专利名称：一种筛选菌种的方法及其引物和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于菌种筛选纯化领域，特别涉及一种筛选菌种的方法及其引物和试剂
品.O
背景技术：
良好的菌种是微生物发酵工业的基础。能够用于食品的菌种和不同食品的可用菌 种，如乳酸菌、双歧杆菌等，在各个国家都是有相关规定的。现在大部分用的菌种都是国外 公司垄断的，且他们筛选的益生菌适合外国人群，但不一定适合中国人群。中国拥有自己专 利的菌种数量少，种类、功能单一。得到功能良好、合适的菌株是食品益生菌领域要解决的 主要技术问题之一。常用的筛选菌种的方法是从自然界的生态环境中分离出新菌株。由于 微生物到处都有，无孔不入，所以它们在自然界大多是以混杂的形式群居于一起的。自然界 工业菌种分离筛选的主要步骤是样品采集，增殖培养、培养分离和筛选鉴定。通过样品采 集和增殖培养后，样品中的微生物还处于混在生长状态，还需要进行纯种分离。常用的培养 分离方法包括稀释分离法和划线分离法。待长出独立的单个菌落，进行挑选分离，然后对该 菌落进行菌种鉴定。鉴定包括菌落形态、菌落性状以及菌落的生理生化指标鉴定。这些筛 选菌种的方法，周期长，工作量大，试剂设备投资多，效率差。并且，因为筛选具有随机性，一 旦所筛选的样品中无目标菌，则浪费大量人力物力。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的筛选菌种的方法存在盲目性、速 度慢、效率低、工作量大、周期长的缺陷，提供一种新的筛选菌种的方法，该方法快速、高效。 本发明还提供一种筛选菌种的引物及其试剂盒。本发明人经过广泛的研究和大量的试验，发现随着基因技术和网络信息技术的发 展，一般细菌的基因序列在网上都可以免费方便地查到，设计种、属甚至菌株特异性PCR引 物变得很容易，并且也已经有许多被公开了。本发明人发现，利用PCR技术具有快速、灵敏、 特异性强的特点，先用PCR技术筛选含有目标菌的混合菌样品，可以避免下一步筛选的盲 目性，大大提高筛选效率；再用PCR技术筛选目标菌的分离纯种菌落，可以大大减少筛选时 间，高效的筛选到目标菌纯种菌落，从而完成了本发明。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种筛选菌种的方法，包括 以下步骤1)提取待筛样品中的基因组DNA，利用目标菌特异性的PCR引物进行PCR反应，选 择有特异性扩增的样品作为含有目标菌的进一步筛选样品；2)将步骤1)所述的含有目标菌的进一步筛选样品培养分离，挑选单克隆，提取单 克隆的基因组DNA，用目标菌特异性的PCR引物进行PCR反应，选择有特异性扩增的单克隆 即为目标嫌疑菌；3)目标嫌疑菌进行菌种鉴定，确定目标菌。
根据本发明，步骤1)为提取待筛样品中的基因组DNA，利用目标菌特异性的PCR引 物进行PCR反应，选择有特异性扩增的样品作为含有目标菌的进一步筛选样品。其中，所述 的待筛样品较佳的是动物或人的粪便。所述的目标菌可以是任何待筛选的菌类，如可以筛 选双歧杆菌(Bifidobacterium)，酿酒用的酵母菌，或者从自然发酵酸奶中分离酸奶发酵菌 种(如嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌)等，本发明优选双歧杆菌为例来说明。所 述的目标菌特异性的PCR引物较佳的选自特异性扩增目标菌核糖体(rRNA)基因、或种属特 异性蛋白或酶基因的引物，更佳的是碱基序列如序列表中SEQN0 1或SEQ NO 2所示的引 物。PCR反应的条件和程序和本领域常规相同。通过PCR扩增可以大量初筛样品，甚至可以 通过PCR条带的强弱初步判断目标菌含量的多少，节约时间、人力和物力。根据本发明，步骤2)为将步骤1)所述的含有目标菌的进一步筛选样品培养分离， 挑选单克隆，提取单克隆的基因组DNA，用目标菌特异性的PCR引物进行PCR反应，选择有特 异性扩增的单克隆即为目标嫌疑菌。其中，所述的培养分离的方法可以是本领域的常规方 法，较佳的为选择富集培养法、稀释计数法、划线分离法或这些方法的组合。所述的目标菌 特异性的PCR引物，较佳的和步骤1)中相同，选自特异性扩增目标菌核糖体小亚基基因、或 种属特异性蛋白或酶基因的引物，更佳的是碱基序列如序列表中SEQ NO 1或SEQ NO 2所 示的引物。该引物通过PCR可以快速初步筛选到属水平的双歧杆菌，对该双歧杆菌的种水 平的鉴定还需要其他的方法进一步的鉴定，如生理生化反应鉴定法、基因测序法，通过PCR 扩增，可以快速高效地检测判断可疑菌落，大大提高目标菌筛选速度和效率。根据本发明，步骤3)为目标嫌疑菌进行菌种鉴定，确定目标菌。其中，所述的菌种 鉴定的方法可以是本领域的常规方法，如生理生化反应鉴定法等，较佳的为基因测序鉴定 法。根据各种筛选目的，可以将目标嫌疑菌一直鉴定到种或菌株水平。经过鉴定的菌株可 按本领域常规方法保存。