专利名称：：滤膜浓缩自动计数法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种滤膜浓縮自动计数法，具体涉及一种船舶压载水滤膜浓縮自动计数法，属于环境微生物监测
技术领域：
。
背景技术：
：船舶运输超过世界商品运输量的80%，每年约有100亿吨的压载水在全球转移。据估计，每天约3000余种动、植物通过压载水在全世界范围内进行迁徙。船舶压载水造成的海洋入侵物种对海洋环境的侵害，已被全球环境基金组织确认为危害海洋的四大威胁之一(白敏冬等，2005)。由于压载水问题的严重性，各国都对此比较重视，并投入了大量和人力和物力进行压载水的研究，2004年2月，国际海事组织(IMO)更是在伦敦召开的外交大会上通过了《国际船舶压载水及沉积物控制与管理公约》，该公约规定了船舶压载水的排放标准，即D-2，压载水性能标准。在未来的几年，该公约在超过一定数量的成员国签字后将生效。为此，众多研究人员都加入的压载水的研究中来。但另一方面，尽管IMO规定了压载水中排放的生物限值，但这个指标更多的是一个各成员国相互妥协的结果。尤为重要的是，由于标准中规定的以及许多较干净海水中的实际生物量浓度很低，故需要采取大量的压载水并将其浓縮，其浓度才可能达到现有计数方法的最低限值；而且，由于船舶靠港费用高昂，并可能需要频繁的即时排放压载水，所以计数方法必须快速；此外，D-2标准规定只对活体生物进行计数，故在计数的同时还必须能区分死活。简而言之，对船舶压载水中生物计数的要求是快速，准确，能区分死活。D-2标准分别对1050um以及>50um进行了规定，由于>50um所允许排放的标准值只有10个/m3，生物量浓度非常低，是检测的难点所在，本专利只涉及对^50um微生物的检测计数。现有的计数方法大体可以归为两类直接和间接计数法。根据是否用到显微镜，直接法可大致分为两类一类是需要培养的，可称之为培养法，另一类需要用到显微镜，可称之为镜检法。培养法主要包括三种，分别说明如下。稀释培养测数法(MPN):1915年，McCrady首次发表了用MPN法来估算细菌浓度的方法，这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。具体过程为将待测样品经多次IO倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取35次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。目前，我国仍普遍将MPN法用于大肠菌群，大肠杆菌等的检测。稀释平板测数法这是另外一种广泛使用的生物计数方法。具体过程如下将一定体积的待测水样经过适量的稀释，涂布或者倒入至装有培养基的平板中培养24小时，一个微生物在这段时间内可以长成一个菌落，在稀释倍数已知的情况之下，计算培养基上形成的菌落个数，便可以知道水样中的存活细菌总数。3滤膜培养法使用孔径小于细菌个体的过滤膜过滤，将微生物集中在滤膜上，接着再将滤膜置于培养基上或浸润有液体培养基的垫状物上培养；计算在滤膜上形成的菌落数就可知样品中的活菌数。该技术在分析水样中低生物量浓度的标本时特别有用。相对其它方法，培养法都能准确的计数出活体生物的个数，在计数某一类对营养需求相似的微生物时具有较高的可信度。但缺点也很明显，耗时长，且受限于物理和化学因素，各方法中配制的培养基无法满足所有微生物的营养需求，只能反应出水样中部分微生物的密度，很可能出现所测出的菌落数低于实际菌落数的情况。镜检法这其中目前最简单，使用最为广泛的是滴片法。将一滴准备好的生物样品滴到载玻片上，盖上盖玻片，即可进行观察计数(图1和图2)基础上，众多研究人员还开发了其它直接计数法。这些方法是利用不同的改进型计数装置(如Sedgwick-Raftercountingcell、Palmer—Maloneynanoplanktoncell、standardmedicalhemacytometer等)，在显微镜下直接观察，计算微生物细胞的总数量。每种计数装置都有其适用范围。SedgewickRaftercell亦是一种使用非常广泛的计数装置，适于计数50-500ym范围内的生物(Guillard，1973，1978;RashashandGallagher,1995)。Petroff-Hasser血细胞计数器用于直径<l-5ym生物的计数(Guillard，1973);标准医学血细胞计数器能用于直径在5-75iim范围内生物的计数(Guillard,1978);PalmerMaloney计数装置适用于5-150iim的生物。此外，还有一种滤膜浓縮计数法(Fournier，1978)。