAGATTATTTAAAAAGAATTAT(下划线处为内切酶Xbal位点)。(2)芝田硫化叶菌基因组DNA的提取芝田硫化叶菌在2ml液体培养基中培养，离心集菌后用天根公司细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取基因组DNA。将提到的基因组DNA储存于-2(TC备用。(3)目的基因的PCR扩增反应参数为95。C预变性5分钟；95。C变性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸30秒，30个循环，72。C再延伸10分钟。(4)目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit说明书回收目的基因片段。(5)目的基因片段克隆入载体回收的PCR产物与T载体连接，转化感受态细胞大肠杆菌(E.coli)JM109，挑取菌落快速提取质粒进行酶切鉴定，所得到的阳性克隆子是包括目的基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏。(6)序列测定提取质粒DNA双脱氧法测定核苷酸序列，测定引物为M13启动子引物。sshlOb序列测定结果序列长270个核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鸟嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为A-106、C-40、G-58、T-66。本发明的一个实施例中提供了一种构建融合穿梭表达载体pJRD215-PT-rcs的方法。该方法包括(1)以C-F和D-R为引物，以cc3302和sshlOb为模板扩增得到PCR产物cc3302-sshlOb;(2)以rpf和cc3302-sshl0b为模板，以B-F和D-R为引物扩增得到rpf-cc3302-sshlOb;(3)回收rpf-cc3302-sshlOb片段并克隆至pMD18-T载体；(4)重组穿梭表达载体pJRD215-PT-rcs的构建。其步骤如下(1)cc3302-sshl0b的PCR扩增以含有cc3302基因的T载体质粒和含有sshlOb基因的T载体质粒为模板，以C-F和D-R为引物，反应参数为95。C预变性5分钟；95。C变性30秒，68。C退火30秒，72。C延伸60秒，30个循环，72。C再延伸10分钟。(2)PCR产物克隆至T载体回收cc3302-sshlOb基因片段，并克隆于pMD18-T载体，将该重组载体(pMD18-T-cs)转入大肠杆菌JM109中。(3)rpf-cc3302-sshlOb的PCR扩增以含有rpf基因的T载体质粒和含有pMD18-T-cs基因的T载体质粒为模板，以B1-F和Dl-R为引物扩增得到rpf-cc3302-sshl0b。(4)PCR产物克隆至T载体回收rpf-cc3302-sshlOb基因片段，并克隆于pMD18-T载体，将该重组载体(pMD18-T-rcs)转入大肠杆菌JM109中。(5)重组穿梭表达载体pJRD215-PT-rcs的构建a.穿梭表达质粒的线性化及回收提取穿梭表达质粒pJRD215-PT，用Kpnl和Xbal双酶切成线性；9b.pMD18-T-rcs的线性化及rpf-cc3302-sshl0b的回收提取pMD18-T-rcs载体，用Kpnl和Xbal双酶切成线性，用0.8%低熔点琼脂糖胶电泳后回收rpf-cc3302-sshlOb片段，回收按照Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit说明书进行，回收的片段置-2(TC保存备用；c.连接回收的pJRD215-PT片段和rpf-cc3302-sshl0b片段在T4DNA连接酶的作用下16'C过夜，以得到重组穿梭表达载体pJRD215-PT-rcs;d.转化用CaCV法制作感受态大肠杆菌S17-l，提取pJRD215-PT-rcs质粒，取感受态大肠杆菌S17-1，加入1WpJRD215-PT-rcs质粒，按照分子克隆试验指南的方法进行转化，挑取阳性克隆子S17-1(pJRD215-PT-rcs)。rpf-cc3302-fir-4的测序结果表明其由1488个核苷酸组成，5'端至3'端序列为rpf-cc3302-sshl0b核苷酸序列(SEQIDNo.9)TCGGCCAGGAGCTCGTCCTGCCGCAGGCCggtggttcaggtggUcaggtggttcaggtggUcaATGTGGCGGTCGCCTTGAATATTGGATACATTCGGGTTCTCGCGAAGTCTCGTTACACCTCAGTCATGACGCGTMTggt.ggttcaggtggttcaGGAAAGTCCATTAACGTATCCACAATCGAAATMTTCTTTTTMATAA该基因编码的蛋白氨基酸序列为rpf-cc3302-sshlOb编码的氨基酸序列(SEQIDNo.10)GKS丽STIEIILFK本发明涉及的rpf-cc3302-flr-4蛋白分子量为51.65kD，等电点为5.24。本发明的技术要点之三是氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株^"力'^io力a"77"s/erroawVa/wQEY-6(pJRD215-PT-rcs)的构建。氧化亚铁硫杆菌的性状改良目前主要运用物理、化学方法诱变，但是这些方法都有着一个很大的缺陷，就是不能定向产生突变菌株且产生突变菌株的效率太低。运用基因工程手段则可以定向对氧化亚铁硫杆菌进行改造，并且改造效率大大提高。本发明的一个实施例中提供了一种氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株爿cio^'t力J'o6sd'7^s/erroo^W朋sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)的构建方法。该方法是用pJRD215-PT载体在氧化亚铁硫杆菌QEY-6中融合表达rpf、cc3302和sshl0b基因，包括(1)氧化亚铁硫杆菌QEY-6和大肠杆菌S17-l(pJRD215-PT-rcs)的培养；(2)接合转移；(3)阳性克隆筛选。其步骤如下(1)氧化亚铁硫杆菌QEY-6和大肠杆菌S17-1(pJRD215-PT-rcs)的培养氧化亚铁硫杆菌用9K液体培养基培养，大肠杆菌用LB液体培养基培养；(2)接合转移大肠杆菌培养至对数生长末期，离心集菌后用接合培养基基础盐液洗涤3次，用该溶液稀释至2X107mL，氧化亚铁硫杆菌QEY-6培养至稳定期，100Xg的速度离心去除铁离子沉淀，离心集菌后再用接合培养基基础盐液洗涤3次，用该溶液稀释至2X107mL，将二者按l:l的比例混合，将0.1mL混合细菌转至已铺在接合培养基上的0.45,的滤膜上，3CTC培养60小时，将滤膜转至3mL2:2固体培养基的基础盐液中，铺在加入了30(Hig/mL卡拉霉素的2:2选择培养基平板上，3CTC培养；(3)阳性克隆筛选挑取单克隆用加有300化/ibL卡拉霉素的2:2液体培养基进行扩增，培养至稳定期，100Xg的速度离心去除铁离子沉淀，离心集菌后按照全式金公司的EasyPurePlasmidMiniPr印Kit的说明书提取质粒，酶切鉴定。得到的阳性克隆即氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株Jcit/iz^iofeci'^^/krrooaV朋sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)。本发明的技术要点之四是氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株A'"ic^acj'W"s/erroozj'd3/sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)在铀矿浸出中的应用。在本发明的一个实施例中提供了氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株Jcy力Y力J'WaciW^/erroo;a'c/朋sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)在铀矿浸出中的应用的方法，并且进行了室内模拟试验，结果表明本发明涉及的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株与野生菌株相比具有更高11耐铀、耐热能力，能较显著地提高浸出率，縮短浸出周期，降低酸耗。这些都可以作为例证说明本发明涉及的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株在铀矿浸出中的用途。