专利名称：一种检验和计数活体微生物的方法
技术领域：
本发明属于食品微生物检测领域，特别涉及一种检验和计数活体微生物的方法。
背景技术：
食品生产中经常要检测样品中特定微生物的活体数，不同食品要求检测的微生物 种类、数量不同，在各个国家都有相关规定。一般要求产品中益生菌活菌数达到IXlO6Cfu/ g，危害微生物要求不能高于规定值产品才能合格，产品中微生物活体数直接影响着产品的质量。我国目前常用的微生物活体计数方法(如GB/T4789134-2003和GB/ T4789135-2003分别对双歧杆菌和乳酸菌检测计数)包括平板计数法和最大可能数(MPN) 法(也称稀释培养计数)。平板计数法包括倒平板法和涂布法。最大可能数法是一般细菌、 病毒及噬菌体的主要计数方法之一。对未知微生物样品做连续十倍系列稀释，根据估计数， 从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取3毫升试样，接种1毫升到3组共9只装培养液 的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，培养阳性试管再做鉴定，然后查最 大可能数表MPN(most probably number)得出待测样品的含微生物最大可能数，根据样品 稀释倍数计算出微生物活体数量。MPN法从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推 算样品中菌数最近似的数值。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生 物限量检查。利用平板计数法和最大可能数法计数的微生物在培养计数中是未被鉴别的， 需要做种类鉴定。传统的微生物鉴定主要依据微生物形态、生化鉴定与血清分型。微生物形态鉴定 主要是显微镜镜检，但特异性差，且有些微生物形态多变(如双歧杆菌)，若检测微生物与 干扰微生物形态相近更难以准确鉴定判断。生化鉴定得先分离纯化微生物得到单克隆，需 时1-3天，最后做生化鉴定需至少1-3天，耗时费力；一些难以培养的微生物鉴定就更困难。 血清分型鉴定试剂研发周期长，技术要求高，前期投入较多。总之传统微生物计数法特异性 不强、费时费力，特别是样品中干扰微生物与目标检测微生物相似时根本无法准确计数。PCR技术具有快速、灵敏、特异性强的特点。随着基因技术和网络信息技术的发 展，一般细菌的基因序列在网上都可以免费方便地查到；国内微生物基因测序公司也有很 多，测序结果也很准确、方便、便宜，设计微生物种、属甚至菌株特异性PCR引物变得容易、 经济。PCR本身不可以准确计数，最多可以半定量；但随着PCR技术的发展，定量PCR也可 以计数，但定量PCR难以区分样品中微生物的死活，且计数结果常有1-2个数量级的误差。一些文献有同时应用微生物计数和PCR技术的报道，如《用平板计数和聚合酶链反应法检测湖水中大肠杆菌基因工程菌的稳定性》(张松 乐，陈梅玲，张朝隆等.卫生研究，1998，增刊27:152-154.)论文中，将样品稀释，同时用平 板计数和PCR检测，只是利用PCR半定量计数的特点对照二种方法的检测灵敏度，没有把 PCR技术和平板计数技术结合起来。((X-Gal培养基+PCR法快速鉴定酸奶中双歧杆菌》(江晓，陈晓蔚，曾理等.现代预防医学，2005,32(12) =1629-1630)论文中，采用X-Gal培养基对双歧杆菌标准菌和酸奶中 双歧杆菌进行鉴别，而后通过PCR证实该培养基是一种良好的双歧杆菌鉴别培养基，可用 于双歧杆菌快速计数。该文中只是用PCR验证一种选择培养计数双歧杆菌方法的可靠性， 菌体基因组DNA提取方法需要先纯培养再用试剂抽提，操作时间长步骤复杂，实际应用困 难。《利用PCR技术检测致病性腊样芽孢杆菌的研究》(王振国，刘金华，肖成蕊等.生 物技术.2005，15 (5) 45-47)论文中，将待测样品做梯度稀释再做PCR检测，无法区分样品 中死菌和活菌。专利《计数并鉴别微生物的方法》(CN200510069677. 1)公开的一种计数微生物的 方法，它是通过滤膜截留微生物，适合可溶性固体、液体样品中微生物计数，但不适合不溶 性固体、半固体、粘稠性液体的计数，且无法区分样品中的死菌和活菌。该方法难以与现有 国标规定的检测方法对应起来，且没有解决菌体DNA抽提问题。由此可见，上述文献都没有真正把PCR技术应用到样品微生物活体计数方法上。