专利名称：一种种子特异表达的淀粉合成酶基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程领域，具体的说，涉及一种种子 特异表达的淀粉合成酶基因启动子及其应用。
背景技术：
种子是人和动物的主要食物来源，而且还是许多工业的原材料，与人类的生 产生活密切相关。但是，由于植物自身的局限性，种子中所含的蛋白和其他成分 不能完全满足人类的需求。随着现代分子生物学的飞速发展，转基因植物在理论 研究和植物育种上的应用越来越广泛，通过DNA重组技术，植物不仅可以获得 一些本身不具备的抗虫、抗病、抗逆等特性，还可以在种子中合成一些本身不具
有的必需氨基酸来提高营养价值，或者进行代谢修饰，产生更符合人类需求的代 谢产物等。
植物作为生物反应器生产药用蛋白是一个极具商业前景的领域，植物生物反 应器是指以植物悬浮细胞、某一组织和器官或整株植物为工厂生产具有重要功能 的蛋白。与传统的微生物发酵相比，由于植物是真核生物，外源蛋白在合成后的 修饰加工更接近于真实状态，因此具有更高的生物活性，克服了微生物表达外源 蛋白不能进行修饰加工的缺陷；与动物细胞培养和转基因动物相比，不仅技术上 相对容易实现，而且成本低廉。此外，转基因植物生产药用蛋白还具有以下优点 不需要复杂的生产设备；生产的药用蛋白可供人和动物直接食用，不需要象传统 方法(如发酵法)生产药用蛋白那样进行分离提纯；比传统的口服药物更有效，植 物细胞中的药用蛋白通过胃内的酸性环境时可受到细胞壁的保护，降低了胃酸的 破环作用；易于储存和分发，不需要冷藏设备即可保存数年而保持活性等。
种子是作物的主要营养贮藏器官，是人和家畜的重要食物来源。因此种子是 表达外源蛋白的理想场所。目前植物基因工程上经常采用CaMVJ:^启动子、玉 米W)/9"衍"启动子和水稻^cri"7启动子等组成型启动子，所谓组成型启动子是 指能够启动下游基因在受体植物的任何组织和器官内持续、高效表达的一类启动 子,这类启动子不具有组织特异性，而外源基因的额外高效表达不仅是一种浪费，而且会对植物形成一种生理负担并有可能对植物组织造成伤害，从而影响植物的 正常生长发育。应用组织特异性启动子则可以避免这种影响，组织特异启动子是 指只能在特定时间或条件下启动下游基因在受体植物的特定组织和器官内表达 的一类启动子。要在特定部位或组织中表达目的蛋白，就必须选用组织特异性启 动子，以确保目的基因在特定组织中正常表达。目前己有的组织特异启动子有根 特异性启动子，韧皮部特异性启动子，叶片特异性启动子，胚乳特异性启动子和 种子特异性启动子等。现有的种子特异性启动子主要来源于植物贮藏蛋白基因， 如谷醇溶蛋白基因启动子、花生种子豆球蛋白/eg^基因启动子、水稻谷蛋白g/W 和g/"5基因启动子和玉米醇溶蛋白基因启动子等，但贮藏蛋白基因启动子一个 明显的缺陷是活性一般要受到氮素供应的限制。
淀粉是种子的主要组成部分，在作物种子中，淀粉一般占到籽粒重量的70% 左右。植物淀粉合成酶按存在状态可分为可溶性淀粉合成酶和颗粒结合性淀粉合 成酶。玉米可溶性淀粉合成酶主要由zSSI和zSSIII组成，zSSIII由dt////基因编 码。通过检测不同时期玉米的根，茎、叶以及授粉后不同天数的玉米籽粒、种皮、 胚乳发现rf"///基因的mRNA只能在授粉10天以后的籽粒中检测到，说明该基 因是一个种子特异表达的启动子。
发明内容
本发明的目的是提供一种玉米淀粉合成酶基因甴/〃启动子，用于驱动外源 基因在转基因植物的种子中特异表达。所述启动子是具有下述核苷酸序列之一
1) 序列表中SEQIDNo: 1
2) 序列表中SEQIDNo: 2所示的由1773个碱基组成的核苷酸序列； 所述SEQIDNO: 2是序列表中SEQ ID No: 1所示的序列第-1651至+122
的1773bp核苷酸序列，该序列足以驱动外源基因在转基因植物的籽粒中特异表 达。
本发明的另一个目的是提供一种含有上述启动子序列与所需目的基因的编 码区核苷酸序列连接后产生的重组质粒。