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是一种引物，其碱基序列是序 列表中SEQ NO :1或SEQ N0 2所示。本发明还提供一种试剂盒，其中，包括如上所述的引物。根据本发明，较佳的，所述 的试剂盒中还包括耐热DNA聚合酶和/或PCR反应缓冲溶液。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明将分子生物学的PCR技术与传 统微生物培养分离技术完美地结合起来，快速、高效的筛选目标菌。本发明方法针对性强、 速度快、效率高、工作量小、周期短。可以筛选双歧杆菌，酿酒用的酵母菌，或者从自然发酵 酸奶中分离酸奶发酵菌种(如嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌)。筛选得到的菌株 经过耐药性、毒理性、安全性、功能性研究后，可以选择应用到实际生产中。比如同为筛选 得到的嗜热链球菌，有的菌株产酸强，其生产的酸奶后酸强；有的产酸弱，其生产的酸奶后 酸弱；相同配方工艺条件下，有的嗜热链球菌发酵的酸奶口味好，有的口味差；上述都可以 选择应用到不同的生产中。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1是PCR产物的琼脂糖电泳图。其中，0为阴性对照，M为DNA分子量标记DNAMarker DL2000。1 12为待筛样品。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明。实施例中以双歧杆菌为例来进行说明，但是 本发明并不受其限制。本发明的筛选菌种的方法也可以用于筛选其他菌类或微生物。只要 在本发明的权利要求范围之内，都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件 的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1PCR引物设计在GenBank数据库中查找不同种双歧杆菌(包括长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双 歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌)16S rRNA基因序列，利用基因序列分析软件进行同 源性分析，找出双歧杆菌的共有序列。再与其它杆菌(如大肠杆菌、保加利亚乳杆菌)的 相应序列进行对比，找出双歧杆菌共有的且区别于其它菌的特异序列作为PCR引物设计的 参考序列。应用PCR引物设计软件设计双歧杆菌的特异引物，设计的引物满足PCR扩增要 求，最主要的是只能特异性地扩增双歧杆菌但不能扩增出其它菌。本实施例1最终设计的 PCR引物为上游引物5，-GGAATA GCT CCT GGAAAC G-3，(即序列表中 SEQ IDN0 1 所示)；下游引物5，-GCG ATG GAC TTT CAC ACC-3，(即序列表中 SEQ IDN0 2 所示)。所设计的PCR扩增产物的碱基长度为500bp左右。实施例2通过PCR扩增初步判断待筛选样品中是否含有双歧杆菌提取不同动物牛、猪、兔、老鼠以及人的粪便中的菌体基因组DNA，用实施例1中所 得的两条引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为95°C预热5min，30个循环(95°C，30S ；55°C, 30S ;72°C，30S)，72°C延伸5min。采用TaKaRa公司的PCR试剂盒进行PCR反应，PCR反应 体系为SEQ NO :l(5umol/L)3u 1, SEQ NO 2 (5 u mol/L) 3 u 1,2. 5mmol/L dNTP 2. 4u 1, 10 X PCRBuffer 3u 1,模板 DNA 1 u 1, Taq DNA 聚合酶 1 ii，加去离子水至 30 ii 1。PCR 产物 进行琼脂糖电泳，结果发现PCR产物的碱基长度为500bp左右；其中人的粪便PCR扩增条 带最亮，其余的没有或条带较弱。因此选择人的粪便作为待筛选样品。实施例3培养分离，做PCR扩增，初步筛选双歧杆菌嫌疑菌用涂布法在TPY琼脂培养基(TPY琼脂培养基为(g/L)水解酪蛋白10.0，植物胨 5. 0，酵母浸出粉2. 0，葡萄糖5. 0，琼脂13. 0，半胱氨酸0. 5，磷酸氢二钾2. 0，氯化镁0. 23， 硫化锌0. 14，氯化钙0. 15，氯化铁0. 03，吐温-801ml，pH6. 5)，进行稀释平板计数，长出的菌 落分类编号，用无菌牙签挑取单个菌落中的少量菌体，剩下部分备用。用简单基因裂解液(0. 02mol/L NaOH)，快速裂解菌体释放基因组DNA，用实施例1 中所得的两条引物进行PCR扩增。PCR产物的琼脂糖电泳图见图1。图1中1、2、3、... 12 分别代表挑取的单个菌落1、2、3、...12。有扩增条带的菌落为双歧杆菌嫌疑菌。有扩增条 带的菌落进行划线分离纯化，保存菌种。