专利名称：非整合慢病毒载体系统及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及慢病毒载体系统及其制备与应用。
背景技术：
慢病毒作为一种特殊的逆转录病毒，与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点，并已经应用于多种疾病的基因治疗研究中。
典型的慢病毒载体系统为HIV-1载体系统，它由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
为了确保慢病毒载体的安全性、提高其滴度和转导能力，现有的研究从多个方面如包膜蛋白、包装成分、载体质粒等对其进行了改进。
最初的HIV-1载体颗粒，均由其本身的包膜蛋白Env所包裹，仅对CD4+的细胞具有亲嗜性。1996年，Trono课题组的Naldini等设计的HIV-1载体系统采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。这样做的结果至少具有三个方面的积极意义①包膜的更换进一步降低了HIV-1载体恢复成野生型病毒的可能；②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞；③VSV的包膜赋予HIV载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。Naldini等已使HIV-1载体滴度由105转录单位(TU)/ml达到108TU/ml。这样的改进无疑是HIV载体系统走向应用而迈出的一大步。Naldini等在构建包装质粒pCMV ΔR9和pCMV ΔR8.2时，分别在env基因阅读框架前插入了多个终止密码子或删除了env基因中1.4kp的序列，代之以终止密码子，以阻止env基因的表达。在此基础上，Zufferey等将包装质粒上表达调节蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4个基因分别删除或联合删除，结果发现它们对于产生HIV-1载体颗粒是非必需的，即使完全删除，得到的载体颗粒仍具备转导非分裂细胞的能力。这4个调节蛋白或已被证实、或被高度怀疑是构成HIV毒性的因素，将其删除、加上包膜蛋白的替换，可使制备HIV载体过程中产生野生型病毒的可能必微乎其微。载体质粒上HIV-1的顺式序列通常包括两端的LTR、剪切位点及包装信号Ψ等。此外，研究表明，gag基因5′端的序列可提高载体RNA的包装效率；Rev蛋白需要与Rev反应元件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核转运到胞浆。因此，Naldini等在载体上保留了gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了产生载体颗粒的能力。
但是，由于现有的慢病毒载体均具有整合特性——将携带的基因随机地整合至宿主细胞基因组中，因此可能会导致宿主细胞自身的基因表达发生变化，这将严重的影响该载体在基因治疗中的应用，因此，需要具有非整合特性的慢病毒载体来解决这一问题。
目前，国内外无任何提供非整合慢病毒载体的生产厂家。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有非整合特性的慢病毒载体。
本发明的基本思路是通过突变慢病毒载体系统中的整合酶基因，从而获得具有非整合特性的慢病毒载体。
本发明的最核心的技术关键是通过分子克隆的方法将pHelper1.0载体中HIV整合酶基因第257-259位氨基酸的编码基因由HIV原始氨基酸IKV的编码基因突变为AAH的编码基因，经过突变后包装获得的慢病毒具有非整合的特性。
本发明公开了一种非整合慢病毒载体系统，包括pLVTH载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体及宿主细胞，将载体系统中的pLVTH载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞后，即可在宿主细胞中包装获得非整合慢病毒载体。
上述宿主细胞为293T细胞。
pLVTH载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)，通常根据不同的实验目的针对pLVTH载体进行改造，例如通过分子克隆的方法在该载体中插入特殊启动子序列以进行启动子活性研究，插入特殊的基因序列进行基因表达的研究，插入特殊的RNA干扰序列进行RNA干扰实验研究等。pLVTH载体可以通过addgene网站购得。
pHelper 1.0载体由pCMV-dR8.2 dvpr改造获得，通过将pCMV-dR8.2 dvpr中的HIV整合酶基因第257-259位氨基酸由HIV原始氨基酸IKV突变为AAH后获得，pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码合成160kD的gag-pol前体蛋白，从N端至C端分别产生蛋白酶、逆转录酶、核糖核酸酶H及整合酶；rev基因编码一种96kD的磷蛋白，主要定位于核内，rev结合于RRE，促使病毒转录出各种mRNA，由细胞核进入胞浆，并使其保持稳定；RRE元件，为Rev反应元件，能够明显地增加报告基因的表达。pCMV-dR8.2dvpr载体可以通过addgene网站购得。