一种基因工程菌株，氧化亚铁硫杆菌A^'t/2Y力j'0Z7aci"M/erroo;aV朋sQEY-6(pJRD215-PT-ixs)保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2009年7月20日，保藏编号CCTCCM209156。附图1:pQE30质粒的T5启动子和TO终止子的PCR扩增结果泳道l为T5启动子PCR产物；泳道2为.T0终止子PCR产物；泳道3为分子量标准附图2:pJRD215-PT测序图普及比对结果附图3:藤黄微球菌rpf基因PCR结果泳道1为100-5000Marker;泳道2为rpf基因PCR产物附图4:新月柄杆菌cc3302基因PCR结果泳道1为100-5000Marker;泳道2为cc3302基因PCR产物附图5:芝田硫化叶菌sshlOb基因PCR结果泳道1为100-5000Marker;泳道2为sshlOb基因PCR产物附图6:rpf-cc3302-sshl0b片段的PCR扩增结果泳道1为rpf-cc3302-sshl0b片段的PCR产物；泳道2为100-5000Marker附图7:重组穿梭表达载体pJRD215-PT-rcs酶切鉴定结果泳道1为重组穿梭表达载体pJRD215-PT-rcs用Kpnl和Xbal双酶切的结果；泳道2为500-15000Marker附图8:氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株^"'A'^^o/^ciW^/erroo"V朋sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)提取质粒酶切鉴定结果泳道1为100-5000Marker;泳道2为氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株爿cic/j't/^o/^cj'""s/erroo;oVa/7sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)提取质粒用Kpnl和Xbal双酶切鉴定结果；泳道3为500-15000Marker附图9:氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株Jw'力Y/^'o6aciWiAS/erroawV朋sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)与野生氧化亚铁硫杆菌耐铀能力比较附图10:氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株Jcio7^io力sc/W"5"/errooaVs/zsQEY-6(pJRD215-PT-rcs)与野生氧化亚铁硫杆菌耐热能力比较附图ll:细菌柱浸工艺流程图附图12:不同浸出组浸出率比较附图13:不同浸出组耗酸率比较具体实施方法下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。'实施例1.具有表达能力的穿梭质粒pJRD215-PT的构建(1)扩增引物合成根据Qiagen公司提供的pQE30质粒序列设计PCR寡核苷酸扩增引物。T5启动子上游引物GGCGTCGACCTCGAGAAATCATAAAAAAT(下划线处为内切酶Sail位点)，下游引物TATCTAGAACCCGGGGTACCGAGCTC(下划线处为内切酶Xbal位点)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，经ULTRAPAGE纯化。(2)pJRD215和pQE30质粒的提取平板划线培养过夜，挑取单克隆接种于液体培养基中培养，集菌6mL后按照全式金公司的EasyPurePlasmidMiniPr印Kit的说明书提取质粒。将提到的质粒溶液储存于-2(TC备用。(3)T5启动子和T0终止子的扩增反应体系为H2040ri，缓冲液5W，dNTP2W，上游引物1W，下游引物1W，LATaqO.514，pQE30模板0.5^1，反应条件为94'C预变性5分钟；94。C变性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸30秒，30个循环，72。C再延伸10分钟，结果见图1。(4)目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit说明书回收目的基因片段，首先制作1.5%琼脂糖回收胶，目的基因片段电泳，然后切下含目的基因条带的琼脂糖胶块，每lOOmg胶块加入300WBufferQG，50。C水浴10分钟至胶块完全溶解，加入异丙醇(每100mg胶块加入IO(M异丙醇)，将上诉液体加入到QIAquickspincolumn中，离心1分钟，倒掉离心后液体，QIAquickspincolumn中加入500WBufferQG，离心1分钟，倒掉离心后液体，加入750WBufferPE，室温放置5分钟后离心1分钟，倒掉离心后液体，再离心1分钟彻底去除BufferPE，将QIAquickspincolumn放置在一个新的1.5mL离心管中，往QIAquickspincolumn中加入50^1BufferEB，离心1分钟，收集离心液，储存于-20°C。(5)目的DNA片段克隆入载体pJRD215和TO使用Xbal、EcoRI酶切回收后连接，连接体系为T4DNA连接酶1W，连接缓冲液lri，pJRD215载体2rt，T0片段6W，总体积10ri，16。C连接过夜，取连接产物10W加入到感受态细胞大肠杆菌(E.coli)JM109(全式金产品)中，冰上放置30分钟，42T:热休克45秒，再置冰上2分钟，加入SOC培养基500ri，37°C，180rpm培养l小时，铺卡拉霉素阳性平板，培养过夜，挑取菌落快速提取质粒进行PCR鉴定，阳性克隆进行测序鉴定。上诉方法得到的载体pJRD215-P和T5用Sall、Xbal酶切回收后连接。连接方法同上。再用同样的转化方法转化感受态细胞大肠杆菌(E.coli)JM109，挑取菌落快速提取质粒进行PCR鉴定和测序鉴定，所得到的阳性克隆子是包含具有表达能力的穿梭质粒pJRD215-PT。(6)序列测定提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，序列测定由北京擎科生物工程有限公司完成，测序引物为M13启动子引物。13测定结果见图2，序列完全正确，成功插入了T5启动子和T0终止子。实施例2.藤黄微球菌rpf基因的PCR扩增(1)扩增引物合成根据GenBank中已经发表的藤黄微球菌的rpf基因序列设计PCR寡核苷酸扩增引物。上游引物(B-F):ATCGGTACCATGGACACCATGACTCTC(下划线处为内切酶Kpnl位点)，下游引物(B-R):tgaaccacctgaaccacctgaaccacctgaaccsccGGCCTGCGGCAGGACGAG(下戈機处为GGS链)。弓l物由上海生工生物工程有限公司合成，经ULTRAPAGE纯化。(2)藤黄微球菌基因组DNA的提取藤黄微球菌在脑心固体平板上划线培养后挑取单克隆至2ml液体培养基中培养，离心集菌后用天根公司细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取基因组DNA。首先将向菌体沉淀中加入200ul缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮，向管中加入20iil蛋白酶K溶液，混匀，向管中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加220ul无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入700yl漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500y1漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。提到的基因组DNA储存于-2(TC备用。(3)目的基因的PCR扩增反应体系为H2040W，缓冲液5^1，dNTP2Pl，上游引物1W，下游引物1W，LATaqO.5^1，pQE30模板0.5ri，反应参数为95。C预变性5分钟；95。C变性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸40秒，30个循环，72t:再延伸IO分钟，结果见图3。(4)目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit说明书回收目的基因片段。