具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株的制作方法

文档序号:572799阅读:256来源:国知局
专利名称:具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株的制作方法
技术领域
本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域,具体涉及一种具有骨、肝、肾上腺转 移高潜能的中国人肺腺癌细胞株及其用途。
背景技术
肺癌是严重威胁人类生存和发展的恶性疾病之一,已成为肿瘤疾病中的头号杀 手。2006年,美国确诊肺癌新病例约174470人,约占全部肿瘤的13% (男性)和12% (女 性),发病率仅次于皮肤癌;死于肺癌者约162460人,约占全部肿瘤的31 % (男性)和26% (女性),死亡率位居第一[1 2]。日本每年肺癌新发病例超过50000人,死亡率近90% [3]。 据上海市近年的恶性肿瘤发病调查显示,肺癌(21.56%)高居上海男性恶性肿瘤发病率 榜首,在女性中则仅次于乳腺癌[4]。肺癌死亡率长期居高不下的主要原因在于难以早期诊 断和它的高转移性,许多患者首诊时即发现有多器官转移[3]。骨转移占肺癌病人的30 70%,仅次于乳腺癌和前列腺癌[5 7]。调查显示,超过1/3的患者会发展成溶骨性病变,引 起疼痛、病理性骨折、脊髓压迫和高钙血症。使患者的生活质量严重下降,最后导致死亡,病 程一般不超过6个月[3’8]。由于肺癌骨转移的生物学机制至今尚不明确,临床缺乏有效的治 疗方法,因此,研究肺癌骨转移发病机制并探索有效的诊疗方法是国内外学者长期以来的 努力方向。尽管随着分子生物学、信号传导途径、蛋白功能研究等基础学科的发展,人类对 疾病发病机理的研究手段有了突飞猛进的发展,但由于种种客观限制,该领域的研究仍未 有重要突破。有研究报道,虽然宿主微环境因素,包括破骨细胞以及一些具有生长因子功能的 基质蛋白等对肿瘤的转移具有一定的作用[3’9 1(1]。肿瘤细胞自身生物学特性无疑是骨转移 发生更为主要而直接的原因。由于肺癌骨转移的发生大多见于晚期的手术禁忌患者,临床标本取材受限,在很 大程度上迟滞了肺癌骨转移诊疗研究的进展。因此,如能建立有效的人肺癌骨转移细胞模 型,尤其是发现和建立亲代人肺癌细胞的骨转移模型,不仅能更接近人类本身的生物学特 性,而且所建的亲代人肺腺癌细胞模型可以更有效地发现人肺腺癌骨转移的肿瘤生物学特 性,,进而利用所建细胞模型研发相关的功能基因,直接进行干预性治疗研究,其优越性是 临床标本及其他模型所难以企及的。肿瘤转移动物模型的理论基础在于肿瘤细胞体内自发转移大多具有相对固定的 靶组织。经研究发现,这一特性是由肿瘤组织中少量亚群细胞所决定的。在一定的条件下, 该类细胞会按相对固定的模式在特定靶组织形成肿瘤转移灶。因此,以肿瘤细胞株反复多 代接种免疫缺陷动物筛选后,此类亚群细胞得到有效的富集,靶组织转移率渐进升高。无论是肺癌的基础研究,包括病理学、免疫学、遗传学、药物基因组学、肺癌功能基 因组学还是肺癌的临床诊疗实践,都要求研究者必须根据国情和国人肺癌发病特点,走自 己的研发之路。细胞是生命之源,肿瘤细胞是万恶之首。建立我国自己的新型的高转移的 肺癌细胞模型将具有显著的科学意义和社会价值。与本发明相关的现有技术有(以引入上
3文中)参考文献[1]. American Cancer Society. Cancer facts and figures 2006. Atlanta, GA American Cancer Society ;2006.pp. 5 6[2]. Alex G. Little a, E.Greer Gayb, Laurie E. Gaspare, Andrew K. Stewartd. National survey of non—small cell lung cancer in the United States Epidemiology, pathology and patterns of care. Lung Cancer 2007,57 (2) 253-260[3]. Saburo Sone & Seiji Yano. Molecular pathogenesis and its therapeutic modalities of lungcancer metastasis to bone. Cancer Metastasis Rev.Springer Science+Business Media, LLC. 2007[4]. 