实施例4菌种鉴定根据细菌16S rRNA和23S rRNA两侧高度保守的区域设计通用引物上 游引物5’ -TTGTACACACCGCCCGTC-3’(即序列表中SEQ ID NO :3所示)；下游引物 5，-CCTTTCCCTCACGGTACTG-3，(即序列表中SEQ IDN0 4所示)。提取实施例3所得菌落5基因组DNA，利用上述引物做PCR，扩增出16S-23S rDNA间区序列。PCR产物纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将所测序的序列在NCBI网站上的GenBank数据库中的序列做Blast，通过序列 同源性比对分析，发现测序序列仅仅和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)的同源性为 100%，和其他菌的同源性都小于97%，因同源性大于97%即可被认为是同一菌种，由此鉴 定为菌落5是长双歧杆菌。序列表<110>光明乳业股份有限公司<120> 一种筛选菌种的方法及其引物和试剂盒<130>P4-091192C<160>4<170>PatentIn version 3. 4<210>1<211>19<212>DNA<213>Artificial (人工序列)<220><223> 引物<400>1ggaatagctc ctggaaacg 19<210>2<211>18<212>DNA<213>Artificial (人工序列)<220><223> 引物<400>2gcgatggact ttcacacc 18<210>3<211>18<212>DNA<213>Artificial (人工序列)<220><223> 引物<400>3ttgtacacac cgcccgtc 18<210>4<211>19<212>DNA
<213>Artificial (人工序列)<220><223> 引物<400>4cctttccctc acggtactg 19
权利要求
一种筛选菌种的方法，其特征在于，包括以下步骤1)提取待筛样品中的基因组DNA，利用目标菌特异性的PCR引物进行PCR反应，选择有特异性扩增的样品作为含有目标菌的进一步筛选样品；2)将步骤1)所述的含有目标菌的进一步筛选样品培养分离，挑选单克隆，提取单克隆的基因组DNA，用所述的目标菌特异性的PCR引物进行PCR反应，选择有特异性扩增的单克隆即为目标嫌疑菌；3)目标嫌疑菌进行菌种鉴定，确定目标菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的待筛样品是动物或人的粪便。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标菌是双歧杆菌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)或步骤2)所述的目标菌特异性的 PCR引物选自特异性扩增目标菌核糖体基因、或种属特异性蛋白或酶基因的引物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的目标菌特异性的PCR引物是碱基序列 如序列表中SEQ NO :1或SEQ NO 2所示的引物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的培养分离的方法是选择富集 培养法、稀释计数法、划线分离法或这些方法的组合。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的菌种鉴定的方法是基因测序 鉴定法或者传统的生化鉴定方法。
8.一种引物，其特征在于，其碱基序列是序列表中SEQ NO 1或SEQN0 2所示。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求8所述的引物。
10.如权利要求9所述的试剂盒，还包括耐热DNA聚合酶和/或PCR反应缓冲溶液。
全文摘要
本发明公开了一种筛选菌种的方法及其所用的引物和试剂盒。该方法包括以下步骤1)提取待筛样品中的基因组DNA，利用目标菌特异性的PCR引物进行PCR反应，选择有特异性扩增的样品作为含有目标菌的进一步筛选样品；2)将步骤1)所述的含有目标菌的进一步筛选样品培养分离，挑选单克隆，提取单克隆的基因组DNA，用所述的目标菌特异性的PCR引物进行PCR反应，选择有特异性扩增的单克隆即为目标嫌疑菌；3)目标嫌疑菌进行菌种鉴定，确定目标菌。本发明将分子生物学的PCR技术与传统微生物培养分离技术完美地结合起来，筛选目标菌速度快、效率高、工作量小、周期短。
文档编号C12Q1/68GK101875964SQ20091005012
公开日2010年11月3日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者张红发, 沈玲, 王荫榆, 舒妹 申请人:光明乳业股份有限公司