专利名称：dcf-1基因剔除小鼠模型、其构建方法及其应用的制作方法
dcf-l基因剔除小鼠模型、其构建方法及其应用技术领域本专利涉及一种dcf-l基因剔除小鼠模型、其构建方法及其应用。 发明背景神经干细胞(Neural stem cell, NSC)是一类可以自我更新复制，并具有分化成为神经 元和胶质细胞潜能的细胞。与神经干细胞分化相关的dcf-1基因的高表达有助于干细胞维持 未分化状态，而沉默dcf-1基因的表达可以加速神经干细胞的分化过程。小鼠已成为研究人类疾病的一种重要模式生物。Cre-loxP系统，己经能够较为容易的实 现基因的敲除从而构建基因剔除小鼠模型。动物行为学及组织化学的迅速发展，realtimePCR 之类的高新技术手段在实验室中运用，给予了我们从一个生物整体的角度研究基因功能的良 好平台。 发明内容本发明的目的之一在于提供一种与神经干细胞分化相关的dcf-1基因剔除小鼠模型。 本发明的目的之二在于提供该模型的构建方法。 本发明的目的之三在于提供该模型在筛选抗焦虑药物中的应用。 本发明的目的之四在于提供该模型在制备促进5-羟色胺祌经元发育药物中的应用。 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案 一种与神经干细胞分化相关的dcf-1基因剔除小鼠模型。一种构建上述的dcf-1基因剔除小鼠模型的方法，其特征在于该方法的具体步骤为利用Cre-loxP系统，将打靶载体电击转化胚胎干细胞，使其与基因组发生同源重组。再将胚胎 干细胞移植入胚胎，产生在dcf-1基因的两侧带有loxP位点的后代，将这些后代与表达Cre 重组酶的小鼠杂交，就会产生dcf-1基因剔除小鼠模型。上述的dcf-1基因剔除小鼠模型在筛选抗焦虑药物中的应用。上述的dcf-1基因剔除小鼠模型在制备促进5-羟色胺神经元发育药物中的应用。 本发明通过Cre — loxP系统，构建了确为可靠的dcf-1基因剔除小鼠模型。然后通过动物行为学实验，发现dcf-1基因的剔除会导致小鼠产生焦虑情绪。为了更好的研究dcf-1基因与焦虑之间的关系，本发明使用了 realtime PCR技术和组织化学等手段，进一步发现dcf-l基因的剔除会影响5-羟色胺神经元的发育成熟。
图1为dcf-l基因剔除小鼠构建图，图中标示小鼠的基因组结构，鉴定方法以及鉴定结 果。其中A-D分别为野生型小鼠、打靶载体、dcf-1 loxP小鼠和dcf-l剔除小鼠的基因组结 构。E为在基因组水平证实剔除的发生。F为在表达水平证实剔除的发生。图2为dcf-1基因剔除小鼠的行为学实验结果，显示了严重的焦虑倾向。A为进入开放 臂和中央区域的次数。B为在开放臂停留的时间。图3为dcf-l基因剔除小鼠5-羟色胺神经元考察结果，结果显示5-羟色胺神经元数量明 显减少。A为5-羟色胺神经元标志物Pet-l的表达量，C-D分别为野生型、dcf-l+/-和dCf-l-/-小鼠的中缝背核切片。
具体实施方式
实施例一dcf-l基因剔除小鼠模型的构建dcf-l基因的剔除可以利用Cre-loxP系统来实现。将打靶载体电击转化胚胎干细胞，使 其与基因组发生同源重组。再将胚胎干细胞移植入胚胎，产生在dcf-l基因的两侧带有loxP 位点的后代。将这些后代与表达Cre重组酶的小鼠杂交，就会产生dcf-1基因剔除小鼠。通 过基因组PCR， RT-PCR，本发明验证了此模型中确实发生了 dcf-l基因的缺失，结果如图1 所示。实施例二 dcf-1基因的功能研究1. 行为学研究本发明对dcf-l基因剔除小鼠进行高架十字迷宫行为学测试。先将小鼠放在 迷宫的中央区域，然后观察小鼠在5分钟内的行为，包括进入进入开放臂和中央区域的次数 以及在开放臂区域停留的时间。结果如图2所示，WT小鼠进入中央区域的次数与Cfcf"+/-和(^/^-/-小鼠的没有明显的区别，说明它们在迷宫中穿梭的频率基本相当，选择进入开放臂 还是封闭臂的机会也基本相等；但是野生型进入开放臂的次数高于后两种基因型，WT小鼠 在开放臂停留的时间也明显长于cfc/^+Z-和01(;/4-/-小鼠。结果表明dcf-l基因剔除小鼠物 行为的异常符合公认的焦虑行为特征。2. 5-羟色胺神经元考察本发明针对5-羟色胺神经元的标志物Pet-1进行realtime PCR，同 时将dcf-l基因剔除小鼠的脑组织切片并染色，发现dcf-l基因剔除小鼠的5-羟色胺神经元 数量明显减少，结果如图3所示。神经元考察的结果表明dcf-l基因敲除导致小鼠5-HT神 经元明显减少，是小鼠产生焦虑行为的原因。
权利要求
1.一种与神经干细胞分化相关的dcf-1基因剔除小鼠模型。
2. —种构建根据权利要求l所述的dcf-l基因剔除小鼠模型的方法，其特征在于该 方法的具体步骤为利用Cre-loxP系统，将打靶载体电击转化胚胎干细胞，使 其与基因组发生同源重组。再将胚胎干细胞移植入胚胎，产生在dcf-l基因的两 侧带有loxP位点的后代，将这些后代与表达Cre重组酶的小鼠杂交，就会产生 dcf-l基因剔除小鼠模型。
3. —种根据权利要求1所述的dcf-1基因剔除小鼠模型在筛选抗焦虑药物中的应 用。
4. 一种根据权利要求1所述的dcf-1基因剔除小鼠模型在制备促进5-羟色胺神经元 发育药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种与神经干细胞分化相关的基因dcf-1及其应用。通过同源重组，胚胎干细胞移植以及Cre-loxP系统，我们得到dcf-1基因剔除小鼠，并且发现该基因的剔除会导致小鼠产生焦虑情绪。借助realtime PCR和组织化学等手段，我们还发现dcf-1基因剔除会导致Pet-1表达量下调，影响5-羟色胺神经元的发育。
文档编号C12N15/85GK101574074SQ200910053359
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月18日 优先权日2009年6月18日
发明者婕 吴, 文铁桥, 谭智昊 申请人:上海大学