专利名称：一种烟酰胺单核苷酸的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，特别涉及一种烟酰胺单核苷酸在制备抗脑卒或抗 缺氧缺糖导致的神经元细胞损伤的药物或保健食品中的应用。
背景技术：
缺血性脑卒中的发病机制复杂，严重危害人类健康，因此，寻求理想的 脑卒中治疗药物一直是心脑血管医药领域研究的热点之一。脑卒中治疗药物 中以溶栓剂、神经保护剂为主。现有的脑卒中治疗药物的不足之处主要在于 治疗时间窗短、安全性不够、效果不够确实。而且，绝大部分药物是从降低 脑梗死发生后产生的损害因子方面考虑，从增强机体本身的保护因子方面考 虑的药物很少。
烟醜胺单核昔酸(英文名nicotinamide mononucleotide, NMN)是体内 存在的一种内源性物质，也可以通过体外化学合成。目前，对于烟酰胺单核 苷酸的研究极少，除了一篇在2007年的美国著名学术期刊《Cdl Metabolism》 上发表的论文(Revollo， JR et al. Nampt/PBEF/Visfatin Regulates Insulin Secretion in p Cells as a Systemic NAD Biosynthetic Enzyme. CW/ M"C"6o,/s附， 6 (5): 363-75 (2007))提到使用烟酰胺单核苷酸可以改善Nampt杂合子敲除小 鼠的胰岛素分泌功能之外，没有查询到这种化合物在治疗应用中的其他用 途。在脑卒中研究领域中，亦没有任何相关文献。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的抗脑卒中药物存在的治 疗时间窗短、安全性低、效果不够确实的不足，提供一种烟酰胺单核苷酸的新用途和一种新的药物组合物。
本发明人经过大量试验研究，惊喜地发现，烟酰胺单核苷酸具有抗脑卒 中和抗神经元损伤(即保护神经元细胞)的作用，经过进一步的仔细研究和 大量试验，终于完成了本发明。
因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是烟酰胺单核 苷酸在制备防治脑卒中的药物或保健品中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是烟酰胺单核苷酸在 制备抗神经元细胞损伤的药物或保健品中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是 一种药物组合物， 其含有药物活性成分烟酰胺单核苷酸和药学上可接受的辅料。
根据本发明，术语"脑卒中"是指脑血管疾病，俗称中风，通常分为缺 血性或出血性脑卒中，前者又包括脑梗死、脑栓塞以及短暂性脑缺血发作 (TIA，俗称小中风)，后者则包括脑出血和蛛网膜下腔出血。而脑卒中均可 产生缺血缺氧导致的脑细胞特别是神经元细胞的损伤，进而出现相应功能障 碍等临床症状。
本发明的体外试验显示出烟酰胺单核苷酸具有抗缺氧缺糖导致的神经 元细胞损伤而保护神经元细胞的功效。而以缺血性脑卒中为例，体内动物试 验也证实了烟酰胺单核苷酸具有縮小脑梗死范围、降低梗死区和梗死边缘区 的脑细胞凋亡/死亡数目，进而治疗脑梗死的作用。
本发明中，所述的烟酰胺单核苷酸是人体内存在的一种内源性物质，也 可以人工合成，或者是直接市购的商品。烟酰胺单核苷酸的化学结构式如 C I )所示<formula>formula see original document page 5</formula>( I )本发明中，所述的药学上可接受的辅料是指药学领域常规的药物辅料， 其中，稀释剂、赋形剂如水等；粘合剂如纤维素衍生物、明胶或聚乙烯吡咯 烷酮等；填充剂如淀粉等；崩裂剂如碳酸钙或碳酸氢钠；也可以在组合物中 加入其他辅助剂如香味剂和/或甜味剂。本发明中，所述的药物组合物可采用医学领域常规的方法，将烟酰胺单 核苷酸作为活性成分，与药学上可接受的辅料制成各种剂型。当用于口服时， 可将其制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂或胶囊剂等；用于注射时，可将 其制备成注射液。在各种制剂中，活性成分的重量含量为0.1% 99.9%，优 选的重量含量为0.5 90%。