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对传统的活体微生物检验和计数方法的特 异性差以及鉴定费时费力的缺陷，提供一种新的检验和计数活体微生物的方法，该方法操 作简单，鉴定过程需时短，特异性强，结果准确可靠。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是一种检验和计数活体微生物的方 法，包括以下步骤1)对待检样品进行活菌培养计数，初步筛选出阳性可疑微生物；2)随机挑取步骤1)所述的阳性可疑微生物，提取基因组DNA，用目标微生物的特 异性引物进行PCR检测并计数。根据本发明，步骤1)为对待检样品进行活菌培养计数，初步筛选出阳性可疑微 生物。其中，所述的进行活菌培养计数的方法是本领域的常规方法，较佳的是平板计数法或 最大可能数法。所述的进行活菌培养计数的方法采用的培养基是固体培养基或液体培养 基，是适合微生物生长的培养基，如MRS、M17、TPY等。所述的待检样品可以是可溶性固体、 液体样品，不溶性固体、半固体或粘稠性液体样品。所述的待检样品中包括目标微生物之 外，还含有其他微生物。将待测样品置于培养基中后，这些微生物在培养基中都可以生长。 因此，所述培养基较佳的可以是选择培养基。选择培养基可以选择性的减少非目标微生物 中的其他微生物的生长，但不影响目标微生物的生长，从而使培养基中较快得到足够数量 的目标微生物。所述的初步筛选出阳性可疑微生物的方法可以是常规的根据目标微生物的 肉眼外观形态特点，初步区分目标微生物，标记为阳性可疑微生物。在目标微生物占所有微 生物数量比例较少的情况下，较佳的可以针对目标微生物的特异代谢产物加入化学显色试 剂初步区分目标微生物，标记为阳性可疑微生物。根据本发明，步骤2)为随机挑取步骤1)所述的阳性可疑微生物，提取基因组 DNA，用目标微生物的特异性弓I物进行PCR检测并计数。其中，所述的阳性可疑微生物的挑取方法较佳的是用无菌枪头吸取。用无菌枪头 吸取可以保证取得足够多的微生物体数量以利于得到足够数量的基因组DNA。微生物体量太少或没取到，PCR容易出现假阴性结果，影响计数的准确性。用常规的无菌牙签、接菌环 等方法挑取菌落常挑不到微生物体或挑到的微生物体较少。特别是用平板法计数时，菌落 大部分长在固体培养基内，用常规的方法取到微生物体就更困难且容易出现交叉污染，PCR 容易出现假阴性、假阳性结果，计数不准确。最大可能数法计数时，从培养的阳性可疑试管 中获取阳性可疑微生物时，用无菌枪头吸取无疑是最好的选择。因此，为取得足够多的微生 物体数量以利于下一步的操作，使用无菌枪头吸取菌落中的微生物体或含有微生物体的试 管培养物是较佳的选择。所述的提取基因组DNA的方法可以是常规的方法。常规的基因组DNA提取方法要 么效果好通用性强，但操作步骤复杂，工作量大，时间长，容易污染；要么操作简单但通用性 不强，如革兰氏阳性菌的细胞壁坚硬难裂解，特别是芽孢杆菌，一般提取液是难以裂解的。 大部分微生物体基因组DNA提取液都有毒，不环保，对操作者有危害；且残留物对PCR有抑 制作用。因此，本发明中，所述的提取基因组DNA的方法较佳的包括以下步骤用灭菌枪头 吸取微生物体，将微生物体悬浮于抽提试剂中，80 100°C水浴2 30分钟，较佳的100°C 水浴5分钟；所述的抽提试剂是0. 1 5XPCR缓冲液，0. 002 0. 5mol/L氢氧化钠溶液， 较佳的是1XPCR缓冲液，0.02mol/L NaOH0该抽提试剂通用性好，可以裂解各种革兰氏阳 性阴性菌，包括难裂解的芽孢杆菌，环保无毒，且残留物不会影响PCR扩增。该抽提试剂裂 解微生物体，释放出基因组DNA后所得混合物可以直接用作PCR模板，而不需其他处理，如 乙醇沉淀DNA等步骤都可省略，从而实现PCR的快速鉴定。较佳的，同时在平板空白处吸取 培养基作为阴性空白对照，监测PCR污染；以目标微生物体悬浮液作阳性对照，监测PCR试 剂的有效性。所述的目标微生物的特异性引物是在微生物种、属或菌株水平特异性扩增基因序 列的引物。较佳的，所述的基因序列是核糖体以及核糖体转录间区基因序列、或者种属特异 性蛋白或酶的基因序列。所述的核糖体基因序列较佳的如原核细菌的16S rRNA、23S rRNA、 16S-23S rRNA间区或真核细菌的18S rRNA、26S rRNA、18S_26S rRNA间区。本发明提供一 长双歧杆菌特异性的引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的序列是5’-CCA TCATCC GCT TTC G-3’，见序列表中SEQ ID NO. 1所示；下游引物的序列是5’-TGG CAG ACA GGA CCG ATG-3’，见序列表中SEQ ID NO. 2所示。