专利名称：布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的酶的制备方法，具体是一种布氏锥虫苯丙氨 酰tRNA合成酶的制备方法。
背景技术：
布氏锥虫是一种在撒哈拉以南非洲地区所特有的寄生虫，当侵入寄主后会引 起非洲锥虫病或昏睡病，每年引起50， 000 200， 000的死亡。锥虫主要通过采采 蝇叮咬来传染给人和牲畜，早期主要表现为不舒服和不规律的发热；如果不及时 治疗，寄生虫会侵入中央神经系统，最终导致昏迷并引起死亡。目前市场上存在 的药物都存在着一些缺陷，比如药物毒性、缺乏胃肠外管理抗药性等都是需要解 决的问题。
近年来，随着生物化学的大力发展，以及锥虫基因组序列的陆续破解，为我 们寻找新的药物作用靶点提供了很好的基础。氨酰tRNA合成酶(aaRS)为蛋白 质生物合成过程中的一类关键酶， 一旦aaRS受到抑制，其相应的tRNA就不能够 结合，进而影响整个翻译过程。蛋白合成受到抑制，会导致整个细胞处于生长静 息。因此，可以抑制氨酰tRNA合成酶的化合物都可以作为潜在的抗感染剂。目 前，仅有一种氨酰tRNA合成酶抑制剂莫匹罗星——异亮氨酰tRNA合成酶(IleRS) 抑制剂作为已上市的抗菌剂。因此以氨基酰tRNA合成酶进行药物设计和筛选， 有非常好的前景。苯丙氨酰tRNA合成酶(PheRS)是最大的氨酰tRNA合成酶之 一，由a^2四聚体所构成，其表达和纯化有很大的难度。
经对现有技术的文献检索发现，Nina Moor在《Protein Expression and Purification》(《蛋白表达及纯化》)2002年24期第260 267页发表了题为 《Cloning and Expression of Human Phenylalanyl-tRNA Synthetase in Escherichia coli : Comparative Study of Purified Recombinant Enzymes》(《人 苯丙氨酰tRNA合成酶在大肠杆菌中的克隆表达研究比较纯化的重组酶》)，文 章中给出了表达纯化人类苯丙氨酰tRNA合成酶的方法，但是该方法的表达纯化步骤繁琐，对布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的表达效率较低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种布氏锥虫苯丙氨酰tRNA 合成酶的制备方法。本发明构建布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶(PheRS)的重组 质粒，表达纯化出布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶蛋白。
本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明涉及一种布氏锥虫苯丙氨酰 tRNA合成酶的制备方法，包括如下步骤
步骤一，分别设计引物，扩增布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶的a亚基和e亚 基基因；
步骤二，将a亚基和e亚基基因分别克隆到原核表达载体pET21a(+)中，构 建pET21a(+) -PheRS a及pET21a (+) -PheRS P表达载体；
步骤三，扩增a亚基的操纵子，之后将操纵子亚克隆到pET21a (+) -PheRS e中，形成重组共表达载体pET21a(+)-PheRSa e ;
步骤四，将重组共表达载体pET21a(+)-PheRSa P转化大肠杆菌 BL21 (DE3) RIPL中，IPTG诱导表达；
步骤五，收集裂解后的菌液上清，纯化蛋白，得布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶。
步骤一中，扩增a亚基基因的引物为 上游引物5， ATGAGTACCATGGAGAACACCATTCT ;
下游引物5， AAAACGCATTAGCTTTGAGTTCC 。
步骤一中，扩增e亚基基因的引物为
上游引物5， ATGCCAACCCTCGCTGTTGTGCGTGAT ;
下游引物5， CTGGGCAAACTGAACATTCAGCTC 。
步骤三中，扩增a亚基基因操纵子的引物序列为
上游引物5， GCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAG ;
下游引物5， AGGCAGATCTAGTTATTGCTCAGCG 。
步骤五中，所述纯化采用亲和层析方法。
步骤五中，纯化时，用含1M咪唑的洗脱液洗脱亲和层析柱。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明构建布氏锥虫苯丙氨
酸tRNA合成酶(PheRS)的重组质粒，表达纯化出布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶 蛋白；本发明的步骤简单，纯化效果好，为抗寄生虫药物的筛选奠定了基础。
本发明中所涉及的菌株大肠杆菌DH5a已在《汪玲玲，杨辑，黄诚之，王海 洪；大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成，微生物学 报，2008， 48(7) :963 969》文献中公开。本发明涉及的菌株可通过公开市售的 商业渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址上海市漕溪路258弄27号航 星商务楼l号楼606室。
本发明涉及的大肠杆菌BL21(DE3)RIPL已在《张美祥，张小梅，范三红，罗 龙海，闫晓华，郭蔼光；拟南芥Alpha-dioxygenase2原核表达、纯化及亚细胞 定位预测，农业生物技术学报，2007， 15 (5) : 816 820》可通过公开示售 的商业渠道取得，如可以从美国stratagene公司购得，菌株编号为B0003。