本发明的药物组合物可以用于抗脑卒中和抗缺氧缺糖导致的神经元细 胞损伤。可以按剂型通过口服、腹腔注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、 淋巴结内注射、粘膜用药等途径应用于需要治疗的个体。个体可以是人或动 物。剂量一般为1 1000mg/公斤体重/天，具体可根据个体的年龄、病情等 进行变化。本发明除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。 本发明所用的原料或试剂均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明提供了一种新的药物 组合物，其可以有效地防治脑卒中和保护神经元细胞。这对脑卒中的医治具 有重大意义。并且该药物组合中的活性成分是烟酰胺单核苷酸，烟酰胺单核 苷酸本身是机体内源性的保护物质，从目前的资料来看不会产生副作用，因 此作为药物的安全性很高，治疗窗宽。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1是给药组和对照组大鼠脑梗死范围检测的照片。图2是给药组和对照组大鼠脑细胞凋亡/死亡检测的照片。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建 议的条件。实施例1烟酰胺单核苷酸降低缺氧缺糖对神经元细胞的损害制备缺氧缺糖神经元细胞损伤模型，过程如下将胚鼠(Sprague-Dawley大鼠，上海斯莱克实验动物有限公司)取出，分离大脑 皮层和海马，消化后悬浮，再铺板，经过抑制神经胶质细胞生长后，神经元 细胞培养成功；然后改成HBSS无糖培养基，加入10 nM的FK866[英文名 为(E)-N画[4画(1画benzoylpiperidine-4-yl)butyl] -3 -(pyridin-3 -yl)acrylamide ，暂无中 文名，化合物CAS号201034-75-5，此药物从瑞士 Apoxis公司获得]，放入 缺氧培养箱，使得氧含量低于0.5% (v/v)，在体外模拟脑缺血状态，与此同 时给予300 的烟酰胺单核苷酸(购自Sigma-Aldrich公司，使用前用PBS 稀释到300 )^Mol/L)。对照组给予PBS液。培养24小时后，分别采用三种 不同的方法评价烟酰胺单核苷酸对神经元细胞的保护作用，每种方法重复6 次。结果表明，烟酰胺单核苷酸可以防止缺氧缺糖导致的神经元数目减少(表 1);烟酰胺单核苷酸可以防止缺氧缺糖导致的神经元细胞活力降低(表2); 烟酰胺单核苷酸可以防止缺氧缺糖导致的神经元细胞乳酸脱氢酶释放(表 3)。这些结果说明，烟酰胺单核苷酸具有神经保护作用，可以降低缺氧缺糖 对离体培养的神经元细胞损伤。表l.烟酰胺单核苷酸防止缺氧缺糖导致的神经元数目减4对照组(n=6)给药组(n=6)神经元数目10.0±1.117.5±1.4 ****表示给药组和对照组相比较，有显著的统计学差异(P<0.01)。注神经元数目使用MAP-2免疫荧光法测定。数目越多，表明神经元 细胞存活得越多。MAP-2免疫荧光法测定法可参见文献Shyu WC, et al. Secretoneurin promotes neuroprotection and neuronal plasticity via the Jak2/Stat3 pathway in murine models of stroke. / C7/". /wveW. 118:133 — 148 (2008)表2.烟酰胺单核苷酸防止缺氧缺糖导致的神经元细胞活力降低对照组(n=8)给药组(n=8)神经元细胞活力0.486±0.0530.594±0.104****表示给药组和对照组相比较，有显著的统计学差异(户<0.01)。 注神经元细胞活力使用CCK-8法测定。数字越高，表明神经元细胞的活力越高。CCK-8试剂盒购置于日本Dojindo公司，实验步骤均按照其试剂盒说明书实施。表3.烟酰胺单核苷酸防止缺氧缺糖导致的神经元细胞乳酸脱氢酶释放对照组(n=8)给药组(n=8)乳酸脱氢酶释放量10.57±0.806.27±0.81****表示给药组和对照组相比较，有显著的统计学差异(户<0.01)。