所述的特异性引物可以对一种微生物特异，此时仅 仅检测一种微生物为目标微生物；也可以对多种微生物特异，此时同时检测多种微生物为 目标微生物(即多重PCR)。在取平板上菌落的微生物体时可能由于操作不当、菌落较小等原因，未取到微生 物体或取到较少；以及微生物体代谢物干扰、裂解液对某种微生物失效等原因都会出现假 阴性结果。因此，步骤2)中较佳的同时利用能够特异性扩增培养基中生长出的所有微生物 的通用引物作为PCR检测的阳性标志，用来排除假阴性，保证所检测平板上长出的菌落都 有PCR反应产物，检测微生物体基因组DNA提取效果，使计数结果可靠准确。步骤2)检测结果的计算是根据目标微生物特异性PCR检测的阳性数占所有选出 进行PCR检测的阳性可疑数的比例，以及培养后所有标记为阳性可疑的总数、样品稀释倍 数计算出目标微生物的数量。本发明可以计数混合培养中不同种甚至同种不同株的微生物数量，适合难以找到 合适选择培养基或者选择培养后仍有干扰微生物生长的活体微生物计数，特别适合多菌种
5混合培养中的益生菌计数以及肠道中益生菌定植计数研究。本发明所述的目标微生物包 括细菌、真菌、病毒、放线菌、藻类、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体、原生动物或亚病毒 等，如双歧杆菌、乳酸菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、链球菌或乳杆菌等。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明将PCR技术与传统微生物平板 计数技术有机地结合起来，特异性强，灵敏度高，可靠性好，能够区分样品中活微生物和死 微生物，结果误差小。操作时间短，步骤简单，试剂无毒无害。特别适合混合培养中的益生 菌计数以及肠道中益生菌定植计数研究，特别是样品中干扰微生物与目标检测微生物相似 时也能够准确计数，实际推广应用前景大。当前食品微生物安全问题比较突出，关系到人们的身体健康和生命安全，加强食 品监督，建立和健全相关食品微生物检验的法律法规是必要；但目前所建立的微生物检测 国家标准操作复杂，周期长，费用高，特异性不强，实际操作困难。本发明与现有国标规定的 检测方法对应起来，可以用于快速建立相关微生物检测方法标准，准确可靠。益生菌与人体健康有密切关系，且有特定益生功能。益生菌的活菌数以及在肠道 中的定植，直接影响益生菌产品功效，但遗憾的是益生菌的检测方法相对落后，检测方法特 异性不强，常被不法商家利用，以次充好。本发明可以方便地建立益生菌检测方法，加强益 生菌检测，促进益生菌应用研究。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1是双歧杆菌酸奶平板计数中PCR产物的琼脂糖电泳图。图2是人类粪便平板计数中PCR产物的琼脂糖电泳图。图1和图2中，上面的条带为相应编号的长双歧杆菌定性PCR条带，下面是对应编 号的细菌阳性标志PCR条带，编号M为Wide Range DNAMarker (TaKaRa)，编号0为阴性对 照，编号+为阳性对照，图1、图2中1、2、3. . . 19分别代表选取的单个菌落1、2、3、... 19。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1双歧杆菌酸奶中长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)计数1.长双歧杆菌定性PCR试剂设计对发酵的长双歧杆菌菌株的16S rRNA和23S rRNA之间的间区基因序列进行测 序，NCBI网上比对分析，设计长双歧杆菌定性PCR引物，上游引物5’-CCA TCA TCC GCT TTC G-3，，见序列表中SEQ ID NO. 1所示；下游引物5'-TGG CAG ACA GGA CCG ATG-3，，见序列 表中SEQ ID NO. 2所示。PCR产物长度预计为215bp。细菌阳性标志PCR引物是16S rRNA通用引物，上游引物5，_AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG-3，；下游引物:5，-C TGC TGC CTC CCG TAGGAG-3，。PCR 产物长度预计为 300bp 左右。2.平板计数，PCR鉴定菌落。