该方法的具体过程如下参见图3，将薄膜过滤器安装在过滤器支架上，通过真空抽滤，水样品被过滤穿过薄膜过滤器，将待测微生物样品中的微生物截留在滤膜上，将滤膜放在显微镜下观察计数。相比较直接计数法，该方法具有更多的优点。由于将微生物截留在滤膜的过程，也是浓縮的过程，且浓縮后的滤膜可直接用于镜检计数，省却了中间转移的环节，所以更为快速，准确(Fournier，1981)。直接计数法的优点包括利用计数室(板)容易、迅速、成本低；且能观察细胞大小及部分形态特征。但是，由于计数室是在特制的玻璃板上制成有一定深度的凹槽，并在计数室底部刻有小方格，所以样品中细胞数量不能太少，否则会影响计数的精确度；此外，该检测方法依靠人眼来判别生物体的死活，这也可能会影响到计数的准确度。间接观测法分光光度法利用分光光度计测定含微生物悬浮液的吸光度。先测量一连串不同浓度的同种微生物悬液吸光度，做出标准曲线。随后测量同种未知浓度微生物悬液的吸光度值，依照之前做出的标准曲线，推算出悬液的生物量浓度。这是较为快速而方便的微生物计数的方法，不过大多情况下，这种方法难以区分微生物的死活。电子计数器对个体较大的微生物，可用电子计数器进行直接计数。其原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。在对电子计数器的研制过程中，交错发明和发展了自动血细胞计数器和流式细胞仪，这几种仪器的基本原理大体相似。这几种方法共有的优点是计数快速，在计数的同时还能获得细胞形状，大小等信息，结合荧光技术，还可能快速区分同种生物的死活。在现有的技术方法中，培养法能准确的计数出活体微生物的个数，但这种方法耗时太长，且当水样的生物种类多时，找不到能同时满足多种生物营养需求的培养基；间接法能非常快速的计数，但不能同时计数多种混合微生物中的活体。镜检法的准确度和耗时介于前两者之间。综上，尽管用于微生物计数的方法很多，但到目前为止，还没有找到一种(Lundetal.，1958;PaxinosandMitchell,2000)能在任何条件下，实现任何检测目的微生物计数方法。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种滤膜浓縮自动计数法，以解决现有所存在的诸多不足之处。本发明要解决的技术问题，考虑到船舶压载水生物浓度检测的特殊性，提供一种微生物计数方法，特别适用于船舶压载水中^50um的活体微生物量的计数方法。本发明能同时满足以下条件准确要求检测方法能较为准确的计数出活体微生物的个数；快速这是排放压载水的实际需要，同时能为船务公司节约大量的靠港费用；成本低，使用方便不久的将来，对船舶压载水的生物检测将是一项例行工作，满足此要求能节省大量的人力和物力。在
背景技术：
部分的分析中，结合船舶压载水生物检测的要求，可以看出，目前还没有一种计数方法，能完全满足船舶压载水检测的要求。考虑到鉴别微生物死活的需要，现有的间接法首先被剔除；另一方面，尽管培养法准确度高，但至少24h的培养时间使得其难以用于日常的检测工作。故此，尽管较之培养法，镜检法的准确度稍差些，却也能较为准确的计数出活体生物个数，故此，我们考虑从镜检法中选择一种方法，对其进行改进，用于船舶压载水的活体生物检测。进一步选择的首要依据是耗时，传统的镜检法要先浓縮，然后转移到计数框中进行镜检，单个样品光镜检本身就耗时3040min，如有要做三个重复样，耗时往往超过2h，且耗费大量人力在镜检上。故此，在镜检法中挑选耗时最短的滤膜浓縮计数法进行改进。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现—种滤膜浓縮自动计数法，包括步骤如下(1)现场采取船舶压载水样；(2)采用生物过滤网，现场过滤，得浓縮水样；(3)采用过滤器对浓縮水样进行真空抽滤，所述过滤器内设置滤膜；(4)过滤完全后，将滤膜置于显微镜下进行显微成像，将整个滤膜分复数个局部区域图像，将任一局部区域图像在显微镜下的图像拍摄下来；(5)显微成像后，利用工作站和软件，将显微镜拍摄的局部区域图像拼合起来用于计数；(6)软件自动计数，利用图像的自动计数功能，对拼合图像中尺寸^50um的物体数量进行自动计数；并与压载水活体生物指标进行比较。(7)人工看图计数，软件自动计数后，活体生物超过指标时，检测人员再用肉眼计数活体生物的个数。步骤(1)中每个样品都必须采集不少于lm3的压载水样。由于船舶压载水中5>50um的活体微生物量很少，通常在海水中的浓度为100个/m3。步骤(2)中的浓縮水样为lOOml。浓縮的样品集中在生物过滤网的底部，将底部阀门打开，用样品瓶将100ml浓縮样品移至样品瓶，带回实验室。