专利名称：：荧光假单胞菌微生物农药的制备方法
技术领域：
：-本发明属于微生物农药，具体地说是一种荧光假单胞菌微生物农药的制备方法。
背景技术：
：我国是油菜种植大国，油菜菌核病是危害油菜生产和产量的最大病害之一，每年我国因油菜菌核病造成的减产高达总产量的30%80%。现有技术采用农业防治和化学防治相结合的办法，但是效果都不理想。农业防治治标不治本，化学防治又对环境造成污染和危害。当代生物农药尤其是微生物农药发展迅速，目前已有报道利用盾壳霉、芽孢杆菌等对油菜菌核病进行生物防治。从土壤中筛选放线菌和植物内生细菌yc8能抑制油菜菌核病菌菌丝的生长和菌核的形成；用油菜内生枯草芽孢杆菌BY-2产生的胞外物质来抑制油菜菌核病菌的生长小面积实验已取得一定的防治效果。但是在大田推广实验时，因为菌体活性不稳定，使得防治油菜菌核病效果不稳定。所以发展油菜生产，迫切需要开发一种防治效果好、对环境无污染的微生物新农药。
发明内容本发明的目的是提供一种既能有效防治油菜菌核病，又对环境无污染，同时制备简单、使用方便、对油菜生长起促进作用的荧光假单胞菌微生物农药的制备方法。本发明的目的是这样实现的一种荧光假单胞菌微生物农药的制备方法，包括以下步骤(1)取下列重量比物质均匀混合，制备液体培养基蛋白胨2份甘油l份K2HP04.3H200.15份MgS047H200.15份蒸馏水96.7份；(2)用移液枪按照1%的接种量将荧光假单胞菌P13菌种接种入液体培养基中，放入恒温摇床，转速200转/分钟，振荡培养24小时；(3)将振荡培养后的菌体悬液转入灭菌离心管，置入转速为8000转/分钟的冷冻离心机离心10分钟，沉淀制得P13菌体；(4)配制质量分数为1%的羧甲基纤维素钠溶液，在12rC灭菌30分钟备用；将硅藻土置入高压蒸汽灭菌锅12rC灭菌30分钟，烘干备用；(5)将步骤(3)制得的菌体用新鲜液体培养基悬浮，加入1%羧甲基纤维素钠溶液，混合均匀；倒入装有硅藻土的容器中，搅拌；密封容器，室温放置1-2天；荧光假单胞菌微生物农药制成；(6)将步骤(5)制得的荧光假单胞菌微生物农药装入包装容器，室温保存。荧光假单胞菌微生物农药的制备方法，实施要点在于-(1)步骤(2)、(5)在超净工作台中无菌操作；(2)步骤(5)密封材料为灭菌纱布或橡胶塞；(3)步骤(6)的包装容器为干燥的塑封袋、塑料瓶、玻璃瓶。本发明制备方法的实验室具体操作程序例如1、按照1%接种量用1000微升的移液枪将荧光假单胞菌P13菌株接种入100ml的KMB液体培养基；(KMB液体培养基成分蛋白胨20g，甘油10ml，K2HP04*3H201.5g，MgS04*7H201.5g，蒸馏水1000ml，pH自然)中，放在恒温摇床里，转速为200转/分钟，振荡培养24小时。2、在超净工作台中，以无菌操作方式用移液枪将培养24小时的菌体悬液转入事先已灭菌过的离心管中，在将离心管放入冷冻离心机中离心，转速8000转/分钟，离心10分钟，沉淀为P13菌体。用无菌接种环蘸取少许沉淀，用平板划线法将其接种至新鲜的KMB固体培养基(KMB固体培养基成分:蛋白胨20g，甘油10ml，K2HP04'3H201.5g，MgS047H201.5g，琼脂粉15%20%，蒸馏水1000ml，pH自然)上，置于恒温培养箱中，28°C，培养24小时，该方法可以检测该离心条件是否能获得活P13菌体，如果培养基上有菌体形成，则证明该离心条件下获得的是活菌体，若没有菌落形成，则说明该离心条件不适合获得活菌体。3、制备农药选用的载体材料是干粉状白色或灰白色硅藻土，硅藻土先用高压蒸汽灭菌锅121°C，灭菌30分钟，灭菌后烘干备用。助剂材料是羧甲基纤维素钠(CMC)，将CMC配制成质量分数为1%的溶液，121°C，灭菌30分钟后备用。