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无菌称取25g双歧杆菌酸奶(畅优牌酸奶，光明乳业)放入事先灭菌的含有玻璃 珠的225g无菌生理盐水中，震荡摇勻，用无菌生理盐水试管做10倍系列稀释。选择稀释倍 数是105、IO6UO7的各取Iml放入2个无菌空培养皿中，倒入冷却到适合温度的TPY琼脂培 养基(TPY琼脂培养基为(g/L)水解酪蛋白10.0，植物胨5.0，酵母浸出粉2.0，葡萄糖5.0， 琼脂13. 0，半胱氨酸0. 5，磷酸氢二钾2. 0，氯化镁0. 23,硫化锌0.14，氯化钙0.15，氯化铁 0. 03，吐温-801ml，pH6. 5)，摇勻，冷却凝固后放入厌氧培养箱37°C培养72小时后计数。选 择菌落数在30-300之间的平板，取2个平板长出菌落的平均数乘上稀释倍数得出双歧杆 菌酸奶中双歧杆菌阳性可疑菌落总数为6. 5X 108cfu/g。随机选取19个阳性可疑菌落，用 灭菌枪头吸取菌体，吹吸数次将微生物体悬浮于抽提试剂中，抽提试剂是1 X PCR缓冲液， 0. 02mol/L NaOH。100°C水浴5分钟，混合物直接作为PCR模板。同时在平板空白处吸取 培养基用抽提试剂提取作为阴性空白对照，用长双歧杆菌(购自丹尼斯克(中国)有限公 司)纯培养的菌悬液作阳性对照。PCR扩增条件为95°C预热5min，30个循环(95°C，30S ； 550C，30S ；72°C，30S)，72°C延伸5min。采用TaKaRa公司的PCR试剂盒进行PCR反应，PCR反 应体系为上游引物(5ymol/L)3y 1，下游引物(5ymol/L)3y 1,2. 5mmol/L dNTP2. 4μ 1, 10 X PCR Buffer 3 μ 1，模板 DNA 1 μ 1，Taq DNA 聚合酶 IU，加去离子水至 30 μ 1。PCR产物电泳条带有以下三种情况(1)只有细菌阳性标志扩增条带(300bp左右)而无长双歧杆菌扩增条带 (215bp)，则所检测的菌落不是长双歧杆菌，而是其他细菌。(2)细菌阳性标志和长双歧杆菌2条扩增条带都没有，则所检测的菌落基因没有 裂解好或没有吸取到菌体。(3)有细菌阳性标志和长双歧杆菌2条扩增带，则所检测的菌落为长双歧杆菌。PCR产物的琼脂糖电泳图见图1，图中上面的条带为相应编号的长双歧杆菌 定性PCR条带，下面是对应编号的细菌阳性标志PCR条带，编号M为Wide Range DNA Marker (TaKaRa)，编号0为阴性对照，编号+为阳性对照，图1中1、2、3. . . 19分别代表选取 的单个菌落1、2、3、. . . 19。3.计算长双歧杆菌的活菌数。选取的19个菌落都有细菌阳性标志PCR条带，有效菌落数为19。其中有6个为长 双歧杆菌，其含有的比率为6/19。TPY平板计数的菌落数为6. 5 X 108cfu/g,乘上比率6/19， 结果所检测的酸奶中长双歧杆菌的菌落数为2. lX108cfu/g。实施例2肠道中长双歧杆菌活菌计数1.长双歧杆菌定性PCR试剂同实施例1。2.平板计数，PCR鉴定菌落无菌称取新鲜人体粪便，吹入二氧化碳气体，用带有玻璃珠的无菌水振荡混勻，稀 释，用TPY琼脂培养基倒平板计数，计数结果为6.3X 109cfu/g。其他步骤同实施例1。PCR产物的琼脂糖电泳图见图2，图中上面的条带为相应编号的长双歧杆菌定性 PCR条带，下面是对应编号的细菌阳性标志的PCR条带，编号M为Wide Range DNA Marker, 编号0为阴性对照，编号+为阳性对照，图2中1、2、3. . . 19分别代表选取的单个菌落1、2、 3、···19ο
3.计算长双歧杆菌的活菌数选取的19个有效菌落中有13个为长双歧杆菌，其含有的比率为13/19。TPY平板 计数的长双歧杆菌阳性可疑菌落数为6. 3X109cfu/g，乘上比率13/19，结果所检测的粪便 中长双歧杆菌的菌落数为4. 3X 109cfu/g。实施例3牛奶中常见耐热芽孢杆菌检测计数枯草群芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌 (B. Iicheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)是牛奶中常见耐热芽孢杆菌，它们影响 牛奶产品的质量的好坏。特异性的多重PCR引物序列来自文献《应用多重PCR鉴定微生物 肥料常用芽孢杆菌》(曹凤明，沈德龙，李俊等.微生物学报，2008，48 (5) :651-656)，见表1 ； 细菌阳性标志PCR引物同实施例1。表1.PCR 引物