注乳酸脱氢酶释放使用乳酸脱氢酶释放量试剂盒测定。数字越低，表 面细胞膜的完整度越高，神经元细胞存活更多。酸脱氢酶释放量试剂盒购置 于美国Promega公司，实验步骤均按照其试剂盒说明书实施。中用大鼠(Sprague-Dawley大鼠，体重250g左右，上海斯莱克实验动物 有限公司)制备局灶性缺血性脑卒中模型，过程如下预先给予大鼠3天腹 腔注射 (4mg/kg/12 小时 )FK866[英文名为 (E) -N-[4-(l-benzoylpiperidine-4-yl)butyl]-3-(pyridin-3-yl)acrylamide，暂无中文名， 化合物CAS号201034-75-5，此药物从瑞士 Apoxis公司获得]注射后，将大 鼠麻醉，分离一侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，让尼龙线通过颈内动脉 进入大脑中动脉，堵塞2小时后，将线拔出，即成功制备大鼠大脑中动脉堵 塞导致的局灶性缺血性脑卒中模型。在大脑中动脉堵塞后30分钟通过脑立 体定位系统(美国ASI-Instruments公司)，向侧脑室内注射给药，给予浓度 为10mg/ml的烟酰胺单核苷酸2 W。对照组给予生理盐水。大脑中动脉堵塞 后24小时，检测脑梗死范围和脑细胞凋亡/死亡数目。脑梗死范围检测采用 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(购自Amersco公司)染色法，即TTC染色法；脑 细胞凋亡/死亡数目检测采用荧光末端转移酶标记试剂盒(荧光TUNEL法， 试剂盒购自美国Promega公司)检测细胞凋亡。重复8次实验。8次重复实 验结果显示，烟酰胺单核苷酸明显縮小脑梗死范围(表4)。并且，8次重复 实验结果也显示烟酰胺单核苷酸明显降低梗死区和梗死边缘区的脑细胞凋 亡/死亡数目(表5)。脑梗死范围检测的照片见图1，脑细胞凋亡/死亡检测 的照片见图2。表4.烟酰胺单核苷酸明显縮小脑梗死范围对照组(n=8)给药组(n=8)脑梗死范围占全脑的百分比28.9 ±5.4%21.4士1.8% **(均值士标准差)**表示给药组和对照组相比较，有显著的统计学差异(尸<0.01)。表5.烟酰胺单核苷酸明显降低梗死区和梗死边缘区的脑细胞凋亡/死亡数目对照组(n=8)给药组(n=8)梗死区凋亡/死亡细胞数目173.7±15.5115.4±11.3 **(显微镜下每个视野)梗死边缘区凋亡/死亡细胞数 目(显微镜下每个视野)113.9±9.350.5±4.5 ****表示给药组和对照组相比较，有显著的统计学差异(P<0.01)。注梗死区表示梗死的脑组织的中心区域，梗死边缘区表示梗死的脑组 织和正常脑组织中间的区域。这两个区域都是脑梗死时的受损区域。
权利要求
1、烟酰胺单核苷酸在制备防治脑卒中的药物或保健食品中的应用。
2、 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的脑卒中为缺血性脑卒中。
3、 烟酰胺单核苷酸在制备抗神经元细胞损伤的药物或保健食品中的应用。
4、 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的神经元细胞损伤为缺 氧缺糖导致的神经元细胞损伤。
5、 一种药物组合物，其特征在于，其含有药物活性成分烟酰胺单核苷 酸和药学上可接受的辅料。
全文摘要
本发明公开了烟酰胺单核苷酸在制备抗脑卒中或抗缺氧缺糖导致的神经元细胞损伤药物或保健食品中的应用。本发明还提供了一种新的药物组合物，其可以有效的抗脑卒中和抗缺氧缺糖导致的神经元细胞损伤，这对脑卒中的医治具有重大意义。并且该药物组合物中的活性成分是烟酰胺单核苷酸，烟酰胺单核苷酸本身是机体内源性的保护物质，从目前的资料来看不会产生副作用，因此作为药物的安全性很高，治疗时间窗宽。
文档编号A23L1/30GK101601679SQ20091004767
公开日2009年12月16日 申请日期2009年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者张偌瑜, 徐学文, 徐添颖, 培 王, 田薇薇, 管云枫, 缪朝玉 申请人:中国人民解放军第二军医大学