2003年上海市市区恶性肿瘤发病率.肿瘤,2006,26 (7) 694.[5]· Coleman RE. Metastatic bone disease :clinical features, pathophysiology and treatment strategies. Cancer Treat Rev 2001 ;27 :165—176.[6], G. David Roodman. Mechanisms of Bone Metastasis. NEJM. 2004, 350 (4) 1655-1664[7] .Einat Even-Sapir. Imaging of malignant bone involvement by morphologic, scintigraphic, and hybric modalities. J Nucl Med. 2005 ;46 (8) :1356 1367[8]. Katakami N. Lung cancer with bone metastasis. Gan To Kagaku Ryoho. 2006 ;33 (8) 1049-53.[9]· J.S.Nam, A. M. Suchar, M. J. Kang, et al. Bone Sialoprotein Mediates the Tumor Cell-Targeted Prometastatic Activity of Transforming Growth Factor beta in a Mouse Model of Breast Cancer. Cancer Res. 2006 ;66 (12) :6327_35·[10]. Hayashi C, Rittl ing S, Hayata Τ, et al. Serum osteopontin, an enhancer of tumor metastasis to bone,promotes B16melanoma cell migration. J Cell Biochem. 2007 ; 101 (4) :979_86·

发明内容
本发明的目的是提供一种具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株 (简称CPA-Yang3)。本发明的进一步目的是提供该肺癌细胞株的医用用途。本发明采用肺腺癌首诊患者(55岁女性)的胸水作细胞原代培养,该人肺腺癌细 胞经动物实验证实该亲代细胞已具有仅限于骨转移的生物学特性;第5代后的该亲代细 胞经小鼠体内诱导后经裸鼠接种细胞悬液,三周后能检出70%骨转移;解剖发现有50% 肝转移;20%肺和肾上腺转移;骨转移细胞扩增后,裸鼠核素骨显像和X线拍片显示,80% 的鼠在第二个循环后,核素骨显像检出骨转移灶,第三个循环后小鼠骨转移达90%以上。 本发明建立了具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株(The Chinese Human Lung Adenocarcinoma cell with Highly Bone、 Liver and Adrenal Gland Metastases, CPA-Yang3)。该细胞已于2009年7月2日保藏,保藏单位中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(CGMCC),北京市朝阳区大屯路甲3号,北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所,100101,保藏编号CGMCC No.3137,分类命名人肺腺癌细胞株 CPA-Yang3(The Chinese Human Lung Adenocarcinoma cell with Highly Bone、Liver and Adrenal Gland Metastases, CPA_Yang3)。本细胞株具有以下生物学特性1,贴壁生长,致瘤率高,自采集新鲜胸水做细胞培养的第三天已发现所有细胞培养瓶底都有部分细胞长 出;第七天,对三瓶长满培养瓶底的细胞用胰酶消化,取细胞数约为4 X 106,用生理盐水洗2 遍后制成细胞悬液,浓度为lX107/mL。分别接种在2只免疫缺陷小鼠两侧皮下。接种60 天仍不长瘤。传至第四代才致瘤并100%长瘤。一个月后长成3. 5X4mm2和4. 