权利要求
一种检验和计数活体微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤1)对待检样品进行活菌培养计数，初步筛选出阳性可疑微生物；2)随机挑取步骤1)所述的阳性可疑微生物，提取基因组DNA，用目标微生物的特异性引物进行PCR检测并计数。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的进行活菌培养计数的方法是 平板计数法或最大可能数法。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的待检样品是可溶性固体、液体 样品，不溶性固体、半固体或粘稠性液体样品。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的初步筛选出阳性可疑微生物 的方法是根据目标微生物的肉眼外观形态特点，初步区分目标微生物，标记为阳性可疑微 生物；或者是针对目标微生物的特异代谢产物加入化学显色试剂初步区分目标微生物，标 记为阳性可疑微生物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的阳性可疑微生物的挑取方法 是用无菌枪头吸取。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的提取基因组DNA的方法包括 以下步骤用灭菌枪头吸取微生物体，将微生物体悬浮于抽提试剂中，80 100°C水浴2 30分钟；所述的抽提试剂是0. 1 5XPCR缓冲液，0. 002 0. 2mol/L氢氧化钠溶液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的目标微生物的特异性引物是 在微生物种、属或菌株水平特异性扩增基因序列的引物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的目标微生物为长双歧杆菌，所述的目 标微生物的特异性引物是一引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的序列是5’ -CCA TCA TCC GCT TTC G-3，，见序列表中SEQID NO. 1所示；下游引物的序列是5’_TGG CAG ACA GGA CCG ATG-3，，见序列表中 SEQ ID NO. 2 所示。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，同时在平板空白处吸取培养基作 为阴性空白对照，监测PCR污染；以目标微生物体悬浮液作阳性对照，监测PCR试剂的有效 性；同时利用能够特异性扩增培养平板上生长出的所有微生物的通用引物作为PCR检测的 阳性标志。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的目标微生物包括细菌、真菌、 病毒、放线菌、藻类、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体、原生动物或亚病毒。
11.一引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的序列是5’-CCATCA TCC GCT TTC G-3’，见序列表中SEQ ID NO. 1所示；下游引物的序列是5’_TGG CAG ACA GGA CCG ATG-3', 见序列表中SEQ ID NO. 2所示。
全文摘要
本发明公开了一种检验和计数活体微生物的方法，包括以下步骤1)对待检样品进行活菌培养计数，初步筛选出阳性可疑微生物；2)随机挑取步骤1)所述的阳性可疑微生物，提取基因组DNA，用目标微生物的特异性引物进行PCR检测并计数。本发明将PCR技术与传统微生物计数技术有机地结合起来，特异性强，灵敏度高，可靠性好，能够区分样品中活微生物和死微生物，结果误差小。操作时间短，步骤简单，试剂无毒无害。适合混合培养中的益生菌计数以及肠道中益生菌定植计数研究，特别是样品中干扰微生物与目标检测微生物相似时也能够准确计数，实际推广应用前景大。
文档编号C12Q1/06GK101935688SQ20091005411
公开日2011年1月5日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者张红发, 王荫榆, 舒妹, 郭本恒 申请人:光明乳业股份有限公司