专利名称：人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码rna序列及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，特别涉及一种人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA (long加n-coding RNA，简称lncRNA，下文中"IncRNA"的含义为长非编码RNA)及 其用途。
背景技术：
人体中编码蛋白质的基因大约有2 3万个，仅占人类基因组的2%，其余98%不编码 蛋白质的基因组DNA最初被认为是没有功能的，是生物体中的垃圾，通常被称为"垃圾 DNA"(junkDNA)。但目前的研究表明，这些垃圾DNA大多可转录产生非编码 RNA(non-codingRNA，简称ncRNA)。根据成熟转录本大小的不同，ncRNA可分为小分 子ncRNA(如siRNA、 miRNA、 piRNA等)，中等长度ncRNA(70-200nt)和lncRNA (km^200nt)。目前，ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA，而对lncRNA的研究还处 于起步阶段。由于序列内部存在过多的终止密码子，lncRNA不能被翻译成蛋白质，通 常是以RNA转录本的形式行使其生物学功能，如发育过程中的细胞分化、细胞增殖、细 胞凋亡和类固醇代谢等，越来越多的证据表明lncRNA在细胞中起着调控基因表达的重 要作用。最近的研究发现，lncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系，例如与肺癌、 非霍杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等疾病有关，研究结果表明 lncRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用(见Tarantul V. ， Nilolaev A.， Harming H., et al. ， Detection of abundantly transcribed genes and gene translocation in human immunodeficiency virus-associated non-HodgkirT slymphoma. Neoplasia, 2001, 3: 132-142.)。因此，通过大范围分析肿瘤和正常组织的lncRNA,可以鉴定与肿瘤特异相 关的lncRNA，使其成为潜在的病理诊断标记。通过引入针对具有癌基因特性的lncRNA 的短发夹RNA(short-hairpinRNA，简称shRNA，下文中"shRNA"的含义为短发夹RNA) 可以有效地表达特异性的小分子干扰RNA(small interference RNA，简称siRNA，下文中 "siRNA"含义为小分子干扰RNA)并抑制lncRNA作用的发挥，比其他的治疗手段的毒 副作用会更低。相反，通过病毒载体或质粒载体过表达具有肿瘤抑制基因作用的 IncRNA,进而抑制其调控的特定耙基因的表达，也可以达到抑制肿瘤生长的效果。为 了人类的健康，开发更多的肿瘤特异性表达的lncRNA对基于lncRNA的肿瘤诊断和治疗 具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种人黑色素瘤细胞特异表达的IncRNA及其RNA干扰 耙点(RNA interference,简称"RNAi",下文中"RNAi"的含义为RNA干扰)，以及RNA干扰耙点shRNA、 siRNA、编码shRNA的正义链DNA和反义链DNA及转录shRNA 的重组质粒；本发明的再一目的是提供所述人黑色素瘤细胞特异表达的1ncRNA及 shRNA、 siRNA和转录shRNA的重组质粒的用途。
本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的IncRNA克隆自人恶性黑色素瘤细胞yusac， 其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: l所示(长239nt)，或与序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性，或为序列表中SEQIDNO: l所示核苷酸 序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列，命名为"lncRNA-UN'。
本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰耙点(RNAi耙 点)，来自lncRNA-UN，含有序列表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，或与序列表 中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性，或为序列表中SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的短发夹 RNA(shRNA)，含有序列表中SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列，或与序列表中SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性，或为序列表中SEQIDNO: 3所示核 苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的小分子干 扰RNA (siRNA)，含有序列表中SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列，或与序列表中SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性，或为序列表中SEQ ID NO: 4所 示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
本发明所述编码人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的 shRNA的正义链DNA和反义链DNA，根据lncRNA-UN的RNAi靶点序列设计；所述 正义链DNA含有序列表中SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列，或与序列表中SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性，或为序列表中SEQIDNO: 5所示核苷酸 序列进行了硫代修饰的序列；所述反义链DNA含有序列表中SEQ IDNO: 6所示的核 苷酸序列，或与序列表中SEQIDNO: 6所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性，或 为序列表中SEQ ID NO: 6所示核苷酸序列进行了硫代修饰的序列。