本发明的另一个目的是提供上述重组质粒在转基因植物中的应用。 本发明涉及首次克隆的具有植物种子特异表达的玉米淀粉合成酶III基因 dM///启动子的核苷酸序列。包括该启动子启动目的基因的时空特异表达特性以 及该启动子与gw^报告基因编码区融合的重组质粒在植物组织中的表达。植物种子是表达外源蛋白的理想场所。与传统的微生物发酵相比，由于植物 是真核生物，外源蛋白在合成后的修饰加工更接近于真实状态，因此具有更高的 生物活性，克服了微生物表达外源蛋白不能进行修饰加工的缺陷；与动物细胞培 养和转基因动物相比，不仅技术上相对容易实现，而且成本低廉。此外，转基因 植物种子生产药用蛋白还具有不需要复杂的生产设备；生产的药用蛋白可供人和 动物直接食用，不需要像传统方法(如发酵法)生产药用蛋白那样进行分离提纯； 比传统的口服药物更有效，植物细胞中的药用蛋白通过胃内的酸性环境时可受到 细胞壁的保护，降低了胃酸的破环作用；易于储存和分发，不需要冷藏设备即可 保存数年而保持活性等优点。
要在植物种子中表达目的蛋白，就必须选用种子特异性启动子，以确保目的 基因在种子中正常表达。目前植物基因工程上经常采用CaMV3:W启动子、玉米 C^/《w衍w启动子和水稻4"/n7启动子等组成型启动子，这类启动子不具有组织 特异性，而外源基因的额外高效表达不仅是一种浪费，而且会对植物形成一种生 理负担并有可能对植物组织造成伤害，从而影响植物的正常生长发育。目前已有 的组织特异启动子有根特异性启动子，韧皮部特异性启动子，叶片特异性启动子， 胚乳特异性启动子和种子—异性启动子等。现有的种子特异性启动子主要来源于 植物贮藏蛋白基因，如谷醇溶蛋白基因启动子、花生种子豆球蛋白基因启 动子、水稻谷蛋白g/W和g/"5基因启动子和玉米醇溶蛋白基因启动子等，但贮 藏蛋白基因启动子一个明显的缺陷是活性一般要受到氮素供应的限制。
本发明采用Genomic walking法，根据玉米甴/〃基因的cDNA序歹i』(GenBank Accession No: AF036891)设计特异巢式引物，以玉米基因组为模板，从玉米中 分离了^//7基因启动子，该启动子的核苷酸序列见SEQIDNo:l。该启动子能 驱动目的基因在植物种子中特异表达，而且淀粉合成酶基因不受氮素供应的限 制。本发明首次获得的玉米启动子序列3474 bp (序列表中SEQ ID No: 1 所示)，其部分片段是序列表中SEQ ID No: 1所示的序列第-1651至+122的核苷 酸序列1773bp (序列表中SEQIDNo: 2所示)，该序列足以驱动外源基因在转 基因植物的籽粒中特异表达。其具体开发过程为 一、玉米^///基因表达部位分析
首先提取玉米不同时期不同组织总RNA，用TOYOBO公司反转录试剂盒按
以下体系做反转录
总RNA 500-1000吗
5 XRT Buffer 4dNTP Mixture (各10 mmol/L) 2 nL
RNase Inhibitor (10 U/pL) 1 nL
Oligo(dT)20 1 nL
Rsv6rTraAcc 1 pL
用RNase-Free H20补至 20
反应条件为42°C 20min
99 °C 5 min
然后将反转录产物稀释10倍作为模板进行Real-TimePCR检测，内参基因 选用玉米J"&97基因。标准曲线用反转录产物倍比稀释作模板制定。所用到的 引物序列如下(所有引物均由Invitrogen公司合成，下同)
Pal: 5' — GTTGGGCGTCCTCGTCA — 3' Pa2: 5' — TGGGTCATCTTCTCCCTGTT — 3'
f/M//7引物
Pdl:5' —- CACTCGCCTGACAGCCCAAAAG —3'
Pd2: 5 ， 一 GCCAGCGTATATCAGATGCGAGAG — 3'
Real-Time PCR采用天根生化科技有限公司RealMasterMix试剂盒，反应体系为 2 X RealMasterMix 12.5 fiL 引物1 0.5 nL
引物2 0.5 nL
cDNA模板 1.0 nL
H20 10.5 (xL
总体积 25 jxL
反应程序为95°C lmin
95 °C 20 sec 、
58°C 20 sec ^ 40 cycles
68 °C 20 sec
82°C 7 sec 读荧光J
68。C 5min
Real-Time PCR检测显示，^////基因转录的mRNA可以在胚乳和种皮中表 达，在叶片、叶脉和根部没有表达。 二、玉米^/"///5'侧翼序列的克隆