HIV整合酶由pol基因编码，pHelper 1.0载体中整合酶基因Int的序列如下 tttttagatggaatagataaggcccaagaagaacatgagaaatatcacagtaattggagagcaatggctagtgatttt aacctaccacctgtagtagcaaaagaaatagtagccagctgtgataaatgtcagctaaaaggggaagccatgcatgga caagtagactgtagcccaggaatatggcagctagattgtacacatttagaaggaaaagttatcttggtagcagttcat gtagccagtggatatatagaagcagaagtaattccagcagagacagggcaagaaacagcatacttcctcttaaaatta gcaggaagatggccagtaaaaacagtacatacagacaatggcagcaatttcaccagtactacagttaaggccgcctgt tggtgggcggggatcaagcaggaatttggcattccctacaatccccaaagtcaaggagtaatagaatctatgaataaa gaattaaagaaaattataggacaggtaagagatcaggctgaacatcttaagacagcagtacaaatggcagtattcatc cacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacata caaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtt tggaaaggaccagcaaagctcctctggaaaggtgaaggggcagtagtaatacaagataatagtgacGCCGCACACgtg ccaagaagaaaagcaaagatcatcagggattatggaaaacagatggcaggtgatgattgtgtggcaagtagacaggat gaggatt(SEQ ID NO1) pCMV-VSV-G载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。pCMV-VSV-G载体可以通过addgene网站购得。
本发明第二方面，公开了一种非整合慢病毒载体的制备方法，步骤如下 1.将pCMV-dR8.2 dvpr载体的HIV整合酶基因第257-259位氨基酸由HIV原始氨基酸IKV突变为AAH获得pHelper1.0载体； 2.将pLVTH载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞； 3.培养宿主细胞，收获含有病毒颗粒的细胞培养液； 4.从含有病毒颗粒的细胞培养液中分离纯化病毒颗粒。
本发明第三方面，公开了上述非整合慢病毒载体系统的使用方法，包括下列步骤 1.将目的基因克隆入pLVTH载体获得重组pLVTH载体； 2.将重组pLVTH载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞； 3.培养宿主细胞； 4.分离获得整合入目的基因的非整合慢病毒载体。
本发明的非整合慢病毒载体系统能够提供高效的基因转移、长期的基因表达，广泛的宿主细胞，并且不能将携带的基因随机地整合到宿主基因组中，为基因治疗提供了一种新方法。
图1目的基因真核表达载体构建流程图 图2pCMV-dR8.2 dvpr载体结构图 图3载体酶切图谱 条带1250bp Marker(5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp) 条带2pCMV-dR8.2 dvpr载体 条带3pCMV-dR8.2 dvpr载体Swa I/Sac I酶切产物 图4PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱 M5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp 图5PCR片段酶切电泳结果图 条带1PCR片段酶切产物 条带2Marker5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp 图6阳性克隆的PCR鉴定流程图 图7PCR阳性克隆鉴定图片 条带3为Marker。
图8测序结果图 图9非整合慢病毒载体系统的分离步骤示意图 图10GFP非整合慢病毒和常规的GFP慢病毒感染293T细胞结果图 虚线表示常规GFP慢病毒感染后的细胞样品；实线表示改造后的慢病毒感染293T细胞样品 图11RFP非整合慢病毒和常规的GFP慢病毒感染293T细胞结果图 虚线表示常规RFP慢病毒感染后的细胞样品；实线表示改造后的RFP慢病毒感染293T细胞样品 图12pLVTH载体图谱 图13pHelper 1.0载体图谱 图14pCMV-VSV-G载体图谱 图15PCR反应循环条件1 图16PCR反应循环条件2 图17PCR反应循环条件3 图18PCR反应循环条件4
具体实施例方式 下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1非整合慢病毒载体系统的制备 1载体的制备 1.1实验流程描述 从含有HIV整合酶基因的质粒pCMV-dR8.2 dvpr质粒模板中，利用PCR方法钓取目的基因，将目的基因与目的载体分别进行酶切。纯化酶切产物后进行定向连接，其产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行PCR鉴定，其上下游引物分别设计在载体和目的基因上，PCR鉴定为阳性的克隆，证明目的基因已经定向连入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体。将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提。
1.2 实验流程图(如图1所示) 1.3 真核表达载体的线性化 1.3.1 真核表达载体信息 pCMV-dR8.2 dvpr载体结构于见图2 1.3.2 真核表达载体酶切 使用Swa I和Sac I进行酶切消化 酶切反应体系 将上述混合的反应物置于37℃，1h。
载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱见图3 1.3.3 引物合成(送上海吉凯基因化学技术有限公司合成) 目的基因引物F AAGACTCCTAA