首先制作1.0%琼脂糖回收胶，目的基因片段电泳，然后切下含目的基因条带的琼脂糖胶块，每100mg胶块加入300WBufferQG，50'C水浴10分钟至胶块完全溶解，加入异丙醇(每lOOmg胶块加入异丙醇)，将上诉液体加入到QIAquickspincolumn中，离心1分钟，倒掉离心后液体，QIAquickspincolumn中加入500则ufferQG，离心1分钟，倒掉离心后液体，加入75(miBufferPE，室温放置5分钟后离心1分钟，倒掉离心后液体，再离心1分钟彻底去除BufferPE，将QIAquickspincolumn放置在一个新的1.5mL离心管中，往QIAquickspincolumn中加入50WBufferEB，离心1分钟，收集离心液，储存于-2(TC。(5)目的基因片段克隆入载体回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，该载体购自大连宝生物工程有限公司。反应体系为PCR产物5ri，pMD18-T载体lW，10XT4DNA连接酶缓冲液1M1，去离子水2W，总体积为10W。16'C连接过夜。取连接产物10W加入到感受态细胞大肠杆菌(E.coli)JM109(全式金产品)中，冰上放置30分钟，42t:热休克45秒，再置冰上2分钟，加入SOC培养基500W，37°C，180rpm培养1小时，取200W菌液加入40W120mg/mL5-溴-4氯_3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及4j40.1M异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)混匀后涂含氨苄青霉素LB平板，培养过夜，挑取白色菌落快速提取质粒进行PCR鉴定，阳性克隆进行测序鉴定。(6)序列测定提取质粒DNA双脱氧法测定核苷酸序列，测定引物为M13启动子引物。rpf序列测定结果序列长669个核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鸟嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为A-99、C-262、G_223、T_85。实施例3.新月柄杆菌cc3302基因的PCR扩增(1)扩增引物合成根据GenBank中巳经发表的新月柄杆菌的cc3302基因序列设计PCR寡核苷酸扩增引物。上游引物(C-F):ggtggUcaggtggttcaggtggUcaggtggttcaATGTGGCGGTCGCCTGTG(下划线处为GGS链)，下游引物(C-R):agatcctccagatcctccagatcctccagatcctccATTACGCGTCATGACTGAG(下划线处为GGS链)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，经ULTRAPAGE纯化。(2)新月柄杆菌基因组DNA的提取新月柄杆菌在固体平板上划线培养后挑取单克隆至2ml液体培养基中培养，离心集菌后用天根公司细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取基因组DNA。首先将向菌体沉淀中加入200ul缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮，向管中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀，向管中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加220iil无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500yl缓冲液GD，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入700ul漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500y1漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200yl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。目的基因的PCR扩增反应参数为95。C预变性5分钟；95。C变性30秒，65r退火30秒，72。C延伸30秒，30个循环，72。C再延伸10分钟。提到的基因组DNA储存于-2(TC备用。(3)目的基因的PCR扩增反应体系为H20401^1，缓冲液5ri，dNTP2W，上游引物1W，下游引物1W，LATaq0.5W，pQE30模板0.5)4，反应参数为95。C预变性5分钟；95。C变15性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸40秒，30个循环，72。C再延伸IO分钟，结果见图4。(4)目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit说明书回收目的基因片段。首先制作1.0%琼脂糖回收胶，目的基因片段电泳，然后切下含目的基因条带的琼脂糖胶块，每100mg胶块加入300WBufferQG，5(TC水浴10分钟至胶块完全溶解，加入异丙醇(每100mg胶块加入100ri异丙醇)，将上诉液体加入到QIAquickspincolumn中，离心1分钟，倒掉离心后液体，QIAquickspincolumn中力口入500MlBufferQG，禺心1分钟，倒掉离心后液体，加入750,ufferPE，室温放置5分钟后离心1分钟，倒掉离心后液体，再离心1分钟彻底去除BufferPE，将QIAquickspincolumn放置在一个新的1.5mL离心管中，往QIAquickspincolumn中加入5(MBufferEB，离心1分钟，收集离心液，储存于-2(TC。(5)目的基因片段克隆入载体回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，该载体购自大连宝生物工程有限公司。反应体系为PCR产物5W，pMD18-T载体lW，10XT4DNA连接酶缓冲液1W，去离子水2ri，总体积为10W。16'C连接过夜。取连接产物10W加入到感受态细胞大肠杆菌(E.coli)JM109(全式金产品)中，冰上放置30分钟，42。C热休克45秒，再置冰上2分钟，加入SOC培养基50(mi，37°C，180rpm培养1小时，取200W菌液加入40ril20rag/mL5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及1M异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)混匀后涂含氨苄青霉素LB平板，培养过夜，挑取白色菌落快速提取质粒进行PCR鉴定，阳性克隆进行测序鉴定。(6)序列测定提取质粒DNA双脱氧法测定核苷酸序列，测定引物为M13启动子引物。cc3302序列测定结果序列长477个核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鸟嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为A-69、C-136、G-169、T_103。实施例4.芝田硫化叶菌sshlOb基因的PCR扩增(1)扩增引物合成根据GenBank中已经发表的芝田硫化叶菌的sshlOb基因序列设计PCR寡核苷酸扩增引物。上游引物(D-F):ggaggatctggaggatctggaggatctggaggatctATGGADUTATTGTTTAC(下划线处为GGS链)，下游引物(D-R):CTGTCTAGATTATTTAAAAAGAATTAT(下划线处为内切酶Xbal位点)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，经ULTRAPAGE纯化。(2)芝田硫化叶菌基因组DNA的提取芝田硫化叶菌在2ml液体培养基中培养，离心集菌后用天根公司细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取基因组DNA。首先将向菌体沉淀中加入200ul缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮，向管中加入20iil蛋白酶K溶液，混匀，向管中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加220yl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500u1缓冲液GD，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入700u1漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500ul漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200u1洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。