提取玉米基因组DNA，根据GenBank中玉米基因的mRNA序列 (AccessionNo: AF036891 )设计两个反向巢式引物，用玉米基因组DNA为模板， 用SON-PCR法克隆基因5'侧翼未知序列，LA Taq酶购自TaKaRa公司， 引物序列如下Psonl: 5,- CTCCGAAGGCAGAGAGGGCTCTG-3, Pson2: 5，國CCGTAGGACCATCTCCATTTCTAG-3' 第一轮PCR反应体系如下
lOxLAPCR buffer5pL
dNTP(10mmol/L)5jxL
MgCl25nL
gDNA(100 ng/nL)0.5 nL
Psonl(10mmol/L)2nL
LATaq酶(5U/nL)0.5 ^
ddH2032 nL
总体积50 jiL
PCR反应条件如下:
94 。C 94 。C 60 。C 72 。C 94 。C 29 。C 29 'C 72 。C 94 。C 60 °C 72 °C 72 °C
30 sec 3 min Ramp 3 min to 72 。C 2.5 min
3 min
7.5 min
第二轮PCR反应体系如下
lOxLA PCR buffer 5
dNTP(10 mmol/L) 5 jxL
MgCl2 5 nL
第一轮PCR产物 0.5
Pson2(10 mmol/L) 2 |iL
LAT叫酶(5U/nL) 0.5
ddH20 32 nL
总体积 50 nL
PCR反应条件如下:
94 °C 94 °C 60 °C 72 °C 94 °C
3 min
30 sec<formula>formula see original document page 8</formula>
PCR产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳分离，切取含最大长度的PCR产物胶块， 用DNA凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)回收，连接进pMD18-T 载体后进行测序，测序结果如SEQ IDNo:l所示。 三、^^//7尸启动子活性的验证
首先构建含基因启动子与报告基因融合的植物表达载体。根据SEQ ID No:l序列，设计合成含有限制性酶切位点的启动子引物，以连结在测序载体 pMD18-T上的3.5 Kb的序列为模板通过PCR扩增法克隆1.8 Kb的基因启 动子序列。
Pde 1: 5， -— CACTCGTCGACGCCTTTGAGACTG —3'
Pde 2: 5， 一 TCTCCATGGCTAGAAGGGGAAGAAAAGAAG —3'
Pdel划线部分为序列自身含有的&|//酶切位点，Pde2划线部分为添加的
7Vco/酶切位点。
反应体系如下
10xLA PCR buffer 5 nL
dNTP(10 mmol/L) 5
MgCl2 5 nL
Pdel(10 mmol/L) 2
Pde2( 10 mmol/L) 2 nL
模扳UOng/nL) 0.5 nL
LAT叫酶(5U/nL) 0.5
ddH20 30
总体积 50 nL
PCR反应条件如下<formula>formula see original document page 8</formula>
将扩增出的1779 bp的启动子序列命名为甴//7尸，连接到pMD18-T测序载 体上，经Invitrogen公司测序，表明扩增没有出现错配，结果见SEQ ID No:2。根据引物Pdel和Pde2两段设计的限制性酶切位点，用&//和Wco/将Jm〃7尸片 段从pMD18-T载体上切下，回收后与经Sfl//和Wco/双酶切的pCAMBIA1301 载体片段连接。连接产物转化￡>//5 菌株中，挑选阳性克隆送Invitrogen公司测 序，证明连接正确。将阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基上繁殖后用质粒小提 试剂盒(天根生化科技有限公司)提取质粒。