TACCCATA(SEQ ID NO2) 引物说明含保护碱基(下划线标示的碱基)和Swa I酶切位点(双下划线表示的碱基)，并含有目的基因5’端部分序列(无下划线标示的碱基)，用于PCR钓取目的基因目的基因引物R CTGACTGTTCTGAT
TTC(SEQ ID NO3) 引物说明含保护碱基(下划线标示的碱基)和Sac I酶切位点(双下划线表示的碱基)，并含有目的基因3’端部分序列(无下划线标示的碱基)，用于PCR钓取目的基因目的基因突变引物F AGTGACGCCGCACACGTGCCAAGAAGAAAA(SEQ ID NO4) 引物说明用于在目的位点引入目标突变 目的基因突变引物R TGGCACGTGTGCGGCGTCACTATTATCTA(SEQ ID NO5) 引物说明用于在目的位点引入目标突变 测序引物R GTAGTGCCAGCCGCACAC(SEQ ID NO6) 引物说明该引物用于PCR鉴定目的基因定向连接的阳性克隆菌落 测序引物F AAGACTCCTAA
TACCCATA(SEQ ID NO7) 引物说明该引物用于该引物用于PCR鉴定目的基因定向连接的阳性克隆菌落以及测序 1.4 PCR获得目的基因片段 PCR反应体系 PCR引物说明 A片断的获取 Primer(+)目的基因引物F Primer(—)目的基因突变引物R PCR仪进行反应，按图15所示循环条件。
PCR产物大小1326bp B片断的获取 Primer(+)目的基因突变引物F Primer(—)目的基因引物R PCR仪进行反应，按图16所示循环条件。
PCR产物大小371bp 全长片断的获取 Primer(+)目的基因引物F Primer(—)目的基因引物R PCR仪进行反应，按图17所示循环条件。
PCR产物大小1677bp PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱见图4。
酶切PCR片段 使用Swa I/EcoR I进行酶切消化 酶切反应体系 将上述混合的反应物置于37℃，1h。
PCR片段酶切电泳结果见图5。
1.5 重组克隆制备 PCR酶切产物连接入酶切真核表达载体 连接反应体系 于4℃ 12小时连接反应，制备克隆连接液，准备转化 感受态制备 配置下述溶液 1)0.1M CaCl2溶液，以0.45过滤除菌。
2)250mM KCl2溶液。
3)2M MgCl2溶液，高压灭菌。
4)SOB1ml250mM KCl2溶液加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl2溶液。
用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞 5)从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转/分)。
6)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。
7)于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
8)倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。
9)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。
10)于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
11)倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。
12)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀。
13)将细胞分装成小份，放于-70℃冻存。
(感受态细胞制备参考分子克隆实验指南第二版55页) 转化 1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。
2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。
3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1—2分钟。
4)每管加800μlLB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。
5)将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和kan抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上。
6)将平板置于室温直至液体被吸收。
7)倒置平皿，于37℃培养，16小时。
8)长出的克隆进行后续PCR鉴定。
(转化操作参考分子克隆实验指南第二版55-56页) 1.6 阳性克隆的PCR鉴定(流程图参见图6) PCR反应体系 试剂 阴性对照组 阳性对照组 鉴定组1 鉴定组2 鉴定组3 鉴定组4 鉴定组n (μl)(μl) (μl) (μl) (μl) (μl)(μl) Primer(+) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 Primer(—) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 ddH2O 15.7 14.7 14.7 14.7 14.7 14.7 14.7 10×buffer 2222222 MgCl2(1.5mM)0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 DNTPs(2.5mM)0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 Taq polymerase 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Template— 111111 Total 20 20 20 20 20 20 20 PCR引物说明 Primer(+)测序引物R Primer(—)测序引物F PCR仪进行反应，按图18所示循环条件。
