一种检测胰腺癌血清标志物的方法

专利名称：：一种检测胰腺癌血清标志物的方法
技术领域：
：本发明涉及医学分子生物学
技术领域：
，是一种检测胰腺癌血清标志物的方法，该胰腺癌血清标志物具体为microRNA-196a。
背景技术：
：microRNA最早发现于1993年，是一种小的、非编码蛋白质的单链RNA，由1825个核苷酸组成。microRNA通过与mRNA3'非翻译区(3，UTR)结合，使得靶mRNA降解或抑制其翻译，实现其生物学功能。经过20多年艰苦卓绝的努力，科学家对microRNA研究取得了突破性进展，发现其在动物、植物和病毒中普遍存在，且在许多生命活动中起着非常重要的作用。根据最新的microRNA数据库统计(miRBaseRegistry13.0)，人体已经发现了706种microRNA。microRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性。近来研究表明，某些microRNA在细胞的分化发育中起着重要的作用，提示其与肿瘤的发生密切相关。通过特定的分子生物学技术(包括Northern印记杂交、实时定量PCR，上调或下调特定microRNA的表达等)，人们发现microRNA表达量的变化与很多肿瘤密切相关，如肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、白血病等。功能学研究显示microRNA可能与癌基因或抑癌基因起着同样的作用。超过50e/。的microRNA基因位于肿瘤相关的基因组区域或者不稳定区域，这种现象提示，microRNA在部分肿瘤的发生过程中起着重要的作用。尽管科学家们对于血液中DNA的研究己经有很长的历史，但对血液中RNA的研究仍处在初始阶段。由于循环血中RNA酶含量丰富，因此在其中检测到的RNA片段常被当做大片段RNA的降解片段。进来，多篇相关文献验证了循环血中miRNA的稳定存在，并探讨了循环血中microRNA对于疾病诊断及预后研究的巨大意义。(ChenX，BaY,MaL，CaiX，etal.CellRes.2008Oct;18(10):997-1006.MitchellPS，ParkinRK,KrohEM,etal.ProcNatlAcadSciUSA.2008Jul29;105(30):10513-8.GiladS，MeiriE,YogevY,etal.PLoSONE.2008Sep5;3(9):e3148.)microRNA-196a(miRNA-196a)是一种进化上非常保守的microRNA(LaDeanaW.Hillier,WebbMiller,EwanBirney，etal.Nature.2004Dec9;432(7018):695-716.),在很多物种中广泛的存在(人类、小鼠、大鼠、蟾蜍、斑马鱼等)。有研究表明，miR-196a在细胞的分化发育中起着重要的作用，(QiuR,LiuY,WuJY,etal.BrainResBull.2009Apr6;79(1):26-31.MansfieldJH,HarfeBD，NissenR,etal.NatGenet.2004Oct;36(10):1079-83.)已有研究证实microRNA196a表达异常与许多肿瘤的发生发展密切相关，例如miR-196a可以抑制ANXA1(—种肿瘤抑制蛋白，可以诱导凋亡，抑制细胞的增殖和迁移)的表达，从而促进食道癌，乳腺癌等的发生。(LuthraR，SinghRR，LuthraMQetal.Oncogene.2008Nov6;27(52):6667-78.)SNP研究也表明hsa-mir-196a与非小细胞肺癌的生存期密切相关。(TianT,ShuY,ChenJ,etal.CancerEpidemiolBiomarkersPrev.2009Apr;18(4):1183-7.HuZ,ChenJ，TianT，etal.JClinInvest.2008M;118(7):2600-8.)2008年，Charles等首先在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的血清中检测到microRNA-196a(miR-196a)，并证实其在DLBCL中的表达水平显著高T正常人，且与患者无复发生存期的长短密切相关。胰腺癌恶性程度高，早期诊断困难，缺乏确实有效的方法，预后极差。手术切除是唯一可以延长生存期的治疗手段。不幸的是，绝大多数胰腺癌患者诊断时己属晚期(TNM分期III、IV期)，失去了手术机会。如果能寻找到胰腺癌特异的血清标志物，对胰腺癌的早期诊断和治疗方案的确定将具有极大的临床应用价值。