目的基因的PCR扩增反应参数为95。C预变性5分钟；95。C变性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸30秒，30个循环，72。C再延伸IO分钟。提到的基因组DNA储存于-2(TC备用。(3)目的基因的PCR扩增反应体系为H2040W，缓冲液5W，dNTP2W，上游引物1W，下游引物1W，LATaq0.5W，pQE30模板0.5W，反应参数为95。C预变性5分钟；95。C变性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸30秒，30个循环，72。C再延伸10分钟，结果见图5。(4)目的基因片段的回收:按照Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit说明书回收目的基因片段。首先制作1.0%琼脂糖回收胶，目的基因片段电泳，然后切下含目的基因条带的琼脂糖胶块，每100mg胶块加入300WBufferQG，5(TC水浴IO分钟至胶块完全溶解，加入异丙醇(每100mg胶块加入异丙醇)，将上诉液体加入到QIAquick印incolumn中，离心1分钟，倒掉离心后液体，QIAquickspincolumn中加入500,ufferQG，离心1分钟，倒掉离心后液体，加入750WBufferPE，室温放置5分钟后离心1分钟，倒掉离心后液体，再离心1分钟彻底去除BufferPE，将QIAquickspincolumn放置在一个新的1.5mL离心管中，往QIAquickspincolumn中加入50,ufferEB，离心1分钟，收集离心液，储存于-2(TC。(5)目的基因片段克隆入载体回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，该载体购自大连宝生物工程有限公司。反应体系为PCR产物5ri，pMD18-T载体lPl，10XT4DNA连接酶缓冲液1W，去离子水3W，总体积为10W。16'C连接过夜。取连接产物10W加入到感受态细胞大肠杆菌(E.coli)JM109(全式金产品)中，冰上放置30分钟，42'C热休克45秒，再置冰上2分钟，加入SOC培养基500W，37°C，180rpm培养1小时，取200W菌液加入40W120mg/mL5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及非IO.1M异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)混匀后涂含氨苄青霉素LB平板，培养过夜，挑取白色菌落快速提取质粒进行PCR鉴定，阳性克隆进行测序鉴定。(6)序列测定提取质粒DNA双脱氧法测定核苷酸序列，测定引物为M13启动子引物。sshlOb序列测定结果序列长270个核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鸟嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为A-106、C-40、G-58、T-66。实施例5.融合穿梭表达载体pJRD215-PT-rcs的构建方法(1)cc3302-sshl0b的PCR扩增以含有cc3302基因的T载体质粒和含有sshlOb基因的T载体质粒为模板，以C-F和D-R为引物，反应体系为H2040W，缓冲液5W，dNTP2ri，上游引物lri，下游引物1W，LAT叫0.5W，两种模板各0.5W，反应参数为95。C预变性5分钟；95。C变性30秒，68。C退火30秒，72"C延伸60秒，30个循环，72"C再延伸10分钟。(2)PCR产物克隆至T载体按照Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit说明书回收目的基因片段。首先制作0.8%琼脂糖回收胶，目的基因片段电泳，然后切下含目的基因条带的琼脂糖胶块，每lOOmg胶块加入300PlBufferQG，5(TC水浴10分钟至胶块完全溶解，加入异丙醇(每100mg胶块加入异丙醇)，将上诉液体加入到QIAquickspincolumn中，离心1分钟，倒掉离心后液体，QIAquickspincolumn中力口入500MlBufferQG，离心1分钟，倒掉离心后液体，加入750WBufferPE，室温放置5分钟后离心1分钟，倒掉离心后液体，再离心1分钟彻底去除BufferPE，将QIAquickspincolumn放置在一个新的1.5mL离心管中，往QIAquickspincolumn中加入50则ufferEB，离心1分钟，收集离心液。回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，该载体购自大连宝生物工程有限公司。反应体系为PCR产物5^1，pMD18-T载体lW，10XT4DNA连接酶缓冲液1^1，去离子水3W，总体积为1(^1。16。C连接过夜。取连接产物加入到感受态细胞大肠杆菌(E.coli)JM109(全式金产品)中，冰上放置30分钟，42。C热休克45秒，再置冰上2分钟，加入SOC培养基50(mi，37°C，180rpm培养1小时，取20(M菌液加入4(M120mg/mL5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及1M异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)混匀后涂含氨苄青霉素LB平板，培养过夜，挑取白色菌落快速提取质粒进行PCR鉴定，阳性克隆进行测序鉴定，测序正确的即pMD18-T-cs。G)rpf-cc3302-sshlOb的PCR扩增以含有rpf基因的T载体质粒和含有pMD18-T-cs基因的T载体质粒为模板，以Bl-F和Dl-R为引物扩增得到rpf-cc3302-sshl0b。反应体系为H2040W，缓冲液5W，dNTP2W，上游引物1W，下游引物1W，LATaqO.5W，两种模板各0.5rt，反应参数为95'C预变性5分钟；95'C变性30秒，68'C退火30秒，72"延伸90秒，30个循环，72'C再延伸10分钟，结果见图6。(4)PCR产物克隆至T载体按照Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit说明书回收目的基因片段。首先制作0.8%琼脂糖回收胶，目的基因片段电泳，然后切下含目的基因条带的琼脂糖胶块，每lOOmg胶块加入300WBufferQG，5(TC水浴10分钟至胶块完全溶解，加入异丙醇(每100mg胶块加入异丙醇)，将上诉液体加入到QIAquickspincolumn中，离心1分钟，倒掉离心后液体，QIAquickspincolumn中力口入500MlBufferQG，离心1分钟，倒掉离心后液体，加入750WBufferPE，室温放置5分钟后离心1分钟，倒掉离心后液体，再离心1分钟彻底去除BufferPE，将QIAquickspincolumn放置在一个新的1.5mL离心管中，往QIAquickspincolumn中加入50,ufferEB，离心1分钟，收集离心液。回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，该载体购自大连宝生物工程有限公司。反应体系为PCR产物5Pl，pMD18-T载体1^1，10XT4DNA连接酶缓冲液1W，去离子水3W，总体积为10^1。16'C连接过夜。取连接产物10ri加入到感受态细胞大肠杆菌(E.coli)JM109(全式金产品)中，冰上放置30分钟，42。C热休克45秒，再置冰上2分钟，加入S0C培养基500W，37°C，180rpm培养1小时，取200W菌液加入鄭1120mg/mL5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及1M异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)混匀后涂含氨苄青霉素LB平板，培养过夜，挑取白色菌落快速提取质粒进行PCR鉴定，阳性克隆进行测序鉴定，测序正确的即pMD18-T-rcs。(5)表达质粒的线性化及回收用全式金EasyPurePlasmidMiniPr印Kit提取穿梭表达质粒pJRD215-PT。具体方法为取1-4ml过夜培养的细菌10，000Xg离心1分钟，尽量吸尽上清，加入250y1无色溶液RB(含RNaseA)，震荡悬浮细菌沉淀，加入250u1蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，加入350ul黄色溶液NB，轻轻混合5-6次，15，000Xg离心5分钟，小心吸取上清加入吸附柱中，15，OOOXg离心l分钟，弃流出液，加入650wl溶液WB，15，OOOXg离心l分钟，弃流出液，15，OOOXg离心l分钟，彻底去除残留的TO，将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50ulEB，室温静置1分钟，10，OOOXg离心l分钟，洗脱DNA，洗脱出的DNA用KpnI和XbaI双酶切成线性。