4、在超净工作台中，将离心后的菌体用少许新鲜的KMB液体培养基悬浮后，再加入2滴1%CMC溶液，轻轻振荡混匀，倒入装有硅藻土的锥形瓶中，用无菌玻璃棒搅拌均匀，之后用灭过菌的八层纱布将锥形瓶瓶口密封，室温放置1-2天，再转入千燥的塑封袋或干燥的玻璃瓶、塑料瓶中，室温保存即可。加入新鲜KMB液体培养基的目的是使菌体悬浮，并提供一定的养分，但是加入量不宜过多，以使最终搅拌均匀后硅藻土不结团块为标准。实验室小量制备，用无菌玻璃棒搅拌；大量生产，用搅拌器搅拌，使硅藻土与菌体充分混匀。本发明农药抑菌活性测定程序如下(1)实验靶标油菜菌核病菌(6b7eroz^77&sc7ero"or")由国家南方农药创制中心(上海)提供；油菜种子油研7号，购于安徽省合肥丰乐种子有限公司，该品种对油菜菌核病敏感；(2)仪器设备电子分析天平、打孔器、脱脂棉、棉线、喷水壶；(3)药剂处理用分析天平(0.0001g)称取一定质量的干粉状活体P13农药，加入清水，配制成500倍的稀释液。(4)实验方法A、离体叶片实验从植物园摘取叶位一致、大小相近的新鲜健康油菜叶子，用清水洗净后放在500倍的农药稀释液中浸泡10分钟；将叶片置于铺有无菌湿润滤纸的白瓷盆中，并用保鲜膜覆盖白瓷盆，放在25°C，湿度为90%的培养箱中培养，每5片叶子为一个处理，各处理3次重复，3天后用打孔器取油菜菌核病菌菌饼(直径为6cm)，将有菌丝的一面贴于叶片上端，每天观察患病情况，对照组用无菌水代替500倍的农药稀释液。B、温室盆栽实验在温室里，挑选粒大饱满、大小相近、颜色均一的健康油菜种子，不进行表面消毒直接播种于塑料花盆中(c^l5cm)，设置5个花盆为一个处理，每盆3株，每个处理3次重复。油菜出苗后至一叶期期间，连续浇灌稀释500倍的农药稀释液3次，于四叶期在叶柄与主茎接合处接种油菜菌核病菌菌饼，具体方法是先用清水冲洗叶片、叶柄和主茎，再用无菌水反复擦洗叶柄与主茎交汇处，接着用无菌棉球蘸取稀释500倍的P13药剂擦拭，然后用蘸有P13农药稀释液的棉球包裹叶柄与主茎交汇处，三天后将油菜菌核病菌菌饼(c^6mm)倒贴与此交汇处，用无菌棉球保湿固定，每天喷水三次保证棉球湿润。3天后观察病情，对照组用清水代替农药稀释液进行处理。C、田间实验挑选粒大饱满、大小相近、颜色均一的健康油菜种子，不进行表面消毒直接播种于上海师范大学植物园实验田(2mX8m)中，出苗至一叶期开始对油菜进行处理，连续用500倍的农药稀释液浇灌幼苗3次，于四至五叶期接种油菜菌核病菌菌饼(方法同温室实验)，3天后观察病情，对照组用清水代替农药稀释液进行处理。荧光假单胞菌活体微生物农药在油菜幼苗期使用，可以增强作物抗油菜菌核病的能力，延迟染病时间，大大降低植株发病率，长期施用可以显著促进作物生长。荧光假单胞菌活体微生物农药的应用价值(1)防治油菜菌核病荧光假单胞菌活体微生物农药能显著抑制油菜菌核病菌菌丝的生长和菌核的形成，施用到田间后，能诱导作物产生系统抗性，增强抵御油菜菌核病的能力，起到预防和防治油菜菌核病的效果。(2)促进作物生长-作物出苗后施用荧光假单胞菌活体微生物农药，并在整个生长过程中多次施用，可以显著促进作物生根和叶片的生长，进而促进植株生长。(3)农药开发成本低荧光假单胞菌活体微生物农药的活性成分是荧光假单胞菌，该菌具有易获得、易培养、易收集、对人体及动植物无害的特点，加工农药选用的载体及助剂材料价格低廉，制备工艺简便易行。(4)农药使用操作简单荧光假单胞菌活体微生物农药为干粉状，使用前加水稀释，采用浇灌和喷洒的方式施用均可。6本发明的效果通过实验室离体叶片实验、温室实验和田间实验表明荧光假单胞菌活体微生物农药药效稳定，能显著降低发病率和病情指数；与对照组相比，防治效果高达80%以上；促进油菜生长作用明显，能明显促进油菜根系和叶片的生长。下表是在不同实验条件下，稀释500倍的荧光假单胞菌P13活体微生物农药对油菜菌核病的防治效果及其的使用对油菜生长的影响，其中"l"表示先用500倍的农药稀释液处理，再接种油菜菌核病菌；"2"表示直接用培养24小时的P13菌体悬液处理，再接种油菜菌核病菌；"3"表示对照组，即用清水处理后再接种油菜菌核病菌。