发明内容本发明目的是提供一种检测胰腺癌血清标志物的方法。本发明人在长期研究中，首先发现血清中miR-196a的表达水平与胰腺癌的术后生存期密切相关，之后发现miR-196a的相对表达丰度可以很好的将可切除胰腺癌(TNM分期I、II期)及进展期胰腺癌(TNM分期III、IV期)很好地鉴别开来，从而为胰腺癌的早期诊断和开腹手术指征的判断提供了新的标志物。本发明的具体研究如下一、取适当数量的手术切除胰腺癌(病理证实为胰腺导管腺癌)病例，制作microRNA-196a表达量的标准图谱1)制备总RNA:取外科手术证实胰腺导管腺癌患者的血液样本若干例，将各血液样本进行室温下静置，离心，取血清，在加入去酶剂后，将人工合成的microRNA(Cel-miR-39)分别加入各血清中作为标化物，使用美国MolecularResearchCenter公司的TRIREAGENTBD(catno.TB126)试剂常规抽提总RNA，用去酶水将其配成40ul的溶液，-80°0冰箱保存。2)对各血清样本中microRNA-196a的表达丰度进行测定使用AppliedBiosystems公司的microRNA检测试剂盒(TaqManMicroRNAAssay),以及荧光实时定量PCR技术，测得所得胰腺癌血清样本中microRNA-196a的表达丰度(Ct值)，用Ctl96a表示。并用同样的方法测得加入的标化物Cel-miR-39的Ct值Ct39。3)制作胰腺导管腺癌患者血清中MicroRNA-196a表达量的标准图谱使用(60-Ctl96a)作为血清样本中microRNA-196a的初步表达度量，并使用各样木中测得的Ct39对其(60-Ctl96a)进行标化，得到各样本的相对表达丰度(60-Ct)。二、对各血清样本microRNA-196a的相对表达丰度进行研究，探讨其与胰腺导管腺癌TNM分期间的关系对所有的入组胰腺导管腺癌患者进行随访，记录术后存活时间及生存情况。根据所得(60-Ct)选定适当的界值，将所有胰腺癌病例分为高表达microRNA-196a组和低表达microRNA-196a组，使用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank统计学方法验证血清中microRNA-196a含量对胰腺导管腺癌患者预后的影响。根据美国癌症联合会第六版TNM分级系统(KatzMH,HwangR,FlemingJB，EvansDB.CACancerJClin.2008Mar-Apr;58(2):l11-25.)，对所得胰腺导管腺癌病例进行临床分期，制作可切除胰腺癌患者及进展期胰腺癌患者血清中microRNA-196a的表达图谱，并使用适当的统计学方法对两组间表达量的差别进行比较，验证其在判断胰腺导管腺癌手术适应证方面的价值，并确定适当的诊断界值。该诊断界值为17.80(60-Ct)，其鉴别进展期胰腺癌的敏感性为100%，特异性为73.9%。三、早期检测和判断胰腺导管腺癌手术适应证的方法按以上方法检测未知血浆标本中的microRNA-196a表达丰度值(60-Ct)，对照上述胰腺导管腺癌可切除组和进展期组microRNA-196a表达量的标准图谱，如果落入可切除组(TNM分期I、II期)血清microRNA-196a的表达丰度范围内，则将其归为可切除组，否则归为不可切除组。本发明提供一种检测胰腺癌血清标志物的方法，该胰腺癌血清标志物是microRNA-196a，该方法包括以下步骤A)待检血液样本，离心，取血清；B)在经去酶剂处理的血清中加入Cel-miR-39作为标化物，抽提总RNA;C)用TaqmanmicroRNA反转录试剂盒对抽提的RNA进行反转录反应；D)测定血清中microRNA-196a的标准化相对表达丰度(60-Ct):用荧光实时定量PCR(RT-PCR)技术，测得所得血清中microRNA-196a的表达丰度(Ct值)，用Ctl96a表示；并用同样的方法测得加入的标化物Cel-miR-39的Ct值，用Ct39表示；计算各血清样本中microRNA-196a的初步定量值(60-Ctl96a)，然后比较得出各样本中最小的Ct39值(Ct39min)，计算出血清中microRNA-196a的标准化相对表达丰度(60-Ct)，(60-Ct)=(60-Ctl96a)-(Ct39-本发明的检测方法不仅可以定量检测出胰腺癌的特异性血清标志物一一microRNA-196a，而且具有检测方便、敏感性好、准确率高等特点，对胰腺癌的早期诊断和确定治疗方案中将具有极大的临床应用价值。