(6)pMD18-T-rcs的线性化及rpf-cc3302-sshl0b的回收提取pMD18-T-rcs载体，方法同上，用Kpnl和Xbal双酶切成线性，用0.8%低熔点琼脂糖胶电泳后回收rpf-cc3302-sshlOb片段，回收按照Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit说明书进行，回收的片段置-2(TC保存备用；(7)连接回收的pJRD215-PT片段和rpf-cc3302-sshl0b片段在T4DNA连接酶的作用下16'C过夜，反应体系为rpf-cc3302-sshl0b片段5W，pJRD215-PT片段2ri，10XT4DNA连接酶缓冲液1W，去离子水2W，总体积为10ri。以得到重组穿梭表达载体pJRD215-PT-rcs。(8)转化用CaC12法制作感受态大肠杆菌S17-l，提取pJRD215-PT-rcs质粒，取100ri感受态大肠杆菌S17-l，加入1WpJRD215-PT-rcs质粒，按照分子克隆试验指南的方法进行转化，挑取克隆进行酶切鉴定，鉴定正确的即S17-1(pJRD215-PT-rcs)，酶切鉴定结果见图7。实施例6.氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株Wj'o/aci"i/s/erroanVa/^QEY-6(pJRD215-PT-rcs)的构建(1)氧化亚铁硫杆菌QEY-6和大肠杆菌S17-l(pJRD215-PT-rcs)的培养氧化亚铁硫杆菌用9K液体培养基培养，大肠杆菌用LB液体培养基培养；(2)接合转移大肠杆菌培养至对数生长末期，离心集菌后用接合培养基基础盐液洗涤3次，用该溶液稀释至2X1010/mL，氧化亚铁硫杆菌QEY-6培养至稳定期，100Xg的速度离心去除铁离子沉淀，离心集菌后再用接合培养基基础盐液洗涤3次，用该溶液稀释至2X1010/mL，将二者按l:l的比例混合，将O.lmL混合细菌转至已铺在接合培养基上的0.45Mra的滤膜上，3(TC培养60小时，将滤膜转至3mL2:2固体培养基的基础盐液中，铺在加入了300化/mL卡拉霉素的2:2选择培养基平板上，3(TC培养；(3)阳性克隆筛选挑取单克隆用加有300化/mL卡拉霉素的2:2液体培养基进行扩增，培养至稳定期，100Xg的速度离心去除铁离子沉淀，离心集菌后按照全式金公司的EasyPurePlasmidMiniPr印Kit的说明书提取质粒，酶切鉴定。得到的阳性克隆即氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株AcidithiobacillusferrooxidansQEY-6(pJRD215-PT-rcs)。酶切鉴定结果见图8。实施例7.氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株J"A'^LZ'o/^ci""s/erroojfit/朋sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)在铀矿浸出中的应用(1)氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株t/w'o6a7hs/erroaoV朋sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)耐铀性能研究将基因工程菌QEY-6(pJRD215-PT-rcs)和野生菌QEY-6按照10%接种量接种到含不同金属铀离子浓度(600mg/L，700mg/L，800mg/L，900mg/L)的9K培养基中，30°C，200rpm培养，用重铬酸钾容量法测定亚铁量的方法检测溶液中亚铁离子浓度变化，以亚铁离子浓度变为零作为氧化亚铁硫杆菌生长完成的时间，具体方法为用移液枪准确移取lmL待测溶液置于150mL三角烧瓶中，加入25mL硫酸-磷酸混合溶液，加49mL蒸馏水，滴加2滴二苯胺磺酸钠，用适当浓度的重铬酸钾溶液滴定至溶液呈稳定的紫红色即为终点。试验结果基因工程菌QEY-6(pJRD215-PT-rcs)在含600mg/L的培养基中2天可以完成生长，而野生菌QEY-6需要10天。而在700mg/L、800mg/L、900mg/L的培养基中，基因工程菌QEY-6(pJRD215-PT-rcs)的培养时间均为4天，野生菌QEY-6则分别需要14、17和30天。说明经过基因工程改造后氧化亚铁硫杆菌的耐铀性能大大提高。(2)氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株Jci力'z^^6acj'WiAS/erroow'c/朋sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)耐热性能研究将基因工程菌QEY-6(pJRD215-PT-rcs)和野生菌QEY-6按照10%接种量接种到9K培养基中，在不同温度(30°C，37°C,40°C)中200rpm培养，用重铬酸钾容量法测定亚铁量的方法检测溶液中亚铁离子浓度变化，以亚铁离子浓度变为零作为氧化亚铁硫杆菌生长完成的时间，具体方法为用移液枪准确移取lmL待测溶液置于150mL三角烧瓶中，加入25mL硫酸-磷酸混合溶液，加49mL蒸馏水，滴加2滴二苯胺磺酸钠，用适当浓度的重铬酸钾溶液滴定至溶液呈稳定的紫红色即为终点。试验结果基因工程菌QEY-6(pJRD215-PT-rcs)在正常培养温度(30°C)下比野生菌QEY-6的生长时间縮短了26.67%,在37。C时培养时间縮短33.33°/。，在40。C培养时间縮短46.67%。说明经过基因工程改造后氧化亚铁硫杆菌的耐热性能大大提高。(3)氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株JciWit/ioZaw7^AS/erroorirf^sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)在铀矿浸出中的应用a.试验柱以及恒流泵准备浸出柱①100mmX1000咖有机玻璃柱。20离子交换柱050ramX1000mm有机玻璃柱，离子交换树脂为D263。恒流泵HL-1。b.矿石的加工与处理①矿石破碎用PE-50型颚式破碎机将矿石破碎到较合适的粒度。②矿石过筛用孔径为10mm和7mm的筛子将破碎的矿石过筛，取粒径为7-10mm的矿石。③矿样縮分将矿样烘干自然冷却后混匀，运用锥堆四分法将矿样縮分到实验所需的重量的1.5倍，为22.5kg。④矿石分析取备用样测定矿石品位，为0.134%。⑤称取矿样称取15kg制备好的矿样装柱。在装柱的过程中由下向上依次加入30mm鹅卵石、30mm石英沙、矿石。c.试验工艺流程布液方式恒流泵控制喷淋。布液制度间歇式喷淋喷停比为2:1;液固比3:1;布液强度15L/(m2.h)。见图11。设置野生氧化硫杆菌浸出、氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株^io6aci^〃s/err。o;a'Ja/LSQEY-6(pJRD215-PT-rcs)浸出和酸浸三组。细菌浸铀包括酸预浸和菌浸两个阶段，其中酸预浸时间为16天。酸预浸阶段淋浸矿石所产生的酸化液和菌浸阶段淋浸矿石所产生的菌浸液，经离子交换柱吸附铀后，产生的吸附尾液用于培养细菌，培养的菌液再用于淋浸矿石。酸浸液起始pH值为0.75。菌浸液起始pH值为1.8，控制流出液pH值为2.0左右，菌浸液三价铁浓度为5g/L。d.试验结果试验结果见表l。表l不同浸出组浸出参数<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>浸出率结果见图12。耗酸率见图13。由以上结果可见，工程菌的铀浸出率可达92.7%，与酸浸相比高出5.2个百分点，比野生菌也高出1.7个百分点。工程菌的总耗酸率为4%，比酸浸降低1.01%，比野生菌的耗酸率相比也降低了0.63%。如果以87%作为浸出终点，那么，酸浸需要32天，野生氧化亚铁硫杆菌需要29天，基因工程菌株只需要22天。