1.菌落PCR模板在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB，混匀取1μl作为模板； 2.阴性对照排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果； 3.阳性对照以确定的含有引物要钓取的其他目的基因的载体作为模板，如GAPDH基因，以排除PCR反应体系的异常造成的假阴性结果。
PCR产物大小375bp 电泳鉴定PCR产物
阳性克隆鉴定图片如图7所示。
阳性克隆送测序 1.7 阳性克隆测序结果及结果分析(如图8所示) 比对说明Query是我们得到的测序结果；Sbjct是目标基因序列；Identities＝558/565(98％)。
比对结果显示，构建的克隆就是目标突变克隆.由pCMV-dR8.2dvpr突变获得的质粒更名为pHelper 1.0. 2.DNA提取方法 pLVTH、pHelper 1.0、pCMV-VSV-G质粒DNA溶液的制备以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的水中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。具体操作内容如下 准备工作 1)新开瓶Buffer P1使用前加入RNase A solution(100μg/ml)，然后储存在4℃冰箱中备用； 2)检查Buffer P2是否有沉淀，如有沉淀需要37℃加热，使溶液澄清； 3)Buffer P3于4℃预冷； 4)每个需要抽提的单克隆需要2个250ml离心瓶，4个50ml离心管，10ml移液管若干。
操作步骤 1)选择测序鉴定正确的克隆，将保存的正确的单克隆菌液接种于2-5ml抗性(A mp终浓度100μg/ml)LB培养基中，37℃培养8小时； 2)取上述单克隆培养菌液500μl，扩大培养于300ml抗性LB中，37℃培养12-16小时； 3)250ml离心瓶收集菌液，两次，每次150ml，灭菌水配平后6000g，4℃，离心15分钟； 4)倾倒上清后，倒置于吸水纸上控干，然后加入10ml Buffer P1，吹吸混匀至无大块聚集的菌体，呈均匀悬浊液，转移入新的50ml离心管； 5)加入10ml Buffer P2，轻柔振荡摇匀，室温下放置5分钟，注意要严格控制裂解时间； 6)加入10ml预冷的Buffer P3，立即轻柔混匀，置于冰上15-20分钟，中间间隔轻柔晃动3-5次； 7)用Buffer P3配平后，20000g，4℃，离心30分钟； 8)取上清于新的50ml离心管中，用Buffer P3配平后，20000g，4℃，离心30分钟； 9)在上述离心过程中，预先准备好QIAGEN-tip 500的柱子，用20ml Buffer QBT洗柱； 10)将8中离心得到的上清液，用1ml移液器小心加入到柱子中，特别注意不要吸到蛋白沉淀； 11)待8中离心得到的上清液完全过柱后，用30ml Buffer QC过柱清洗两次； 12)用15ml Buffer QF洗脱柱子中的质粒DNA，待最初的10-15滴QF洗脱液流尽后，收集其余的QF洗脱液于新的50ml离心管中； 13)加入10.5ml异丙醇于洗脱液中，混匀后，15000g，4℃，离心30分钟； 14)小心倒去上清，注意不要丢失质粒DNA沉淀，然后加入10ml 70％酒精洗涤，15000g，离心10分钟； 15)小心倒去上清，注意不要丢失质粒DNA沉淀，在已经灭好菌的超净台中晾干，500μl专用灭菌TE溶解，转移入1.5ml离心管，测浓度，做好标记和记录，-20℃保存。
3.细胞培养 293T细胞培在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中生长，培养条件为37℃、5％ CO2。细胞传代方法如下 1)弃去旧培养液，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。
2)加入2ml胰酶消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来。
3)加入含10％胎牛血清和100U/ml青链霉素的DMEM培养基5ml，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。
4)混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。
细胞株的冻存 1)取培养2～3天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106～2×107/ml。
2)在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜(或甘油)，混匀后密封。置4℃ 1小时，-20℃ 2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。
细胞复苏 1)从液氮罐中取出细胞冻存管。
2)迅速放入盛有37℃水的水浴中解冻。
3)用70％酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml含10％FBS的DMEM培养基，置温箱培养。
4)次日更换一次培养液后再继续培养。