图1为胰腺癌可切除组与进展组血清中microRNA-196a表达丰度的比较(箱图)图2为阴性对照组(6种胰腺癌相关性microRNA)在胰腺癌可切除组与进展组表达丰度的比较(散点图)图3为胰腺癌患者术后Kaplan-Meier生存曲线图4为根据散点图及ROC曲线确定microRNA-196a作为剖腹手术适应证判断的表达丰度界值判定(A为散点图，B为RQC曲线图)具体实施方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例1:1.血清采集取长海医院外科手术证实胰腺导管腺癌患者的血液样本31份，将各全血样本进行室温下静置(30分钟至2小时)，4"C下1200xg离心20分钟，每份样本取上层血清500ul，转移至1.5ml离心管中，-80"冰箱内保存。2.血清中RNA抽提每份血清样本取50)al，加入750(ilTRIREAGENTBD(MolecularResearchCenter公司)和20|al5N醋酸，混匀后加入5pl浓度为50pmol/L的Cel-miR-39(人工合成的microRNA，由Qiagen公司提供，以去除人为操作造成的检测差异)，震荡混匀，室温下静置5分钟，加入20(^1氯仿，震荡混匀，室温下静置5分钟，4°C，12000xg离心15min，提取上清液，加入4plDNAmate(TAKARA公司)，后加入与上清液等体积的异丙醇混匀，-2(TC静置30min，4'C，12000xg离心15min，去上清，向沉淀中加入lml75。/。乙醇清洗沉淀，4°C，7500xg离心洗涤沉淀5min。去上清，将沉淀室温晾干后加入去酶水充分溶解，测定所得RNA的浓度。3.RT-PCR反应使用AppliedBiosystems公司的TaqmanmicroRNA反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录反应。15^1反应体系中包含2^1所提取RNA的溶液，0.15^1的dNTPs(100mM)，lpi的反转录酶(50U/ial),0.19^il的RNase抑制剂，1.5^110xRTbuffer,7.16(il去酶水，3(^1stem—loop5xRTprimer(cel-miR画39，4373455;has曙miR-196a，43730卯；has-miR-155,4395459;has-miR-196a，4373104;has-miR-181a,4373117;has-miR-181b,4373116;has-miR-2196a,4373077;has-miR-222,4395387;has-miR-16,43731196a;AppliedBiosystems)。使用AppliedBiosystems公司9700热循环仪进行16°C30分钟，42°C30分钟，85°C5分钟的反转录。对反转录产物进行1:5稀释后，取5^1作为实时定量PCR的模板，使用AppliedBiosystems公司的TaqManUniversalPCRMasterMix试剂盒进行实时定量PCR鉴定。PCR反应在AppliedBiosystems7900HT序列检测系统中进行。PCR反应体系为20^1，包含5^1稀释后的RT产物，10ul2><TaqManUniversalPCRMasterMix,1.OOulTaqManMicroRNAAssays20xTaqManAssay，4|il去酶水。将所有的反应体系首先进行95'C10分钟的预热，然后进行每循环95°C15秒，6CTC1分钟，共60循环的PCR反应。所有的反应重复三次，使用7500软件系统(版本2.0丄AppliedBiosystems)进行分析，每次取固定的阈值，测定各样本中microRNA对应的Ct值，三次测定中的最小值作为该样本最终的Ct值。