SEQUENCELISTING'No.1〈110〉南华大学铀矿冶生物技术国防重点学科实验室〈120〉一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用<130〉T5启动子的核苷酸序列〈160〉1'<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>123<212〉DNA<213〉plasmid<400>1tctagataattagctgagcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactc60catctggatttgttc卿acgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatgaa120Uc123SEQUENCELISTINGNo.2<110〉南华大学铀矿冶生物技术国防重点学科实验室<120>—种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用<130>TO终止子的核苷酸序列<160>1<170〉Patentlnversion3.3<210>1<211>123<212>DNA<213〉plasmid〈400>1tctagataattagctgagcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactc60catctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatgaa120ttc123SEQUENCELISTINGNo,3<110>南华大学铀矿冶生物技术国防重点学科实验室<120>—种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用<130〉藤黄微球菌卬f基因的核苷酸序列〈160〉1<170>Patentlnversion3.3<210>1〈211〉669<212>DNA<213>Micrococcusluteus<400>1atggacacca"tgactctcttcaccacttccgccacccgctcccgccgtgccaccgcctcg60atcgtcgcgggcatgaxxctcgccggcgccgccgccgtgggcttctccgccccggcccag.120gccgccaccgtggacacctg卿ccgcctcgccgagtgcgagtcc犯cggcacctgggac1806Ltc犯caccggc犯cggcttctacggcggcgtgcsgttcaccctgtcctcctggc郷cc240gtcggcggcg卿gctscccgcacc兆gcctcg犯ggccggCgCgCCg3g3003tcctccagg3CCtgC兆ggctggggcgcgtggccgctgtgctcgc卿agctgggcctg3603CCC3ggCtg3CgCgg3CgCcggtgacgtgg3CgCC3CCg3ggCCgCCCCggtcgccgtg420gagCgC3CggCC3CCgtgC3gcgccagtccgccgcggacgaggctgccgccgagc鄉cc480gctgccgcgg昭c郷ccgtcgtcgccga^ggccgagaccatcgtcgtcaagtccggtgac540tccctctggacgctcgccaacgagtacgaggtgg鄉gtggctggaccgccctctacgag600gccaacaagggcgccgtctccgacgccgccgtgatctacgtCggCC鄉6Lgctcgtcctg660ccgcaggcc669SEQUENCELISTINGNo.4<110>南华大学铀矿冶生物技术国防重点学科实验室〈120>—种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用<130>藤黄微球菌卬f基因的氨基酸序列<160>1〈170〉Patentlnversion3.3〈210>1<211>223〈212〉PRT<213>Micrococcusluteus〈400>1MetAspThrMetThrLeuPheThrThrSerAlaThrArgSerArgArg151015AlaThrAlaSerlieValAlaGlyMetThrLeuAlaGlyAlaAlaAla202530200910044070.6说明书第21/27页ValGlyPheSerAlaProAlaGinAlaAlaThrValAspThrTrp354045AsnArgLeu50AsnGly65ValGlyLysArgLeuCysAspVal130ThrVal145AlaAlaLysSerGlyGlyAlaAla210AlaGluCysGluPheTyrGlyGly70GlyGluGlyTyrAlaSer115AspGlu100GinGly85lieAlaGluGlyTrp195ValAsp180ThrSer55ValGlyThrTrpAlaThrGluGinArgGinSer150AlaGin165SerAlaLeulieTyrValGinPheThrProHisGinLeuGinAspLysLeuGlyAla135AlaLeu120AlaLeu105ThrAla90GinLeu75SerAsp60SerlieAsnThrGinAlaProValAlaAlaAspGluValValAlaLeuTrpThrTyrGly215Glu200GinLeu185AlaGlu170AlaAla155AlaGluLeuValSerTrpGinLysGlyTrpGlyAspAlaGl.uVal140AlaAla125GluAsnGluTyrAsnLysGlyLeu220Ala205ProAla110AspGin95Trp'AspGlyAla80lieProAlaGlyArgThrAlaAlaGluGinGluThrlieGlu190ValVal175ValAla160ValGluSerAspGinAlaSEQUENCELISTINGNo.5<110>南华大学铀矿冶生物技术国防重点学科实验室<120>—种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用<130>新月柄杆菌cc3302基因的核苷酸序列<160>1<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>477〈212〉DNA<213>Caulobactercrescentus<400>1atgtggcggtcgcctgtgcgatcactgcgcggcg鄉tcgaccgtcgtggcccgctttgc60ctggatc鄉gccttgcgctggggcttg卵cagttggcgctcggcttcgcgttgg3CttC'120C3CgCggC3CtggCCg33Cgggtgttgttgcgcagcttcgcgcggc卿g180cgtctcgccagcttgctggacgcgggccttg獄犯ggcggcctgggcggggttcgacag240gttcaggtcagacactgc犯tgctcacgcgcgggtcgctctcggaggcgttggcggcttg300cgtcaggcccaggaccggcacggcggcgaggctc鄉gtggcgacggtggtcaggctcat360gatg^cttgcgcatttg犯gta"tccctctggctgggcgctgttcgctgcgccgatg肌t420ttcgggttctcgcgsagtctcgttacacct477SEQUENCELISTINGNo.6<110>南华大学铀矿冶生物技术国防重点学科实验室〈120〉一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用〈130〉新月柄杆菌cc3302基因的氨基酸序列<160〉1<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>159〈212〉PRT〈213〉Caulobactercrescentus<400>1MetTrpArgSerProValArgSerLeuArgGlyGluLeuAspArgArg151015GlyProLeuCysLeuAspGinGlyLeuAlaLeuGlyLeuGlyGinLeu202530AlaLeuGlyPheAlaLeuAspPheHisAlaAlaLeuAlaGluArgHis354045lieGinGlyValValAlaGinLeuArgAlaAlaGluArgLeuAlaSer505560LeuLeuAspAlaGlyLeuGluGinGlyGlyLeuGlyGlyValArgGin65707580ValGinValArgHisCysAsnAlaHisAlaArgValAlaLeuGlyGly859095ValGlyGlyLeuArgGinAlaGinAspArgHisGlyGlyGluAlaGin100105110GlyGlyAspGlyGlyGinAlaHisAspGluLeuAlaHisLeuLysTyr11512012525ProSerGlyTrpAlaLeuPheAlaAlaProMetAsnlieGlyTyrlie130135140ArgValLeuAlaLysSerArgTyrThrSerValMetThrArgAsn145150155SEQUENCELISTINGNo.7<110>南华大学铀矿冶生物技术国防重点学科实验室〈120〉一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用<130>芝田硫化叶菌sshl0b基因的核苷酸序列<160>1〈170〉Patentlnversion3.3<210>1<211〉270〈212〉DNA<213>Sulfolobusshibatae<400>1atggacaatattgtttacgttggaaacaaaggcgtaatgaactacgtgcttgcagtgatt60actcaatttaactccgaaaatgcccaggaagtaatagtaaaagcgaggggcaaggcaatc120sgcagg'gccgttgatgttgaagasatggttacaaaaagattcatgcctga_agtcaaeiatt180aaagaaataaatttgggaactgaccatatacaaggagaagatggaaagtccattaacgta240tccacaatcgaaataattctttttaaataa270SEQUENCELISTINGNo.8〈U0>南华大学铀矿冶生物技术国防重点学科实验室〈120〉一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用<130>芝田硫化叶菌sshl0b基因的氨基酸序列<160>1〈170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉89〈212〉PRT〈213>Sulfolobusshibatae<400〉1MetAspAsnlieValTyrValGlyAsnLysGlyValMetAsnTyrVal151015LeuAlaVallieThrGinPheAsnSerGluAsnAlaGinGluVallie202530ValLysAlaArgGlyLysAlalieSerArgAlaValAspValGluGlu354045MetValThrLysArgPheMetProGluValLyslieLysGlulieAsn505560LeuGlyThrAspHislieGinGlyGluAspGlyLysSerlieAsnVal65707580SerThrlieGlulielieLeuPheLys85SEQUENCELISTINGNo.9<110>南华大学铀矿冶生物技术国防重点学科实验室<120>—种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用<130>rpf-cc3302-sshl0b核苷酸序列〈160〉1<170>Patentlnversion3.3<210>1〈211〉1488〈212〉DNA<213〉plasmid<400>13tggacacc8tgactctcttcaccacttccgccacccgctcccgccgtgccaccgcctcg60atcgtcgcgggcatgaccctcgccggcgccgccgccgtgggcttctccgccccggcccag120gccgccaccgtggacacctgggaccgcctcgccgagtgcgagtcc犯cggcacctgggac180atcaacaccggcaacggcttctacggcggcgtgC3gttC8Lccctgtcctcctggc鄉cc240gtcggcggcgaaggctacccgcaccaggcctcgaaggccgagcagatcaagcgcgccgag300atcctccaggacctgc鄉gctggggcgcgtggccgctgtgctcgcagaagctgggcctg360acccaggctgacgcggacgcCggtg3Cgtggacgccaccgaggccgccccggtcgccgtg420gagcgcacggccaccgtgcagcgccagtccgccgcggscgaggctgccgccgagcaggcc480gctgccgcggagcaggccgtcgtcgccg兆gccgagaccatcgtcgtcaagtccggtgac540tccctctggacgctcgcc肌Cg3gt8LCg3ggtggagggtggctggsccgccctctacgag600gccaac犯gggcgccgtctccgacgccgccgtgatctacgtcggccaggsgctcgtcctg660ccgcaggccggtggttcaggtggUc鄉tggttcaggtggttcaMgtggcggtcgcct.720gtgcga^tcactgcgcggcgagctcgaccgtcgtagcccgctttgcctggatcagggcctt780gcgctggggcttggscagttggcgctcggcttcgcgttggacttccacgcggcactggcc840g幼CgaC3t3tcc鄉gtgttgttgcgcagcttcgcgcggcagagcgtctcgccggcttg900ctggacgcgggccttgaacagggcggcctgggcggggttcgacetggttcaggtcagacac960tgcaatgctcacgcgcgggtcgctctcggaggcgUggcggcttgcgtcaggcccaggac1020cggcacggcggcgaggctcagggtggcgacgg"tggtcaggctcatgatgaacttgcgcat1080ttg朋gtatccctctggctgggcgctgttcgctgcgccgatgaa/tattggatacattcgg1140gttctcgcgaagtctcgttacacctcagtcatgacgcgtaatggtggttcaggtggttca1200ggtggUcaggtggttcaatggac犯tattgtttacgttggaa￡Lcaaeiggcgteatga^c1260tacgtgcttgcagtgattactccgaaaatgcccaggaagteiatagtaa犯1320gCg3ggggC33ggC幼tC兆c郷gccgttg3tgttg鄉aaaaagattc1380atgcctgaagttggg犯ctgaccatatacaaggaga卿t.1440ggaaagtccattaacgtatcC3c犯tcgaaataattcttt1488SEQUENCELISTINGNo,10<110〉南华大学铀矿冶生物技术国防重点学科实验室〈120〉一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用<130>rpf-cc3302-sshl0b编码的氨基酸序列<160>1〈170〉Patentlnversion3.3<210>1<211〉495<212>PRT<213>plasmid<400>1MetAspThrMetThrLeuPheThrTh:rSerAlaThrArgSerArgArg151015AlaThrAlaSerlieValAlaGlyMetThrLeuAlaGlyAlaAlaAla202530ValGlyPheSerAlaProAlaGinAlaAlaThrValAspThrTrpAsp354045ArgLeuAlaGluCysGluSerAsnGlyThrTrpAsplieAsnThrGly505560AsnGlyPheTyrGlyGlyValGinPheThrLeuSerSerTrpGinAla65707580ValGlyGlyGluGlyTyrProHisGinAlaSerLysAlaGluGinlie859095LysArgAlaGlulieLeuGinAspLeuGinGlyTrpGlyAlaTrpPro100105110LeuCysSerGinLysLeuGlyLeuThrGinAlaAspAlaAspAlaGlyAspSer115AspAlaThrGluVal130ValGinArgGinLeu120AlaProValAlaThr145AlaAlaAlaGluAla135AlaAlaAspGluAla125GluArgThrAlaLysSerGlyGlyGin165SerSer150AlaValValAlaVal140AlaAlaGluGinAla155AlaGluThrlieGlyAsp180ThrAla丄euLeuTrpThrTrp195VallieTyrValAlaAla210SerGlyGlySerGly225ValArgSerLeuTrpTyrGly215GlyGlu170AlaAsnGluTyrLeu185AlaAsnLysGlyGlu200GinGluLeuValGlu190ValVal175ValSerAla205ProGinAlaGly230GlyGluLeuSerGlyGlyArg245AlaLeuGlyLeuGlyAspLeu220MetTrpArgSerSer235ArgSerProLeuAspGinGlyLeu260HisAlaAlaLeuArg250GinLeuAlaLeuLeuAspPhe275LeuGly265GluArgHislieCys255PheAla160ValGluAspGlyPro240LeuAlaAlaGin290GluGinGlyGlyLeu305CysAsnAlaHisArgAlaAlaGlyAla280ArgLeuAlaGlyGly270GlyValValGlu295GlyGlyValArgGin285LeuAspAlaGlyLeu310ArgValAlaLeuAla325ArgHisGlyGlyGin315GlyLeu300ValGinValArgGinAlaGinAsp340AspGluLeuAlaGinAlaHis355AlaAlaProMetLeuSer385Phe370ArgTyrThrSerHis360lieGlu345LeuGly330AlaGinGlyValGlyGlyGlyGlyLeu335GlyHis320ArgGlyLysTyrAsp350GlyTrpAlaVal390AsnlieGly375MetThrArgAsnTyrProSer365ValLeuAlaLyslieGly395380GlySerGl.yGlySer400GlyGlySerGlyGlySer405GlyValMetAsnTyrVal420AsnAlaGinGluVallie435AlaValAspValGluGlu450LyslieLysGlulieAsn465470GlyLysSerlieAsnValMetAspAsnlieVal410LeuAlaVallieThr425ValLysAlaArgGly440MetValThrLysArg455LeuGlyThrAspHis475SerThrlieGlulieTyrValGlyAsnLys415GinPheAsnSerGlu430LysAlalieSerArg445PheMetProGluVal460lieGinGlyGluAsp480lieLeuPheLys48549049权利要求1、一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法，其特征在于用pJRD215-PT载体在氧化亚铁硫杆菌QEY-6中融合表达rpf、cc3302和ssh10b基因，包括(1)氧化亚铁硫杆菌QEY-6和大肠杆菌S17-1(pJRD215-PT-rcs)的培养；(2)接合转移；(3)阳性克隆筛选；该菌株为氧化亚铁硫杆菌AcidithiobacillusferrooxidansQEY-6(pJRD215-PT-rcs)，CCTCCM209156。2、根据权利要求1所述的一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法，其特征在于该制备方法包括下列步骤A、pQE30的T5启动子和TO终止子的扩增，并与pJRD215—起构建穿梭表达载体pJRD215-PT:以pQE30质粒为模板，根据T5启动子、TO终止子和穿梭质粒pJRD215上的克隆位点设计引物，回收PCR片段与酶切后的pJRD215连接得到pJRD215-PT并转化大肠杆菌JM109;B、藤黄微球菌rpf基因、新月柄杆菌cc3302基因和芝田硫化叶菌sshl0b基因的扩增并克隆至T载体根据藤黄微球菌rpf基因、新月柄杆菌cc3302基因和芝田硫化叶菌sshl0b基因和pJRD215-PT的酶切位点设计引物扩增片段，回收PCR产物，并分别克隆至pMD18-T载体，将这些重组载体分别转化大肠杆菌JM109;C、重组穿梭表达载体pJRD215-PT-rcs的构建提取pMD18-T-rpf、pMD18-T-cc3302和pMD18-T-sshlOb，以pMD18-T-cc3302和pMD18-T-sshlOb为模板，扩增cc3302-sshlOb融合基因，回收扩增片段后与pMD18-T连接得到pMD18-T-cs，再以pMD18-T-cs和pMD18-T-rpf为模板扩增得到rpf-cc3302-sshl0b融合基因片段，并克隆于PMD18-T载体，最后亚克隆至pJRD"5-PT载体得到pJRD215-PT-rcs，转化至大肠杆菌S17-l;D、融合表达rpf、cc3302和sshl0b基因的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株的构建培养氧化亚铁硫杆菌QEY-6和大肠杆菌S17-l(pJRD215-PT-rcs)，用接合转移的方法将pJRD215-PT-rcs转入氧化亚铁硫杆菌QEY-6，得到氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株/4c幼'tM由c^72仏s/"err曙油/2,QEY~6(pJRD215-PT-rcs)53、根据权利要求2所述的一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法，其特征在于；A、根据穿梭质粒pJRD215上的克隆位点设计T5启动子和T0终止子引物，T5启动子上游引物GGCGTCGACCTCGAGAMTCATAMAAAT(下划线处为内切酶SalI位点)，下游引物TATCTAGAACCCGGGGTACCGAGCTC(下划线处为内切酶Xbal位点)，TO终止子上游引物GTTCTAGATMTTAGCTGAGCTTGGACTC(下划线处为内切酶Xbal位点)，下游引物GGGMTTCATTCTCACCMTAAAAMCGCC(下划线处为内切酶EcoRI位点)；3、根据藤黄微球菌rpf基因、新月柄杆菌cc3302基因和芝田硫化叶菌sshlOb基因和pJRD215-PT的酶切位点设计引物，rpf上游引物(B-F):ATCGGTACCATGGACACCATGACTCTC(下划线处为内切酶Kpnl位点)，下游引物(B-R):tgaaccacctgaaccacctgaaccacctgaaccaccGGCCTGCGGCAGGACGAG(下划线处为GGS链)，cc3302上、游引物(C—F):ggtggttcaggtggttcaggtggttcaggtggttcaATGTGGCGGTCGCCTGTG(下划线处为GGS链)，下游引物(OR):agatcctccagatcctccagatcctccagatcctccATTACGCGTCATGACTGAG(下划线处为GGS链)，sshlOb上游引物(D-F):ggaggatctggaggatctggaggatctggaggatctATGGACMTATTGTTTAC(下划线处为GGS链)，下游引物(D-R):CTGTCTAGATTATTTAAAMGMTTAT(下划线处为内切酶XbaI位点)；4、根据权利要求1所述的一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法，其特征在于穿梭表达载体pJRD215-PT构建，具体方法为扩增引物合成，pJRD215和pQE30质粒的提取，T5启动子和TO终止子的扩增，目的基因片段的回收，测序鉴定。5、一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株在铀矿浸出中的应用，其特征在于(1)氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株力c/力Y力io6a"/7i/s/"erroox/t/朋sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)耐铀性能研究；(2)氧化亚铁硫杆菌基因工程菌菌株力c/rf/t6io6acj:77i/s/"erroooW朋sQEY-6(pJRD215-PT-rcs)耐热性能研究。全文摘要本发明公开了一种生长速度快且耐铀和耐热能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用，该菌株为AcidithiobacillusferrooxidansQEY-6(pJRD215-PT-rcs)，CCTCCM209156，首先是pQE30的T5启动子和T0终止子的扩增，并与pJRD215一起构建穿梭表达载体pJRD215-PT；其次是藤黄微球菌rpf基因、新月柄杆菌cc3302基因和芝田硫化叶菌ssh10b基因的扩增并克隆至T载体；第三是重组穿梭表达载体pJRD215-PT-rcs的构建；第四是融合表达rpf、cc3302和ssh10b基因的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株的构建。本发明操作简单，重复性好，可以缩短浸铀周期，提高浸出率，降低耗酸率。文档编号C12N15/74GK101659962SQ200910044070公开日2010年3月3日申请日期2009年8月10日优先权日2009年8月10日发明者丁德馨,劼刘,刘玉龙,李广悦,王有团,王永东,南胡申请人:南华大学