4.载体转染293T细胞 转染原理基于脂质体(Lipofectamine2000，Invitrogen)介导的DNA转染法，具体方法如下 1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.2×107细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5％ CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。
3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pLVTH载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pCMV-VSV-G载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟。
4)将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取100μl Lipofectamine2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。
5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。
6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。
7)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
8)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，10)轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
9)每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25ml，于37℃、5％ CO2培养箱内继续培养48小时。
5、非整合慢病毒载体系统的分离(如图9所示) 根据慢病毒载体的特性，使用Millipore超滤装置
Plus-20的方法进行浓缩和纯化。具体方法如下 1)收集转染后48小时(转染即可为0小时计起)的293T细胞上清液。
2)于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。
3)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中(如图9A所示)。
4)组合好后，做好平衡，放在转头上。
5)在4000×g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开(如图9B所示)。
6)将过滤杯倒扣在样品收集杯上(如图9C所示)。
7)离心力不超过1000g，时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把离心杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。如图9D所示 8)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80度长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。(如图9E所示) 6、非整合慢病毒载体滴度测定 1)测定前一天，为测定滴度所需的细胞(293T细胞)铺板，96孔板，每个孔加4×104个细胞，体积为100μl。
2)根据病毒的预期滴度，准备7～10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl的无血清培养基。取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。
3)选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。
4)24小时后，加入完全培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞。
5)4天后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。
5)滴度计算根据带有荧光的细胞来推算病毒滴度，例如，在加入1E-6μl病毒原液的孔中观察到2个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是2/(1E-6)＝2E+6，单位为TU/μl，也就等于2E+9TU/ml。
实施例2实施例1非整合慢病毒载体非整合性的证实试验 例1，GFP常规慢病毒和GFP非整合慢病毒比较 1.将GFP基因克隆入pLVTH载体 步骤通过PCR的方法调取目的基因GFP，酶切PCR产物和pLVTH载体，通过DNA连接酶连接酶切后产物，获得重组质粒；将重组质粒转化入感受态细胞，通过PCR的方法筛选阳性克隆细胞株，进一步通过测序再次鉴定阳性克隆株中插入的序列是否正确；对于正确的阳性克隆株扩大培养，抽提质粒，获得pGC GFP LV重组质粒DNA。
2.按照实施例1中步骤3-5的方法获得GFP非整合慢病毒(mutant GFP LV)。
3.按照实施例1中步骤3-5的方法，唯一不同的是以pCMV-dR8.2 dvpr载体替代pHelper 1.0载体获得常规的GFP慢病毒(wild type GFP LV)。
4.将步骤2和3制得的GFP非整合慢病毒和常规的GFP慢病毒感染293T细胞，通过流式细胞仪器检测不同时期带有GFP的细胞比例验证改造后系统所生产的病毒的非整合性。
实验过程 分别取等量(1E+6TU)的GFP非整合慢病毒(mutant GFP LV)和常规的GFP慢病毒(wildtype GFP LV)感染293T细胞(1E+6个)，感染后的第4天，6天，10天，15天，25天，50天分别通过流式细胞仪检测表达GFP的细胞个数。
实验结果如图10所示。