7X28mm2, 6. 5X5. 8mm2、7. 2X5. 7mm2。致瘤率 100%。2,绘制细胞生长曲线显示,生长快速和代谢旺盛。3,ESM1、VEGF-C、IL-6、IL-8、SVIL 和 AR 基因表达水平,采用RT-PCR法对本中国人肺腺癌细胞CPA-Yang3和SPC-A-I进行ESMl、VEGF_C、 IL-6、IL-8、SVIL、AR和FNl基因表达水平的比较,结果显示,本中国人肺腺癌细胞的部分癌 基因ESM1、VEGF-C、IL-6、IL-8、SVIL、AR禾口 Fm基因表达水平明显高于SPC-A-1细胞。4,CPA-Yang3是以骨转移为主的具有肝和肾上腺高转移潜能的细胞株第5代后的亲代细胞经小鼠体内诱导后给每只裸鼠左心室分别接种 70X 105/0. ImL细胞悬液,三周后经自创微孔针孔活体成像方法能检出70%骨转移;解剖时 肉眼发现有50%肝转移;20%肺和肾上腺转移;取膝关节转移灶培养骨转移细胞成功扩增 后再给裸鼠左心室注射三周后行核素骨显像和X线拍片,80%的鼠在第二个cycle后还是 能被核素骨显像检出骨转移灶而不能被X线检出。检出的骨转移灶主要集中在下颂骨、膝 关节、肱骨和脊柱。小鼠左心室接种70万细胞,存活期3周。具有较强侵袭能力。第三个 循环后小鼠骨转移达90%以上。5,骨转移细胞生长速度快,细胞形态完整,具有典型的荷瘤CPA-Yang3骨转移小 鼠病理图。本发明建立了一个具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株。经实验 证实,中国人肺腺癌细胞系CPA-Yang3是转移能力很强的肺癌细胞。该细胞经左心室注射 仅70万细胞2周后小鼠出现转移且小鼠严重消瘦,以至于本发明在实验过程中出现过整个 cycle的两笼小鼠全军覆没的结果。本实验结果显示了其良好的均一性和重复性;骨转移 细胞生长速度快,细胞形态完整。经3个in vivo-in vitro后骨转移达到90%以上。是个 值得研究的国人肺癌细胞株。也是个良好的肺癌转移细胞模型,为系统研究肺癌多发转移 提供了技术平台。本发明建立了高潜能转移人肺腺癌亲代细胞株,能对人肺腺癌骨转移进行早期诊 断提供参考数据,还可进一步建立相关基因芯片技术,综合运用基因芯片、实时定量PCR、蛋 白印迹(Western Blotting)等技术,评估探索各种药物包括化学、生物、免疫、中医药、放射 性药物等治疗疗效。为探索诊疗人体肺癌骨转移提供技术平台。同时,进一步分析肺癌转移相关的功能基因组以及转移的相关基因,可加深对肺 癌转移分子机理的认识,为骨转移的早期诊断、评估疗效提供一种有效的分子检测方法。


图1是第二代CPA-Yang3细胞(AX 100)和(B X 200)的相差显微镜图。图2是第四代细胞皮下种植30天。图3是CPA_Yang3细胞生长曲线。图 4 是 RT-PCR 法比较 CPA_Yang3 与 SPC-A-l 部分基因 ESMl、VEGF-c、IL-6、IL_8、 SVIL、AR、FN1的表达水平。图5是CPA-Yang3膝关节转移细胞左心室接种后小鼠微孔针孔骨显像示其中,A 左下颂骨、左肱骨、左膝关节和脊柱转移,骨转移灶做细胞培养一周后又 长出;B:右下颂骨、两肱骨、颈椎、脊柱转移。图6是CPA-Yang3骨转移细胞接种后小鼠骨转移病理,其中,Α:膝关节 (HEX200) ;B 腰椎(HEX 100)。图7是CPA-Yang3人肺腺癌骨转移细胞X 100。
具体实施例方式实施例1取肺腺癌首诊患者(55岁女性)的胸水作细胞原代培养,采集新鲜浅黄色胸水50 毫升,每细胞培养瓶吸8毫升胸水加2毫升不含牛血清的RPMI1640培养液和双抗后稍摇 勻,放入培养温度为37°C、C02浓度为5%的德国贺利氏BB16型二氧化碳孵养箱内培养。五 天后光镜下观察时发现细胞培养瓶底约有30%的面积已长满细胞。细胞呈贴壁生长;贴壁 细胞大多呈多边形。细胞体积较大。培养初期细胞生长缓慢;细胞形态稳定,传至第10代, 细胞形态和生长速度稍变快。冻存复苏后性状不变。在相差倒置显微镜下观察CPA-Yang3 细胞生长情况贴壁细胞多为大小不等的多边形,核大、核仁2-3个,可见分裂相,分裂后细 胞仍呈贴壁状,细胞异质性明显。胰酶消化后计数2X IO5细胞加入一细胞培养瓶按常规细 胞培养。在相差显微镜下,拍摄细胞生长图片。