专利名称：环状异帽藻鉴定方法
技术领域：
本发明涉及为赤潮预测预报提供依据的藻种鉴定。
背景技术：
目前用于鉴别赤潮藻类的引物通常为通用型引物，如利用微藻的核糖体5. 8S rDNA、18S rDNA、28S rDNA、ITS区基因序列相对保守区域所设计的引物，这种引物能够适用 于真核生物或者甲藻门藻类，范围比较大，作为初次鉴定较为方便，但由于其专一性不强， 无法一次性定位到具体的藻种，因此难以达到赤潮藻鉴定的要求。而且采用通用引物经聚 合酶链式反应(PCR)实验后，获得产物序列需通过基因测序，分析后方能明确其所属种类。 这种方法过程步骤较多，耗时、耗费大量的费用，且无法适用在缺乏测序条件之时。因此，开 发针对性较强的引物是当前的研究热点，查阅最新发表的研究报告，已有专家利用核糖体 18S rDNA、叶绿体rbcl等基因序列设计出鉴别单类藻种的引物探针，一次性PCR扩增就能 鉴定到位，无需测序，大大缩短了鉴定周期，同时节省了大量的费用。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种环状异帽藻聚合酶链式反应鉴定特异性引物，以便为赤潮的预测预报提供依据。本发明通过藻种培养、总DNA提取，其特征是利用Primer 5. 0软件对环状异帽藻(Heterocapsa circularisquama)核糖体转录间隔区(ITS区)设计了专一性鉴定引物 YiF3a 和 YiB3a，弓丨物序列为 YiF3a GCAGCGAAGTGTGATAAGCAT ；YiB3a :AATAGGGAAGGGCTAACCATCA ；基因组DNA经PCR扩增后，直接通过琼脂糖凝胶电泳检验有特异条带扩增确定为 环状异帽藻。本发明专门用于鉴定环状异帽藻，对其他藻种具有排他性，经PCR扩增后，无需基 因测序，直接通过琼脂糖凝胶电泳检验，便能确定为环状异帽藻，操作简单，特别适合于在 具有普通PCR仪的一般实验室里操作。
具体实施例方式本发明实验按如下步骤进行(1)藻种培养研究对象是环状异帽藻(Heterocapsa circularisquama)。对照 藻有米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)，塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)，链 状亚历山大藻(A. catenella)，微小亚历山大藻(A. minutum)，微小原甲藻(Prorocentrum minimum)，利玛原甲藻(Prorocentrum lima)。培养基采用天然海水，按照不含硅酸盐的f/2 配方配制，其中氮、磷浓度按实验要求另加。培养基经121°C高压蒸汽灭菌20min后备用。 培养温度为(25士 1)°C，以日光灯为光源，光照强度为ΙΟΟΙχ，光暗比为12h 12h。
(2)总DNA提取离心收集处于指数生长期环状异帽藻细胞，用改良CTAB法提取 基因组总DNA，酚、氯仿抽提纯化。(3)引物设计根据GenBank中环状异帽藻的ITS基因序列(AF183473)，对照不 同属、科、目、纲的多种其他藻种ITS区序列，找寻特征性基因序列，利用Primer 5. 0软件 设计，筛选出多对引物，通过PCR实验，确定最佳引物为YiF3a GCAGCGAAGTGTGATAAGCAT禾口 YiB 3a :AATAGGGAAGGGCTAACCATCA。(4) PCR扩增采用设计引物对环状异帽藻和几种对照藻种基因组DNA进行PCR扩 增，反应条件为95°C预变性5min后进行30个循环，每个循环包括94°C变性45s，58°C退火 45s，72°C延伸45s，最后于72°C延伸10min，4°C保存。
(5)电泳检验PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统拍照，检验条带 结果是否具有专一性，只有环状异帽藻有特异条带扩增，其他对照藻均为阴性。
权利要求
环状异帽藻鉴定方法，通过藻种培养、总DNA提取，其特征是利用Primer 5.0软件对环状异帽藻(Heterocapsa circularisquama)核糖体转录间隔区ITS区设计了专一性鉴定引物YiF3a和YiB3a，引物序列为YiF3aGCAGCGAAGTGTGATAAGCAT；YiB 3aAATAGGGAAGGGCTAACCATCA；基因组DNA经PCR扩增后，直接通过琼脂糖凝胶电泳检验有特异条带扩增确定为环状异帽藻。
2.根据权利要求1所述的环状异帽藻鉴定方法，其特征是PCR扩增反应条件为95°C 预变性5min后进行30个循环，每个循环包括94°C变性45s，58 °C退火45s，72 °C延伸45s， 最后于72°C延伸10min，4°C保存。
3.根据权利要求1或2所述的环状异帽藻鉴定方法，其特征是PCR产物在1.5%琼脂 糖凝胶上电泳来检测扩增特异性。
全文摘要
环状异帽藻鉴定方法，涉及赤潮藻种鉴定，需要解决的技术问题是提供一种环状异帽藻聚合酶链式反应鉴定特异性引物，本发明通过藻种培养、总DNA提取，其特征是利用Primer 5.0软件对环状异帽藻(Heterocapsa circularisquama)核糖体转录间隔区ITS区设计了专一性鉴定引物YiF3a和YiB3a，引物序列为YiF3aGCAGCGAAGTGTGATAAGCATYiB 3aAATAGGGAAGGGCTAACCATCA基因组DNA经PCR扩增后，直接通过琼脂糖凝胶电泳检验有特异条带扩增确定为环状异帽藻。本发明用于赤潮的预测预报。
文档编号C12R1/89GK101845484SQ200910048128
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者张凊漪, 张凤英, 张永, 杨柯, 石彦红, 蒋科技, 郑俊斌, 马凌波, 马春艳 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所