离体叶片实验具有快速检测的特点，但是实验易受叶片本身枯萎和叶片保鲜等原因的影响。表中数据表明，在短时间内，与对照组相比，农药稀释液处理过的叶片虽然也是全部发病，但病情严重程度相对较低，可以起到一定的保护效果。温室实验和田间实验的数据都说明P13活体农药对油菜菌核病的防治起到了明显的作用，防治效果都在80%以上。由于使用的是活体农药，P13菌体可以通过自身在土壤及植物根际定植来发挥其对作物促进生长的作用，体现在浇灌该农药后，油菜幼苗鲜重明显增大，幼苗长叶片的数目增多，这些都有助于作物产量的提高。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明的优点是1.具有高效抑制油菜菌核病菌的生长，防治油菜菌核病效果显著。2.能促进油菜生长。3.无毒、无副作用，人畜安全。4.制备工艺简单、生产容易、成本低。5.使用方法简便。本发明在世界上首次选用荧光假单胞菌P13菌株，以硅藻土为载体，制备荧光假单胞菌微生物农药，具备新颖性和创造性；本发明制备的荧光假单胞菌微生物农药在油菜生产中应用，可以有效防治油菜菌核病，促进作物生长，提高油菜产量，具有广泛的实用性。具体实施例方式下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明实施例1:荧光假单胞菌微生物农药的制备方法步骤如下(1)制备液体培养基，取下列重量比物质均匀混合蛋白胨20克;甘油10毫升；K2HP043H201.5克；MgS047H201.5克；蒸馏水1000毫升；(2)在超净工作台中用移液枪将1毫升荧光假单胞菌P13菌悬液接种入100毫升液体培养基中，放入恒温摇床，转速200转/分钟，振荡培养24小时；(3)将振荡培养后的菌体悬液转入灭菌离心管，置入转速为8000转/分钟的冷冻离心机离心10分钟，沉淀制得P13菌体；(4)取1克羧甲基纤维素钠，加入99克蒸馏水中，搅拌均匀，在温度121。C条件下灭菌30分钟；(5)取10克白色粉末状硅藻土置入高压蒸汽灭菌锅中，12rC灭菌30分钟，取出后烘干备用；(6)将步骤(3)制得的菌体用0.51毫升新鲜的液体培养基悬浮，加入1%羧甲基纤维素钠溶液4滴，混合均匀；倒入装有硅藻土的三角烧瓶中，用无菌玻璃棒搅拌；然后用8层灭菌纱布密封瓶口；室温下放置2天；荧光假单胞菌微生物农药制成。(7)将步骤(6)制得的荧光假单胞菌微生物农药装入塑料袋每10克1袋，抽真空，塑料袋封口，室温保存。背负式喷雾器装入规定水位的水，取2袋荧光假单胞菌微生物农药，兑入水中，搅拌；油菜田苗期喷雾l亩。实施例2:荧光假单胞菌微生物农药的制备方法步骤如下(1)制备液体培养基，取下列重量比物质均匀混合蛋白胨40克；甘油20毫升；K2HP04'3H203克；MgS04*7H203克；蒸馏水2000毫升；(2)在超净工作台中用移液枪将10毫升荧光假单胞菌P13菌株接种入IOOO毫升液体培养基中，放入恒温摇床，转速200转/分钟，振荡培养24小时；(3)将振荡培养后的菌体悬液转入灭菌离心管，置入转速为8000转/分钟的冷冻离心机离心10分钟，沉淀制得P13菌体；(4)取1克羧甲基纤维素钠，加入99克蒸馏水中，搅拌均匀，在温度12rC条件下灭菌30分钟；配制质量分数为1%的羧甲基纤维素钠溶液备用；(5)取10000克白色粉末状硅藻土置入高压蒸汽灭菌锅，121°。灭菌30分钟，取出后烘干备用；(6)将步骤(3)制得的菌体用10毫升新鲜的液体培养基悬浮，加入2毫升1%羧甲基纤维素钠溶液，混合均匀；倒入装有10000克硅藻土的不锈钢容器中，搅拌机搅拌；然后用不锈钢盖密封容器；室温下放置2天；荧光假单胞菌微生物农药制成。