该人肺腺癌细胞经动物实验证实该亲代细胞已具有仅限于骨转移的生物学特性; 第5代后的该亲代细胞经小鼠体内诱导后给每只裸鼠左心室分别接种70X1070. ImL细胞 悬液,三周后经自创微孔针孔活体成像方法能检出70%骨转移;解剖时肉眼发现有50%肝 转移;20%肺和肾上腺转移;取膝关节转移灶培养骨转移细胞成功扩增后再给裸鼠左心室 注射三周后行核素骨显像和X线拍片,80%的鼠在第二个cycle后还能被核素骨显像检出 骨转移灶而不能被X线检出。检出的骨转移灶主要集中在下颂骨、膝关节、肱骨和脊柱。小 鼠左心室接种70万细胞,存活期3周。具有较强侵袭能力。第三个循环后小鼠骨转移达90 % 以上。建立了具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株(The Chinese Human Lung Adenocarcinoma cell with Highly Bone、Liver and Adrenal Gland Metastases, CPA-Yang3)。实施例2上述人肺腺癌细胞(CPA-Yang3)70X 104,注入免疫缺陷小鼠血液系统,两周后隔 天称重,第三周起每周进行核素骨显像检测,结果证实,该亲代细胞是高潜能骨转移肺癌细 胞(图8)。所述的培养基为含10%胎牛血清RPMI1640或DMEM培养基,pH = 7,培养温度为37°C,5% C02。实施例3RT-PCR检测显示与现有技术已建立的SPC-A-I国人肺腺癌相比,部分癌基因 ESM1、VEGF-C、IL-6、IL_8、SVIL、AR和Fm基因表达水平明显高于SPC-A-I细胞。
权利要求
一种具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株,其特征是所述细胞为具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株CPA Yang3,保藏编号CGMCCNo.3137,分类命名中国人肺腺癌细胞系;具有以下生物学特性1)贴壁生长,致瘤率高至100%;2)生长快速和代谢旺盛;3)癌基因ESM1、VEGF C、IL 6、IL 8、SVIL和AR基因表达水平高于SPC A 1细胞;4)以骨转移为主,具有肝和肾上腺高转移潜能;5)骨转移细胞生长速度快,细胞形态完整。
2.根据权利要求1所述的具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株,其 特征是所述细胞传至第四代免疫缺陷小鼠致瘤并100%长瘤,一个月后长成3.5X4mm2和 4. 7X28mm2,6. 5X5. 8mm2,7. 2X5. 7mm2,致瘤率 100%。
3.根据权利要求1所述的具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株,其特 征是所述细胞的骨转移灶为下颂骨、膝关节、肱骨和脊柱,三周后骨转移70% ;50%肝转 移;20%肺和肾上腺转移;第三个循环后骨转移达90%以上。
4.权利要求1的具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株在制备诊断人肺 腺癌相关基因芯片中的用途。
5.权利要求1的具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株在制备检测治疗 人肺腺癌相关药物疗效的分子检测方法中的用途。
全文摘要
本发明属微生物动物细胞系领域。提供了一种具有骨、肝和肾上腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株。本发明采用肺腺癌首诊患者的胸水作细胞原代培养,该人肺腺癌细胞保藏编号CGMCC No.3137,分类命名人肺腺癌细胞系CPA-Yang3,具有贴壁生长,致瘤率高至100%;生长快速和代谢旺盛;癌基因ESM1、VEGF-C、IL-6、IL-8、SVIL和AR基因表达水平高于SPC-A-1细胞;以骨转移为主,具有肝和肾上腺高转移潜能和骨转移细胞生长速度快,细胞形态完整生物学特性。本发明能对人肺腺癌骨转移进行早期诊断提供参考数据,还可进一步建立相关基因芯片技术,综合运用基因芯片、实时定量PCR、蛋白印迹等技术,评估探索各种药物等治疗疗效。
文档编号C12Q1/68GK101955911SQ200910054739
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者杨顺芳 申请人:上海市胸科医院
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