4.实时定量PCR数据的标准化处理用上述方法先检测各例样本的MicroRNA-196a的Ct值(Ctl96a)及标化物Cel-miR-39的Ct值(Ct39)，计算各血清样本中microRNA-196a的初步定量值(60-Ctl96a)，然后比较得出各样本中最小的Ct39值(Ct39min)，即可计算出所有样本中microRNA-196a的标准化相对定量值(60-Ct)。注(60-Ct)=(60-Ctl96a)-(Ct39-Ct39min)5、胰腺导管腺癌患者血清中microRNA-196a含量在判断剖腹手术适应证中的应用价值验证及诊断界值的确定5.1通过RT-PCR及数据分析对所有胰腺导管腺癌血清样本中microRNA-196a进行相对定量测定。为更好地说明问题，另取6个胰腺癌组织中高表达的microRNA(miR-21、155、181a、181b、221、222)作为阴性对照，测定所有microRNA的标准化相对定量值(60-Ct)，详见表l。根据美国癌症联合会第六版TNM分级系统对胰腺癌患者进行临床分期(具体数值及临床数据见表2)，结合分期情况，将所有胰腺导管腺癌患者分为两组——可切除组(TNM分期I、II期)及进展期组(TNM分期III、IV期)，然后进行两组间所有7种microRNA的含量比较。microRNA-196a结果如图1，阴性对照结果如图2。结果表明进展期组血清中microRNA-196a的表达水平显著高于可切除组(P=0.002)，达60.96倍(图1)，而作为阴性对照的6个microRNA在两组间没有差别(图2)5.2由于TNM分期与胰腺导管腺癌患者的预后密切相关，因此，我们对研究的31例患者的术后生存时间及存活情况进行了随访，记录术后存活时间及生存情况(表3)。根据所得病例统计情况及患者血清中microRNA-196a的表达水平，我们尝试选定16.7作为(60-Ct)的界值，将所有胰腺癌病例分为高表达microRNA-196a组和低表达microRNA-196a组，使用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank统计学方法验证血清中microRNA-196a含量对胰腺导管腺癌患者预后的影响。结果表明高表达量组平均生存期为7.00个月(95%可信区间5.66-8.34个月)，低表达量组平均生存期为12.00个月(95。/。可信区间7.06-16.94个月)，二者之间差异显著(P=0.014)。高表达量组一年生存率为0.0%，而低表达量组一年生存率为31.2%。这与我们TNM分期的结果一致，进一步证实了胰腺导管腺癌患者血清中microRNA-196a在判断剖腹手术适应证方面的应用价值。5.3在成功判定血清中microRNA-196a在确定胰腺导管腺癌手术适应证潜在价值的基础上，对其进行ROC分析，AUC下面积为0.859，诊断准确度为中等，取诊断界值为17.80(60-Ct)，其鉴别进展期胰腺癌的敏感性为100%,特异性为73.9%，见图4。表1:7种胰腺导管腺癌相关性microRNA的标准化相对定量值患者胰腺癌相关性microRNA标准化相对定量值(60-Ct)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2516.8031.5831.1226.6924.7121.9523.152622.4534.3728.4627.5429.3631.2428.832715.1733.6228.0326.3526.4830.6527.552813.5234.5230.8429.2328.6330.2926.99299.0831.0626.3624.6125.8126.1524.863025.1030.5129.1224.8828.9522.5718.163116.3334.7829.2023.0929.1121.0727.06表2:31例胰腺导管腺癌患者的临床数据及临床分期序号性别年龄TNM分期临床分期1女45T3N1M1IV2男56T2N0M0IB3男72T3N1M1IV4男54T3N0M0IIA男50T3N0M0IIA6女58T3N1M1IV女68T4N1M0III8男66T3N