(7)将步骤(6)制得的荧光假单胞菌微生物农药装入塑料袋每10克1袋，塑料袋封口，室温保存。20公斤塑料水桶装满水，取4袋荧光假单胞菌微生物农药，兑入水中，搅拌；油菜田苗期灌根。实施例3:荧光假单胞菌微生物农药的制备方法步骤如下(1)制备液体培养基，取下列重量比物质均匀混合蛋白胨40克；甘油20毫升；K2HP043H203克；MgS047H203克；蒸馏水2000毫升；(2)在超净工作台中用移液枪将10毫升荧光假单胞菌P13菌株接种入1000毫升液体培养中，放入恒温摇床，转速200转/分钟，振荡培养24小时;(3)将振荡培养后的菌体悬液转入灭菌离心管，置入转速为8000转/分钟的冷冻离心机离心10分钟，沉淀制得P13菌体；(4)取1克羧甲基纤维素钠，加入99克蒸馏水中，搅拌均匀，在温度12rC条件下灭菌30分钟；配制羧甲基纤维素钠溶液备用；(5)取10000克白色粉末状硅藻土置入高压蒸汽灭菌锅，121'C灭菌30分钟，取出烘干；(6)将步骤(3)制得的菌体10毫升新鲜的液体培养基悬浮，加入2毫升1%羧甲基纤维素钠溶液，，混合均匀；倒入装有10000克硅藻土的不锈钢容器中，搅拌机搅拌；然后用不锈钢盖密封容器；室温下放置2天；荧光假单胞菌微生物农药制成。(7)将步骤(6)制得的荧光假单胞菌微生物农药装入塑料瓶每50克1瓶，盖紧瓶盖，室温保存。100公斤塑料水箱装满水，取4瓶荧光假单胞菌微生物农药，兌入水中，搅拌均匀；油菜田沟灌。以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。权利要求1、一种荧光假单胞菌微生物农药的制备方法，包括以下步骤(1)取下列重量比物质均匀混合，制备液体培养基蛋白胨2份甘油1份K2HPO4·3H2O0.15份MgSO4·7H2O0.15份蒸馏水96.7份；(2)用移液枪按照1％的接种量将荧光假单胞菌P13菌种接种入液体培养基中，放入恒温摇床，转速200转/分钟，振荡培养24小时；(3)将振荡培养后的菌体悬液转入灭菌离心管，置入转速为8000转/分钟的冷冻离心机离心10分钟，沉淀制得P13菌体；(4)配制质量分数为1％的羧甲基纤维素钠溶液，在121℃灭菌30分钟备用；将硅藻土置入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30分钟，烘干备用；(5)将步骤(3)制得的菌体用新鲜液体培养基悬浮，加入1％羧甲基纤维素钠溶液，混合均匀；倒入装有硅藻土的容器中，搅拌；密封容器，室温放置1-2天；荧光假单胞菌微生物农药制成；(6)将步骤(5)制得的荧光假单胞菌微生物农药装入包装容器，室温保存。2、根据权利要求1所述的荧光假单胞菌微生物农药的制备方法，其特征在于(1)步骤(2)、(5)在超净工作台中无菌操作；(2)步骤(5)密封材料为灭菌纱布或橡胶塞；(3)步骤(6)的包装容器为干燥的塑封袋、塑料瓶、玻璃瓶。全文摘要本发明属于微生物农药，一种荧光假单胞菌微生物农药的制备方法。油菜菌核病是危害油菜生产和产量的最大病害之一，现有技术采用农业防治、化学防治和微生物农药防治，效果都不理想。本发明荧光假单胞菌微生物农药的制备方法步骤如下取蛋白胨、甘油等制备液体培养基；用移液枪将荧光假单胞菌P13菌株接种入液体培养基恒温振荡培养；冷冻离心沉淀制得P13菌体；取蛋白胨、甘油、琼脂等制备固体培养基将P13菌体，接种至固体培养基，28℃恒温培养；加入装有硅藻土的容器中，搅拌；密封，室温放置1-2天。本发明的优点是防治油菜菌核病效果显著；促进油菜生长；无毒、副作用，人畜安全；制备工艺简单、成本低；使用方法简便。文档编号C12N1/20GK101606541SQ200910055029公开日2009年12月23日申请日期2009年7月17日优先权日2009年7月17日发明者慧李,明肖申请人:上海师范大学