相对于常规慢病毒而言，改造后的慢病毒在15天左右GFP表达的细胞个数已经降至10％左右，比常规慢病毒的感染的GFP阳性细胞个数少80％以上。说明改造后的慢病毒具有非整合性。
例2，RFP常规慢病毒和RFP非整合慢病毒比较 1.将RFP基因克隆入pLVTH载体 步骤通过PCR的方法调取目的基因RFP，酶切PCR产物和pLVTH载体，通过DNA连接酶连接酶切后产物，获得重组质粒；将重组质粒转化入感受态细胞，通过PCR的方法筛选阳性克隆细胞株，进一步通过测序再次鉴定阳性克隆株中插入的序列是否正确；对于正确的阳性克隆株扩大培养，抽提质粒，获得pGC RFP LV重组质粒DNA。
2.按照实施例1中步骤3-5的方法获得RFP非整合慢病毒(mutant RFP LV)。
3.按照实施例1中步骤3-5的方法，唯一不同的是以pCMV-dR8.2dvpr载体替代pHelper 1.0载体获得RFP常规慢病毒(wild type RFP LV)。
4.将步骤2和3制得的RFP非整合慢病毒和RFP常规慢病毒感染293T细胞，通过流式细胞仪器检测不同时期带有GFP的细胞比例验证改造后系统所生产的病毒的非整合性。
实验过程 分别取等量(1E+6TU)的RFP非整合慢病毒(mutant RFP LV)和常规的GFP慢病毒(wildtype RFP LV)感染293T细胞(1E+6个)，感染后的第4天，6天，10天，15天，25天，50天分别通过流式细胞仪检测表达RFP的细胞个数。
实验结果如图11。
实验结论 相对于常规慢病毒而言，改造后的慢病毒在15天左右RFP表达的细胞个数已经降至10％左右，比常规慢病毒的感染的RFP阳性细胞个数少70％左右。说明改造后的慢病毒具有非整合性。
序列表
<110>上海吉盛制药技术有限公司
<120>非整合慢病毒载体系统及其制备与应用
<130>PCNJK081183
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>865
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>突变后的整合酶基因
<400>1
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>2
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>3
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>4
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>5
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>6
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>权利要求
1.一种非整合慢病毒载体系统，包括pLVTH载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体及宿主细胞，将载体系统中的pLVTH载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞后，即在宿主细胞中包装获得非整合慢病毒载体。
2.如权利要求1所述非整合慢病毒载体系统，其特征在于，所述pHelper 1.0载体为将pCMV-dR8.2dvpr载体中的HIV整合酶基因第257-259位氨基酸的编码基因由IKV的编码基因突变为AAH的编码基因后获得。
3.如权利要求2所述非整合慢病毒载体系统，其特征在于，所述pHelper 1.0载体包括HIV病毒的gag基因、pol基因和rev基因。
4.如权利要求2所述非整合慢病毒载体系统，其特征在于，pHelper 1.0载体中，HIV整合酶基因序列为SEQ ID NO1。
5.如权利要求1所述非整合慢病毒载体系统，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞。
6.一种非整合慢病毒载体的制备方法，包括下列步骤
a、将pCMV-dR8.2dvpr载体的HIV整合酶基因第257-259位氨基酸的编码基因由IKV突变为AAH，获得pHelper 1.0载体；
b、将pLVTH载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞；
c、培养宿主细胞；
d、分离获得非整合慢病毒载体。
7.如权利要求6所述非整合慢病毒载体的制备方法，其特征在于所述pHelper 1.0载体中，HIV整合酶基因序列为SEQ ID NO1，所述宿主细胞为293T细胞。
8.如权利要求1-5中任一权利要求所述非整合慢病毒载体系统的使用方法，包括下列步骤
a.将目的基因克隆入pLVTH载体；
b.将pLVTH载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞；
c.培养宿主细胞；
d.分离获得整合入目的基因的非整合慢病毒载体。
全文摘要
本发明公开了一种非整合慢病毒载体系统及其制备与应用，本发明的非整合慢病毒载体系统包括pLVTH载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体及宿主细胞，将载体系统中的pLVTH载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞后，即在宿主细胞中包装获得非整合慢病毒载体。本发明的非整合慢病毒载体系统能够提供高效的基因转移、长期的基因表达，广泛的宿主细胞，并且不能将携带的基因随机地整合到宿主基因组中，为基因治疗提供了一种新方法。
文档编号C12N15/867GK101532031SQ20091004694
公开日2009年9月16日 申请日期2009年3月3日 优先权日2009年3月3日
发明者曹跃琼, 博 高, 逄淑召, 静 郑 申请人:上海吉盛制药技术有限公司