0M0IIA9女61T3N1M1IV10女50T2N1M0IIB11男50T2N0M0IB12女72T3N1M1IV13男67T2N0M0IB14男68T3N1M0IIB15男56T2N0M0IB16男55T3兩M0IIA17女67T3N腦IIB18女55T3N0M0IIA19男73T2N0M0IB20男54T2N1M0IIB21女43T2N0M0IB22女51T3N0M0IIA23男69T2N0M0IB24男62T4N1M1IV25女62T2N1M0IIB26男60T3N1M0IIB27女76T2N0M0IB28女61T2N腦IIB29女72T3N0M0IIA30男56T4N画m31男54T2兩M0IB表3:31例胰腺导管腺癌患者术后随访情况(截止至2009年6月)'患名.编号诊断日期死亡日期随访时间(月)110/18/200702.20084209/05/2007失访08/30/200711.20073410/10/200703.200916.5509馬/200705.20088.7612/04/200707.200811/28/200705.20086.1811/08/200711.200812911/01/200702.20081004/16/2008失访1104/22/200801.20098.51205/19/200811.20085.91308/05/2008存活10.61410/07/2008存活8.51511/05/2008存活7.61611/11/2008存活7.41701/13/2009失访1808/28/200806.2009101909/04/200805.20098.62009/30/2008存活9.82111/12/2008存活7.42211/13/200806.200972311/25/2008存活72411/25/200803.20093.52512/04/200804.20094.62612/23/2008存活62712/24/200802.20092.72811/18/2008存活7.22912/01/200802.20092.13011/12/2008存活7.43108/26/2008存活10权利要求1、一种检测胰腺癌血清标志物的方法，其特征在于该胰腺癌血清标志物是microRNA-196a，该方法包括以下步骤A)待检血液样本，离心，取血清；B)在经去酶剂处理的血清中加入Cel-miR-39作为标化物，抽提总RNA；C)用TaqmanmicroRNA反转录试剂盒对抽提的RNA进行反转录反应；D)测定血清中microRNA-196a的标准化相对表达丰度(60-Ct)用荧光实时定量PCR(RT-PCR)技术，测得所得血清中microRNA-196a的表达丰度(Ct值)，用Ct196a表示；并用同样的方法测得加入的标化物Cel-miR-39的Ct值，用Ct39表示；计算各血清样本中microRNA-196a的初步定量值(60-Ct196a)，然后比较得出各样本中最小的Ct39值(Ct39min)，计算出血清中microRNA-196a的标准化相对表达丰度(60-Ct)，(60-Ct)＝(60-Ct196a)-(Ct39-Ct39min)。全文摘要本发明涉及医学分子生物学
技术领域：
，是一种检测胰腺癌血清标志物的方法。胰腺癌恶性程度高，早期诊断困难，缺乏确实有效的方法，预后极差。手术切除是唯一可以延长生存期的治疗手段。不幸的是，绝大多数胰腺癌患者诊断时已属晚期(TNM分期III、IV期)，失去了手术机会。本发明目的是提供一种检测胰腺癌血清标志物的方法，并将该方法用于胰腺癌的早期诊断和开腹手术指征的临床判断中。本发明经研究发现血清中miR-196a的表达水平与胰腺癌的术后生存期密切相关，之后发现miR-196a的相对表达丰度可以很好的将可切除胰腺癌(TNM分期I、II期)及进展期胰腺癌(TNM分期III、IV期)很好地鉴别开来，因此利用本发明的方法可以定量检测胰腺癌血清标志物microRNA-196a，而且检测方便、敏感性好、准确率高。文档编号C12Q1/68GK101613748SQ20091005269公开日2009年12月30日申请日期2009年6月9日优先权日2009年6月9日发明者孔祥毓,李兆申,杜奕奇,寒林,王国坤,清荆,军高申请人:中国人民解放军第二军医大学