图1为PCR扩增布氏锥虫PheRS的a亚基e亚基的琼脂糖凝胶电泳图2为重组共表达质粒pET21a(+)-PheRS a e的构建图3为共表达载体pET21a(+)-PheRSa 0的酶切鉴定图谱；
图4为SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达图谱；
图5为SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导纯化图谱；
图6为放射性同位素方法测定PheRS的活性曲线。
具体实施例方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册见New York Cold Spring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所 建议的条件。
实施例
步骤一，布氏锥虫PheRS的a亚基、g亚基基因的获得 1、 PheRS的a亚基基因的获得
(1)取布氏锥虫的全基因组DNA2(^g作为模板，通过PCR的方法扩增目的基因片段，扩增用的上下游引物均是经PAGE纯化的引物，其中， 上游(Primer F): 5， ATGAGTACCATGGAGAACACCATTCT ， 下游(Primer R) : 5， MAACGCATTAGCTTTGAGTTCC ; (上游序列见SEQ ID N0:1，下游序列见SEQ ID NO:2)。
(2)用Pfu聚合酶进行PCR反应，其中模板为基因组DNA ,所用引物为 Primer F、与Primer R， 98。C预变性2 min， 95。C变性lmin， 55。C复性lmin， 68°。延伸3min，共35个循环，最后72。C延伸10min;向PCR扩增后的产物加入 5X上样缓冲液，用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果发现，在1.5Kb处有一条条 带，结果见图l，图l为PCR扩增布氏锥虫PheRS的d亚基e亚基的琼脂糖凝胶 电泳图M:5000bp DNA marker;1 :PCR扩增的PheRS的a亚基基因。 2、 PheRS的e亚基基因的获得
(1) 同PheRS的a亚基基因的获得方法，同样通过PCR的方法从布氏锥虫的 全基因组DNA中扩增目的基因片段，扩增用的上下游引物序列如下
上游(Primer F): 5， ATGCCAACCCTCGCTGTTGTGCGTGAT ， 下游(Primer R) : 5， CTGGGCAAACTGAACATTCAGCTC ; (上游序列见SEQ ID N0:3，下游序列见SEQ ID N0:4)。
(2) PCR反应条件为95。C变性lrain， 58。C复性lmin， 68。C延伸3min，共 35个循环，最后72。C延伸10min;
(3) PCR扩增后的产物加入5X上样缓冲液后用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定 在1.8Kb处有一条条带，结果见图l，泳道2:PCR扩增的PheRS的0亚基基因。
步骤二，表达质粒pET21a(+)-PheRS a及表达质粒pET21a(+)-PheRS 0的构建
分别纯化PCR扩增的a基因和e基因片断后，用PNK酶37'C反应30min磷 酸化基因片断，并于7(TC处理10min使酶失活。同时用Pmel酶消化表达质粒 pET21a(+)-Pmel，用CIAP酶37"反应30min将消化后的载体去磷酸化，并于85 。C反应15min使酶失活。以T4DNA连接酶分别将磷酸化后的目的基因片断a基因、 e基因连入经Pmel限制性内切酶处理且去磷酸化后的表达载体pET21a(+)-Pmel 中，构建表达质粒pET21a(+)-PheRSa ， pET21a(+)-PheRS e 。质粒转化大肠杆 菌DH5a感受态细胞(购于天根生化公司)，抽提质粒DNA，经酶切鉴定及测序 分析正确后用于共表达载体的构建。步骤三，共表达质粒pET21a(+)-PheRSa 0的构建
以pET21a(+)-PheRSP为母体，在此基础上构建双启动子的双目的基因表达 的操纵子系统。构建的方法，见图2所示，用PCR的方法从pET21a(+)-PheRSa上 扩增出T7promoter,目的基因a在内的操纵子；然后将其亚克隆入 pET21a(+)-PheRSe的启动子前面，从而形成共表达的质粒。图2为重组共表达质 粒pET21a(+)-PheRSa e的构建图，由重组表达载体pET21a(+)-PheRS a及组表达 载体pET21a(+)-PheRSe出发，构建重组共表达质粒pET21a(+) -PheRS a e;
首先从pET21a(+)-PheRS a扩增基因a操纵子，以pET21a(+)-PheRS a为模 板，PCR的方法扩增出包括T7promoter，目的基因a在内的操纵子，其中所涉及 的引物如下
上游引物F: 5， GCATTAGGMGCAGCCCAGTAGTAG ， 下游引物R: 5' AGGCAGATCTAGTTATTGCTCAGCG ;
BglII
(上游序列见SEQ ID N0:5，下游序列见SEQ ID N0:6)。 扩增出的目的基因经回收纯化后，用BglII限制性内切酶消化，以T4DNA 连接酶连接入用同样的内切酶消化的pET21a(+)-PheRSP中，构建共表达载体 pET21a(+)-PheRSa 0。然后转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，抽提质粒DNA ， 经BglII限制性内切酶鉴定正确的重组克隆，并用Sanger双脱氧末端终止法测 定DNA序列。酶切鉴定图见图3所示，重组的共表达质粒用BamHI酶消化后，出 现约为9kb的片段，经BglII酶切消化后，出现1. 7kb和7. 2kb大小的片断。 图3共表达载体pET21a(+)-PheRSa P的酶切鉴定图谱，图中M:lkb DNA marker; 1: BamHI限制性内切酶消化后的片断；2: BglII限制性内切酶消化后 的片断。