取玉米骨干自交系18-599授粉后8-12天的胚乳(无菌处理)作为基因枪转 化的受体，在含有高渗培养基(MS盐+0.4mol/L蔗糖)的培养皿(直径9cm) 中央2-3cm处高渗处理4h，然后用基因枪进行轰击，将构建的融合表达载体转 入玉米胚乳。28 。C暗培养2天后，进行组织化学染色分析，结果表明，该启动 子能驱动gt/"基因的高效表达。
本发明启动子分离及其功能的阐明，不仅为研究植物淀粉合成代谢的表达调 控机制奠定了基础，为基因工程技术调控淀粉的生物合成创造了条件，而且为利 用作物籽粒作为生物反应器生产药用蛋白提供了条件。该启动子在植物淀粉改良 和植物生物反应器研究中将发挥重要作用。
本发明启动子的意义及应用价值在于
1. 本发明通过Genomic walking法首次克隆了玉米淀粉合成关键酶基因 的启动子序列，为确定淀粉合成酶基因启动子中的关键顺式作用元件，从而揭示 植物淀粉合成代谢的调控途径奠定了基础。
2. 本发明的淀粉合成酶基因启动子用于基因工程技术调控淀粉合成能在表 达部位和表达强度上与植物本身淀粉合成酶基因完全一致，能最大效果的起到调 控作用。
3. 本发明的启动子具有时空特异表达特性，能驱动目的基因在灌浆期的植 物种子中高效表达，而在叶片、叶脉和根部不表达，在植物生物反应器研究中将 有广泛的用途。
图1为Real-Time PCR检测基因在不同组织中的表达情况
图2为SON-PCR扩增玉米基因5，侧翼序列的电泳图谱
图3为cM/7尸片断构建到真核表达载体pCAMBIA1301上的图谱示意图
图4为基因启动子驱动报告基因的组织化学染色结果
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡 依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。 实施例l:玉米^/"///基因表达部位分析
1. 玉米不同时期不同组织总RNA的提取
取50-100mg新鲜或-7(TC液氮中保存的组织，用液氮研磨，置1.5mL离心管 中，加入l mLTrizol (购自Invitrogen公司)充分震荡，室温静置5 min。加入0.2 mL 氯仿，振荡15sec，静置2min。 4 。C 12000 r/min离心15 min，取上清。加入等体 积乙二醇丁醚，将管中液体轻轻混匀，冰浴静置l h。 4 °C 10000r/min离心10min， 弃上清。加入l mL75。/。乙醇，轻轻洗涤沉淀。4 °C 7500 r/min离心5 min，弃上清。 加入lmL100。/。乙醇，轻轻洗涤沉淀。4 °C 7500 r/min离心5 min，弃上清，晾干， 加入适量的DEPC &0溶解。然后用核酸蛋白检测仪(BIO-RAD公司)测定浓度及 纯度，并用变性琼脂糖胶电泳检测RNA完整性。
2. RT-PCR
所有检测合格的RNA用TOYOBO公司反转录试剂盒按以下体系做反转录 总RNA 500-1000 ng
5 xRT Buffer 4pL dNTP Mixture (各10 mmol/L) 2 pL RNase Inhibitor (10 U/fiL) 1 pL 01igo(dT)20 1 nL
ReverTraAce 1 nL
用RNase-Free H20补至 20
反应条件为42°C 20min
99°C 5 min
3. Real-Time PCR检测玉米^W基因在不同组织中的表达情况
将反转录产物稀释10倍作为模板进行Real-TimePCR检测，内参基因选用玉 ^iUcri/^7基因。标准曲线用反转录产物倍比稀释作模板制定。所用到的引物序 列如下(所有引物均由Invitrogen公司合成，下同) Jc"'"97引物
Pal: 5，一 GTTGGGCGTCCTCGTCA— 3， Pa2: 5，一 TGGGTCATCTTCTCCCTGTT -— 3'
Pdl: 5，陽一CACTCGCCTGACAGCCCAAAAG —- 3'Pd2:
GCCAGCGTATATCAGATGCGAGAG — 3，
Real-Time PCR釆用天根生化科技有限公司RealMasterMix试剂盒，反应体系为: 2xRealMasterMix 12.5
引物l 引物2 cDNA模板 H20 总体积
反应程序为95°C 95 °C 58°C 68°C 82 。C 68'C
0.5 (xL 0.5 1.0 10.5 25 nL