步骤(3)中滤膜的厚度为IO咖，孔径为IO咖，孔径大小一致，过滤时间约15min。步骤(5)进行图像拼合的时间不超过15min。步骤(6)压载水活体生物如果<10个，表明压载水活体生物个数达标。步骤(7)压载水活体生物如果>10个，检测人员再用肉眼计数活体生物的个数，人工看图计数时间不超过15min。至此，单个样品的检测完毕，样品在实验室从开始检测到完成，共计耗时最多不超过45min。以做三个重复样品为例单个样品所需时间约45min，但完成三个样品所需时间却只有要75min。表1滤膜浓縮自动计数法检测单个样品和多个样品的耗时对比<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明的有益效果与其它的镜检法相比，滤膜浓縮自动计数法具有如下优点1.准确度更高。传统的镜检法在沉降过滤浓縮后，还要将浓縮的样品转移到计数框，这个环节不可避免会产生人为误差；而本方法的样品浓縮和过滤同时实现，微生物截留在滤膜上，直接用于观察，无需二次转移，故可提高准确度；2.耗时短，工作量小。本方法将浓縮样品在实验室浓縮和固定在滤膜上，一步到位，传统镜检法沉降浓縮所需最短时间约2h，滤膜过滤只需15min，节省了约105min。此外，还节省了传统镜检法所需的样品转移时间(约5min);共计节约110min左右的时间；利用显微自动成像，并利用工作站和软件自动拼合，自动或在屏幕上观察拼合图像计数，较之镜检观察，检测人员的眼睛使用强度大幅降低，可进一步大幅减轻检测人员的工作强度，同时拼合的图像还可保存用于备查重计；3.多个样品耗时更省在需要做多个样品时，可边成像拼合，边计数上一个样品；增加一个样品，耗时增加一个样品的计数时间。以下结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。图1为载玻片和盖玻片的主视图。图2为载玻片和盖玻片的侧视图。图3为滤膜浓縮计数法的操作示意图。图4为生物过滤网结构示意图。图5为Isopore滤膜和传统滤膜。具体实施例方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。船舶压载水滤膜浓縮自动计数法的具体操作过程如下以检测船舶压载水样为例，现场采取船舶压载水样lm3—现场过滤，得浓縮水样约100ml—实验室里真空抽滤浓縮水样一滤膜显微成像一工作站拼合图像一软件自动计数一人工看图计数。由于船舶压载水中^50um的活体微生物量很少，通常在海水中的浓度为100个/m3，所以每个样品都必须采集不少于lm3的压载水样，水样为海水在现场用No.438030型号，孔径为50um的生物过滤网(德国HYDRO-BIOS公司)对压载水样进行过滤浓縮，如图4所示，吊环1套在固定的装置上，压载水样1!113将倒入生物过滤网的椎体2内，将浓縮的样品集中在生物过滤网的椎体2的底部，将底部阀门3打开，用样品瓶将浓縮样品移至样品瓶。带回实验室，用Satoriusl6306玻璃过滤器进行浓縮过滤，所用滤膜为厚度为10咖，孔径为10咖，孔径大小一致，透光性好的，的"IS0P0RE"过滤膜，过滤时间约15min，参见图5。过滤的压力差越大，时间越短，但细胞变形也越厉害，为将细胞的变形降低到可接受的范围，可以适当降低过滤压力差为50KPa，即便这样，消耗的时间也不会超过30min。过滤完全后，将滤膜置于Nikon901全自动显微镜下进行显微成像，后台同时利用工作站(配置不低于CPU:英特尔(R)酷睿(TM)2DuoE6600(2.40G/1066FSB/4MB);内存2GB(2xlGB)ECC双通道DDR2667MHzSDRAM;显卡256MBPCIex16NVIDIAQuadroFX3500图形卡，支持双显DVI或VGA;硬盘160GBSATA(10，000RPM))和购置的NikonNIS-ElementsAR3.0软件(或其它具有此功能的软件)的图像拼合功能，将显微镜拍摄的局部区域图像拼合起来，时间不超过15min。随后检测人员利用NikonNIS-ElementsAR3.0软件(或其它具有此功能的软件)的图像自动计数功能，对拼合图像中尺寸^50um的物体数量进行自动计数，如果〈10个，表明压载水活体生物个数达标，如果>10个，检测人员再用肉眼计数活体生物的个数，通常这个过程耗时约15min。至此，单个样品的检测完毕，样品在实验室从开始检测到完成，共计耗时最多不超过45min。如表1所示，完成单个样品所需时间约45min，但完成两个样品需要60min，完成三个样品所需时间只要75min。