步骤四，布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶基因的表达
将经酶切及测序鉴定后正确的共表达载体pET21a(+)-PheRS a e转化大肠杆 菌表达菌株BL21 (DE3)RIPL中。将上述经鉴定含有共表达载体的表达菌的单菌落 接种到含有2ml含氨卞青霉素100mg/L的LB培养基中，37'C过夜活化培养，按 体积比为1:1000接种至lj 500ml的LB培养基，37°C 150rpm摇菌，约4h，待A刷OD 为0.3 0.8时，取出培养瓶，冰上冷却后，加IPTG至终浓度为0. lmmol/L，2(TC 25'C过夜培养。分别收集未诱导与诱导后的菌液进行8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳，诱导表达结果见图4，图4中由泳道1 、 2，可以看到诱导后a亚基(55KD) 和e亚基(72KD)处均有诱导表达；图4为SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达 图谱M:标准蛋白Marker; 1:未经诱导的菌液；2: IPTG诱导以后的菌液；3: 诱导后裂解获得的上清；4:诱导后裂解获得的沉淀； 步骤五，布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶蛋白的纯化
1、 蛋白纯化前处理取IPTG诱导表达后菌液4800rpm， 20min，弃上清， 收集菌体。加入10ml pH值为7.8的预冷的1XPBS重悬沉淀，加溶菌酶至终浓 度lmg/mL，蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度lmmol/L;超声破碎细胞，功率200W 400W,超声3s，停6s，共超声30min，当溶液不粘稠后，加入Triton-100至终 浓度1°/。(W/V); 4°C， 13000rpm，离心20min，分别收集上清与沉淀进行8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图4中泳道3、 4，表达后的蛋白多数以难溶的包 涵体形式存在；
2、 布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶蛋白的纯化
表达的重组蛋白用His-Bind亲和层析纯化，依次在添加柱材料的交换柱中 加入3倍柱床体积的去离子水，5倍柱床体积的交换缓冲液(50raM硫酸镍)进 行镍离子的交换，6倍柱床体积的结合缓冲液(0.5M NaCl， 5raM咪唑，20mM Tris-HC1， PH7.9)，上清液过柱，10倍柱床体积的结合缓冲液，6倍柱床体积的 洗涤缓冲液(0. 5M NaCl， 60mM咪唑，20raM Tris-HCl， PH 7.9)， 6倍柱床体积 洗脱缓冲液(1M咪唑，0. 5MNaCl， 20mM Tris-HCl， PH7.9)，分管洗脱目的蛋 白，收集目的蛋白，以上流速控制在l柱床体积/6min。将收集的目的蛋白置于 透析袋中，用50% (V/V)甘油，0. 1 mg/ml BSA ， 5 mmol/L P -巯基乙醇，1 XPBS， pH 6. 8的透析液过夜透析后。将透析后的蛋白取少量进行SDS-PAGE电泳，电泳 图如图5所示，其余于-2(TC保存。结果表明，通过本发明所提供的方法纯化得 到的蛋白的纯度可达95%。图5为SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导纯化图谱，M: 标准蛋白Marker; 1:未经诱导的菌液；2: IPTG诱导以后的菌液；3:亲和层析 纯化后的目的蛋白。步骤六，布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的活性测定
采用放射性同位素法，以酶催化生成[14C]-Phe -tRNA复合物的量来测定酶活力。反应液包括(均指终浓度):50咖ol/L (pH7.8) HEPES-KOH ， 5咖ol/LMgCl2 ， 45mmol/LKCl， 10 u mol/L [14C]-Phe (0.1 uCi/nL) ， 0. 4 mg/mL啤酒酵母tRNA ， 0.02 % (W/V) BSA ， 1 ramol/L DTT ， 10% (V/V) DMSO ，苯丙氨酰tRNA合成酶20 u L(纯化后酶稀释1000倍)。上述物质混匀后，加入终浓度为2咖ol/LATP时反应起始，混合物终体积为70uL。从加入ATP开始计时，37'C恒温下反应。在40min内每间隔10 min各取3等份20 y L反应液分别滴加到定性滤纸上，并立即投入到5。/。TCA溶液100 mL中浸泡洗涤，重复3次；将取出的滤纸再投入到95 %酒精中浸泡洗涤，重复3次。滤纸置于红外灯下供干，闪烁计数仪测定，得到如图6所示的酶活性曲线。从图中可以看出在40min内产物生成量随着时间呈线性增加。
因为反应初速率与酶量呈线性关系时，初速率可以反映酶的含量，因此，为了保证所获得的为反应初速率，最终测定酶活力时我们选择以下条件同上述的酶反应体系，但选择在20min内每间隔5 rain来测定产物的生成量随时间的变化。酶的活力单位1U定义为在上述最适反应条件下每分钟生成lnmol产物[14C]-Phe-tRNA时的酶量。根据上述方法测得的纯化出来的酶制剂中每毫升酶单位(U/mL)为70。序歹U表
〈110>上海交通大学
〈120〉布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法
〈160〉 6
〈170> Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223>人工序列