1 min 20 sec 20 sec 20 sec
"7 S6C
5min
40 cycles
读荧光^
Real-Time PCR检测显示，t/"/〃基因转录的mRNA可以在胚乳和种皮中表达， 在叶片、叶脉和根部没有表达。结果见图l。图l中，E:胚乳；P:种皮；R:根; L:叶片；LS:叶脉。数字为授粉后天数，根、叶片、叶脉取于授粉前14天。
实施例2:玉米甴/〃 5'侧翼序列的克隆
1. 玉米基因组DNA的提取
称取1.0g新鲜玉米叶片，剪成lcm的小段，放在预冷的研钵中，用液氮迅速 研成均匀的粉末，在组织没有溶解之前，将粉末全部装入5mL的离心管中，迅 速向离心管中加入2mL， 65'C温育的CTAB提取缓冲液，轻轻摇晃混匀后65 °C 水浴30min-lh，加入等体积的氯仿:异戊醇(24: 1)，混匀，轻微震荡15min。室 温下，10000 r/min离心8 min。吸取上清到一个干净的5 mL的离心管中。加入等 体积预冷的异丙醇(4'C)，室温下10000r/min离心5min 。弃上清，用75%乙醇 清洗沉淀两次，无水乙醇清洗一次。在真空干燥器中干燥10min，用适量的TE Buffer(lO mM Tris, 1 mM EDTA， pH 8.0)溶解DNA，在每管中加入3 jiL 10 mg/mL RNaseA4 'C过夜降解基因组DNA中RNA。
2. SON-PCR扩增玉米dM/〃 5'侧翼序列
根据0611631^中玉米甴//7基因的《11^八序列(AccessionNo: AF036891)设计 两个反向巢式引物，用玉米基因组DNA为模板，用SON-PCR法克隆^/7基因5， 侧翼未知序列，LATaq酶购自TaKaRa公司，引物序列如下
Psonl: 5，- CTCCGAAGGCAGAGAGGGCTCTG-3，Pson 2: 5，- CCGTAGGACCATCTCCATTTCTAG-3，
第一轮PCR反应体系如下
10xLAPCR buffer 5
dNTP(10mmol/L) 5 nL
MgCl2 5
gDNA(lOO ng/pL) 0.5 jxL
Psonl(lO mmol/L) 2 nL
LATaq酶(5U/pL) 0.5
ddH20 32
总体积 50
PCR反应条件如下 94 °C 94 °C 60 °C 72 °C 94 °C 29 °C 29 °C 72 °C 94 °C 60 °C 72 °C 72 °C
5 Cycks
60 Cycles
7.5 min
第二轮PCR反应体系如下:
lOxLAPCR buffer 5
dNTP( 10 mmol/L) 5 (iL
MgCl2 5
第一轮PCR产物 0.5 nL
Pson2(10 mmol/L) 2
LAT叫酶(5U4iL) 0.5
ddH20 32
总体积 50 nL
PCR反应条件如下 94 °C 94 °C 60 °C 72 °C 94 °C 29 °C 29 °C
3 min 30 sec ，
1 min 卜 5 Cycles 2.5 miir^ 30 sec 3 min Ramp 3 min to 72 。C72 °C 2.5 min
94°C 10 sec ，
60 。C lmin卜30 Cycles
72 °C 2.5 miJ
72 °C 7.5 min
3. PCR产物的电泳和回收
用1.0Q/。琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，电泳结束，用凝胶成相系统 (BIO-RAD公司)照相分析(见图2)，切取含最大长度的PCR产物胶块，用DNA 凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)回收。
4. DNA连接反应
在无菌Eppendorft中加入1 nL 10xT4 DNAligase Buffer, 4pL回收的PCR 产物，1 nL pMD 18-T载体(购自TaKaRa公司)，1 nL T4 DNA连接酶(购自TaKaRa 公司)，3pL无菌ddH20，总体积为10^L。将各组分混匀，16X:中连接过夜。
5. 大肠杆菌感受态细胞的制备