本发明不是简单的重复滤膜过滤法，而是针对滤膜过滤法存在的问题，进行创造性的改进问题一在过滤过程中，如果生物浓度较高，还存在微生物相互聚集，重叠的现象，影响计数的准确度(Fournier，1978);解决由于船舶压载水中目标生物量浓度比较低，因此，这个问题对准确度造成的影响可以忽略不计；问题二过滤过程中，细胞难以均匀的分布在滤膜上，不能参照计数框的计数方式，选取几个区域读数，做平均即可；解决由于压载水样中的生物量浓度很低，所以，大多数情况下，过滤到滤膜表面的生物量个数很少，通常在0100个之间，即使用计数框，也必须将整个框内的生物全部计数，否则误差会比较大。所以解决的办法是全部计数，由于生物个数较少，计数耗费的时间也会相对的縮短；此外，传统的肉眼观察耗时，耗人力。为此，采用显微自动成像系统，将整个滤膜分复数个局部区域图像，将任一局部区域图像在显微镜下的图像拍摄下来，将拍摄到的所有图像利用软件自动拼合，将拼合的图像用于计数，这可大大降低检测人员的工作强度，并提高工作的效率。问题三过滤可能导致细胞变形，难以辨认；解决过滤过程实际上也是一个浓縮过程，对于其它的镜检法，通常是自然沉降进行浓縮，这种方式依据微生物大小的不同，耗时通常在224h之间，而滤膜浓縮所需的时间远小于2h，过滤的压力差越大，时间越短，但细胞变形也越厉害，为将细胞的变形降低到可接受的范围，可以通过适当降低过滤压力差，延长过滤时间实现。即便这样，消耗的时间也不会超过30min。问题四传统的滤膜厚度较大，光线难以透过滤膜，在光学显微镜下成像不清晰；而且，滤孔大小不一致，可能会将目标尺寸以外的微生物截留在滤膜上，造成计数过大。解决本方法选用了Millipore公司的聚碳酸酯Isopore滤膜。与传统滤膜(参见图5，右侧)不同，本发明采用的Isopore滤膜(参见图5，左侧)透光性好。该滤膜是在聚碳酸酯表面径迹蚀刻而成，具有如玻璃一般光滑的表面，可以进行清晰的样品观察。而且，Millipore独有的生产工艺保证了准确均一的孔径，可进行精确的依据孔径的分离。此外，Isopore滤膜具有很低的背景干扰，不会影响实验结果。Isopore滤膜是不吸湿的，可以很快干燥，减少实验中的等待时间。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。权利要求一种滤膜浓缩自动计数法，包括步骤如下(1)现场采取船舶压载水样；(2)采用生物过滤网，现场过滤，得浓缩水样；(3)采用过滤器对浓缩水样进行真空抽滤，所述过滤器内设置滤膜；(4)过滤完全后，将滤膜置于显微镜下进行显微成像，将整个滤膜分复数个局部区域图像，将任一局部区域图像在显微镜下的图像拍摄下来；(5)显微成像后，利用工作站和软件，将显微镜拍摄的局部区域图像拼合起来用于计数；(6)软件自动计数，利用图像的自动计数功能，对拼合图像中尺寸≥50um的物体数量进行自动计数；并与压载水活体生物指标进行比较。(7)人工看图计数，软件自动计数后，活体生物超过指标时，检测人员再用肉眼计数活体生物的个数。2.根据权利要求1所述的滤膜浓縮自动计数法，其特征在于必须采集不少于lm3的压载水样。3.根据权利要求1所述的滤膜浓縮自动计数法，其特征在于为lOOml。4.根据权利要求1所述的滤膜浓縮自动计数法，其特征在于为IO咖，孔径为IO咖，孔径大小一致，过滤时间约15min。5.根据权利要求1所述的滤膜浓縮自动计数法，其特征在于的时间不超过15min。6.根据权利要求1所述的滤膜浓縮自动计数法，其特征在于物如果<IO个，表明压载水活体生物个数达标。7.根据权利要求1所述的滤膜浓縮自动计数法，其特征在于物如果>IO个，检测人员再用肉眼计数活体生物的个数，人工看图计数时间不超过15min。:步骤(1)中每个样品都:步骤(2)中的浓縮水样:步骤(3)中滤膜的厚度:步骤(5)进行图像拼合:步骤(6)压载水活体生:步骤(7)压载水活体生全文摘要一种滤膜浓缩自动计数法，包括步骤如下现场采取船舶压载水样；采用生物过滤网，现场过滤，得浓缩水样；采用过滤器对浓缩水样进行真空抽滤，过滤器的滤膜的厚度为10μm，孔径为10μm，孔径大小一致，过滤时间约15min；过滤后，将滤膜置于显微镜下进行显微成像；利用工作站和软件，将显微镜拍摄的局部区域图像拼合起来用于计数；软件自动计数，利用图像的自动计数功能，对拼合图像中尺寸≥50um的物体数量进行自动计数，并与压载水活体生物指标进行比较；软件自动计数后，活体生物超过指标时，检测人员再用肉眼计数活体生物的个数。本发明的准确度更高，耗时短，工作量小。文档编号C12Q1/06GK101781673SQ20091005128公开日2010年7月21日申请日期2009年5月14日优先权日2009年5月14日发明者冯道伦,许乐平,邢小丽申请人:上海海事大学