<400> 1
atgagtacca tggag肪cac cattct 26
<210〉 2
<211〉 23
<212> DNA
〈213> Artificial
〈220>
〈223〉人工序列
〈400> 2
aaaacgcatt agctttgagt tcc 23
<210> 3
<211> 27
〈212〉 腿
<213> Artificial
〈220>
<223>人工序列
<400> 3
atgccaaccc tcgctgttgt gcgtgat 27<210〉 4
<211> 24
<212> 腿
<213> Artificial
〈220〉
<223>人工序列
<400> 4
ctgggc3朋c tg3ac3ttca gctc 24:
<210> 5
〈211〉 25
〈212> DNA
〈213〉 Artificial
〈220>
<223>人工序列
<400> 5
gcattsggaa gcagcccagt agtsg 25
<210> 6
<211> 25
〈212> 丽
<213> Artificial <220>
〈223〉人工序列
〈400> 6
aggcagatct agttattgct cagcg 2权利要求
1、一种布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，分别设计引物，扩增布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶的α亚基和β亚基基因；步骤二，将α亚基和β亚基基因分别克隆到原核表达载体pET21a(+)中，构建pET21a(+)-PheRS α及pET21a(+)-PheRS β表达载体；步骤三，扩增α亚基的操纵子，之后将操纵子亚克隆到pET21a(+)-PheRSβ中，形成重组共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ；步骤四，将重组共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ转化大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中，IPTG诱导表达；步骤五，收集裂解后的菌液上清，纯化蛋白，得布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶。
2、 根据权利要求1所述的布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法，其特 征是，步骤一中，扩增a亚基基因的引物为上游引物5， ATGAGTACCATGGAGAACACCATTCT ; 下游引物5' AAMCGCATTAGCTTTGAGTTCC 。
3、 根据权利要求l所述的布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法，其特征是，步骤一中，扩增e亚基基因的引物为上游引物5， ATGCCAACCCTCGCTGTTGTGCGTGAT ; 下游引物5， CTGGGCAAACTGAACATTCAGCTC 。
4、 根据权利要求1所述的布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法，其特 征是，步骤二中，扩增a亚基基因操纵子的引物序列为上游引物5' GCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAG ; 下游引物5， AGGCAGATCTAGTTATTGCTCAGCG 。
5、 根据权利要求l所述的布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法，其特 征是，步骤五中，所述纯化采用亲和层析方法。
6、根据权利要求5所述的布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法，其特 征是，步骤五中，纯化时用含1M咪唑的洗脱液洗脱亲和层析柱。
全文摘要
一种生物技术领域的酶的布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法，具体步骤如下分别设计引物，扩增布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶的α亚基和β亚基基因；将α亚基和β亚基基因分别克隆到原核表达载体pET21a(+)中，构建pET21a(+)-PheRSα及pET21a(+)-PheRSβ表达载体；将α亚基的操纵子亚克隆到pET21a(+)-PheRSβ中，形成重组共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ；将重组共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ转化大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中，IPTG诱导表达；收集裂解后的菌液上清，纯化蛋白，得布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶。本发明构建布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶(PheRS)的重组质粒，表达纯化出布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶蛋白，为抗寄生虫药物的筛选奠定了基础。
文档编号C12N9/00GK101633915SQ20091005668
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月20日 优先权日2009年8月20日
发明者璎 姚, 李大伟, 杲光伟 申请人:上海交通大学