挑取大肠杆菌DH5a单菌落到含有50mLLB培养基的三角瓶中，于37 。C振 荡培养过夜；取10pL到含有50mLLB培养基的三角瓶中，37 "C振荡培养到OD 600值为0.4-0.6;将培养好的的菌液转移到50mL的离心管中，冰浴10min;在4 °C， 5000r/min条件下离心5 min，去上清，收集细胞；用20mL冰预冷的0.1 mol/LCaCl2轻轻悬浮沉淀，在冰上放置10min;在4。C， 5000 r/min离心10 min， 用2 mL 0.1 mol/L CaCl2悬浮沉淀，按每管200 nL分装细胞悬浮液于无菌的 Eppenforf管中，用液氮快速冷冻，储存于-70'C。
6. 大肠杆菌的转化
在200 pL大肠杆菌感受态细胞中加入10 ^LDNA连接产物，手指轻弹管壁， 混匀混合物，置于冰上30min; 42'C水浴热激处理90sec,迅速放回冰上，冰浴 2-3min;加入800 nL LB培养液，混匀，37'C振荡培养1 h;将混合液涂布在氨苄 选择性培养基上，37'C过夜培养。
7. 阳性克隆的筛选和目的片断测序
从选择性培养基上挑取单个菌落，接种于3 mL含50 ng/mL的氨苄LB液体培 养基中，振荡培养过夜(37。C， 200r/min)，用Pson2做PCR检测后，送Invitrogen 公司测序，测序结果如SEQIDNo:l所示。
实施例3: ^"//^启动子启动活性的验证1.植物表达载体的构建
根据SEQIDNo:l序列，设计合成含有限制性酶切位点的启动子引物，以连 结在测序载体pMD18-T上的3.5 Kb的序列为模板通过PCR扩增法克隆1.8 Kb的 由/W基因启动子序列。
Pde 1: 5， —- CACTCGTCGACGCCTTTGAGACTG —3' Pde 2: 5， —- TCTCCATGGCTAGAAGGGGAAGAAAAGAAG —3' Pdel划线部分为序列自身含有的1^//酶切位点，Pde2划线部分为添加的Wco/ 酶切位点。
反应体系如下 10xLAPCR buffer dNTP(10 mmol/L) MgCl2
Pdel(lO鹏ol/L) Pde2(10 mmol/L) 模扳(lOng^iL) LAT叫酶(5U/nL) 細20 总体积
PCR反应条件如下: 94 °C 94'C 60 。C 72。C 72 °C Hold
5nL 5 nL
2nL 0.5 nL 0.5 nL 30 nL 50 nL
3min 30sec -j
lmin 卜30 Cycles
2min 」
8min
4'C
将扩增出的1779bp的启动子序列命名为rf"/Z7尸，连接到pMD18-T测序载体 上，经Invitrogen公司测序，表明扩增没有出现错配，结果见SEQ ID No:2。根据 弓I物Pdel和Pde2两段设计的限制性酶切位点，用1^/御^ ^将由////>片段从 pMDl8-T载体上切下，回收后与经Sa/御Wco风酶切的pCAMBIAl301载体片段 连接，构建过程见图3。连接产物转化DH5a菌株中，挑选阳性克隆送Invitrogen 公司测序，证明连接正确。将阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基上繁殖后用质 粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取质粒。
2.转化受体的准备
取玉米骨干自交系18-599授粉后8-12天的胚乳(无菌处理)作为基因枪转化 的受体，在含有高渗培养基(MS盐+0.4mol/L蔗糖)的培养皿(直径9cm)中央 2-3cm处渗透处理4h，然后用基因枪进行轰击。(1) 金粉的制备
称60 mg金粉(直径1.6 nm， Bio-Rad)于1.5 mL的EppendorfW (Thermo公司) 中，加入新鲜制备的lmL70o/。的乙醇(HPLC级)，置漩涡混合器上震荡3-5 min， 静置15min, 1000r/min离心3min，使金粉沉淀，弃上清液。重复下列步骤3次。 再加入lmL消毒蒸馏水，漩涡震荡lmin，静置lmin; 1000 r/min离心3 sec,使金 粉沉淀，弃上清液。加入灭菌的50%甘油，使金粉浓度达到60mg/mL。
漩涡震荡50%甘油中的金粉，沉淀5min，使之成为悬浮液，去掉粗堆集， 取50 nL悬浮混合液于1.5 mL的管中，同时震荡，依次加入5 pLDNA(l ng/pL) 50 HL CaCl2 (2.5 mol/L)， 20 ^L亚精胺(0.1 mol/L，新鲜配置)，继续震荡2-3 min， 静置3 min(混匀后置于冰上5-10min，使载体DNA分子充分沉降在微粒载体表面， 3000-5000 r/min离心2sec，沉淀金粉DNA，弃上清液;加入150 ^70%乙醇，不 破坏沉淀块，弃上清液;加入150^100%乙醇，不破坏沉淀块，弃上清液；力口 入50nL100。/。乙醇，指弹管壁几次，使之重新悬浮，然后低速漩涡2-3 sec，就成 为可用的微弹了。每次取6pL微弹涂在载体膜中央，每次要尽量取出等量的微粒 子，并尽力作到均匀铺在载体膜(70y。乙醇灭菌)中央3cm直径之内，自然条件下 干燥。
(2) 基因枪轰击
使用BIO-RAD公司生产的PDS-1000/He型基因枪进行转化，按照产品说明书 提供的方法操作。真空度为25mmHg，气压为1100psi，每皿轰击两枪。将轰击 后的胚乳转入琥珀酸钠培养液(20 mmol/L琥珀酸钠，20 mmol/LCaCl2， 10 nmol/L 氯霉素，PH=5.0) 25。C黑暗培养24h。
(3) 组织化学染色分析
取培养后的材料置于X-Gluc染色液
中，抽真空半小时后37。C保温过夜，在解剖镜下观察照相，结果 见图4。SEQUENCE LISTING
<110> 四川农业大学
<120> —种种子特异表达的淀粉合成酶基因启动子及其应用
<130> 090106
<160> 2
<170> Patentin version 3- 3
<210> 1
<211〉 3474
<212〉 DNA
<213> 玉米属玉米(Zea mays. L)
<400〉 1
ctggacgtgtcaccttggctactgttgggcccatgcttcgttgcgccg幼ggtcttgcgt60
gaag犯gcagcttcggctgaaatcgtcccc柳幼atggccgaaggttcctttttataga120
gcttcggcgttgcaaaccgacett船agatagaatgacctttttatccatagaggtctetag180
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权利要求
1、一种种子特异表达的淀粉合成酶基因启动子，其特征在于，该启动子具有核苷酸-3340至+134的3474bp的序列，如SEQ ID NO1所示。
2、 根据权利要求1所述的淀粉合成酶基因启动子，其特征在于，该启动子 的-1651至+122的1773 bp核苷酸序列足以驱动外源基因在转基因植物的籽粒中 特异表达，其序列如SEQIDNO: 2所示。
3、 一种种子特异表达的含有淀粉合成酶基因启动子的重组质粒，其特征在 于，所述重组质粒是含有权利要求1或2所述的核苷酸序列的重组质粒。
4、 一种种子特异表达的含有淀粉合成酶基因启动子的细胞系，其特征在于， 所述细胞系是含有权利要求1或2所述的核苷酸序列的细胞系。
5、 一种种子特异表达的含有淀粉合成酶基因启动子的宿主菌，其特征在于， 所述宿主菌是含有权利要求1或2所述的核苷酸序列的宿主菌。
全文摘要
本发明采用Genomic walking法，根据玉米dull1基因的cDNA序列(GenBankAccession NoAF036891)设计特异巢式引物，以玉米基因组为模板，从玉米中分离了一种玉米淀粉合成酶基因dull1启动子。该启动子具有时空特异表达特性，能驱动目的基因在灌浆期的植物种子中高效表达，而在叶片、叶脉和根部不表达，在植物生物反应器研究中将有广泛的用途。该启动子的发明为研究植物淀粉合成代谢的表达调控机制奠定了基础，同时也为基因工程技术调控淀粉的生物合成创造了条件，在植物淀粉改良和植物生物反应器研究中将发挥重要作用。
文档编号C12N15/63GK101525622SQ200910058060
公开日2009年9月9日 申请日期2009年1月7日 优先权日2009年1月7日
发明者刘汉梅, 张军杰, 李晓兵, 田孟良, 胡育峰, 荣廷昭, 黄玉碧 申请人:四川农业大学