本发明所述转录短发夹RNA的真核重组质粒，由编码人黑色素瘤细胞特异表达的 长非编码RNA的RNA干扰耙点的shRNA的正义链DNA和反义琏DNA退火后形成的 双链DNA片段与真核表达载体构建而成。
实验表明，本发明所述lncRNA-UN在黑色素瘤组织中高表达，在癌旁组织中不表 达，因而lncRNA-UN可在制备诊断黑色素瘤疾病的试剂中的应用。
4实验表明，在黑色素瘤细胞中表达lncRNA-UN对应的shRNA和siRNA能明显降 解细胞内源性1ncRNA-UN并抑制黑色素瘤细胞的恶性生长，因而本发明所述人黑色素 瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的shRNA及siRNA，以及编码shRNA 的重组质粒可在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。
本发明所述lncRNA-UN序列、lncRNA-UN的RNAi靶点序列，lncRNA-UN干扰耙 点的shRNA序列，siRNA序列，及编码shRNA的DNA序列既可通过生物学方法获得， 又可通过化学合成方法获得，若通过化学合成方法制备，只要将其核苷酸序列提供给有 关专业公司，委托其合成即可。为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征， 可对其进行硫代修饰或/和甲氧基修饰。
本发明具有以下有益效果
1、 本发明为黑色素瘤疾病的诊断提供了新的方法和试剂，有利于黑色素瘤疾病的 确诊与治疗。
2、 本发明为黑色素瘤疾病的治疗提供了新的方法和药物，对于挽救黑色素瘤疾病 患者的生命具有重要意义。
图1是定量PCR检测本发明所述lncRNA-UN在人恶性黑色素瘤组织及癌旁组织中 表达的结果图。
图2是对单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN和转入空真核表达载体 pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1进行软琼脂集落生长检测的结果图。
图3是将单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN和转入空真核表达载体 pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1注入裸鼠后的实验结果图，图中，1-1和1-2 为第l只裸鼠的移植瘤，2-1、 2-2为第2只裸鼠的移植瘤，3-1、 3-2为为第3只裸鼠的 移植瘤。
图4是本发明所述lncRNA-UN在对照细胞株yusac-shLUC和稳定低表达细胞株 yusac-shUN中的表达情况图，图中，1泳道为lncRNA-UN在对照细胞株yusac-shLUC 中的表达，2泳道为lncRNA-UN在稳定细胞株yusac-shUN中的表达。
图5是对稳定细胞株yusac-shUN和对照细胞株yusac-shLUC进行软琼脂集落生长 检测的结果图。
图6是将稳定细胞株yusac-shUN和对照细胞株yusac-shLUC注入裸鼠后的实验结 果图，图中，l-l和l-2为各实验组中第l只裸鼠的移植瘤，2-1、 2-2为各实验组中第2 只裸鼠的移植瘤，3-1、 3-2为各实验组中第3只裸鼠的移植瘤。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。下属实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等著的分子克隆实验室手 册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)， Freshney著的动物细胞培养 基本技术指南第五版(John Wiley&Sons， Inc, 2005)中所述的条件及实验步骤，或按 照制造厂商所建议的条件及实验步骤。
实施例l : lncRNA-UN的克隆与分析
1、 试剂
Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；MMLV逆转录酶、DNA聚合酶、pfU酶、Mfe I 酶、^Tw I酶、RNase抑制剂均购自立陶宛Fermentas公司；T7 RNA聚合酶购自美国 NEB公司；随机引物购自美国Promega公司；TALON金属离子树脂购自美国BD Clontech公司；PCR引物由Invitrogen公司合成。
2、 菌株、细胞株和载体
人恶性黑色素瘤细胞yusac购自美国标准菌种收藏所(ATCC); BL2菌株购
自天津天有利科技有限公司；PCR-blunt-TOPO载体购自美国Invitrogen公司；pET-28a(+) 载体购自德国Novagen公司。 ，
3、 实验方法
3.1人恶性黑色素瘤细胞yusac总cDNA文库的构建 3.1.1 yusac细胞总RNA的提取
1) 人恶性黑色素瘤细胞yusac培养至75%汇合度，加入1 mL Trizol试剂，用枪头 吹打混匀；
2) 用5 mL带7号针头的1次性注射器吹打10次进行匀浆，将匀浆样品在室温孵 育5 min;
3) 力nO,2mL氯仿，盖紧Ep管盖，用手剧烈振荡15 s并于室温孵育2 3 min;
4) 4°C， 12,000 x g离心15 min;
5) 将水相层转移到1干净的1.5mLEp管中，加入0.5mL异丙醇及20昭 糖原，颠倒混匀，将混匀后的样品于室温孵育10min;.
6) 4。C, 12,000 x g离心10 min。倒掉上清液，用75%的乙醇1 mL洗涤RNA 沉淀l-2次，旋涡振荡混合样品后，4°C， 7，500xg离心5min;
7) 倒掉乙醇，常温干燥RNA沉淀10 min，加入50 pL无RNA酶的H20， 并于55°C孵育5 min，以使RNA充分溶解，于260nrn测定RNA浓度。 3.1.2逆转录(RT)
在500pLEP管中加入以下组分 yusac细胞RNA10 随机引物(10nmol/L) 1 pLH20 18 pL
混匀后70。C温育5min，迅速置冰浴中，静置3min后加样如下 RNase抑制剂1 pL dNTP(10mmol/L) 1 5 x buffer 8 jjL MMLV逆转录酶1 pL
混匀后42。C温育lh， 70。C10min灭活逆转录酶，-20°C保存样品。 3.1.3 yusac细胞总cDNA文库的构建
将本实施例3丄2所得单链cDNA经DNA聚合酶及pfU酶处理得到平末端双链 cDNA(操作步骤见DNA聚合酶、pfo酶操作手册)。所得平末端双链cDNA连接到 PCR-blunt-TOPO载体上，构建yusac细胞总cDNA文库。
3.2带组氨酸标签His-PSF融合蛋白的原核表达及亲和纯化
3.2.1多聚酶链式反应(PCR)扩增PSF基因的编码序列(Coding Sequence, CDS)
反应体系为
PCR缓冲液(10x) 5pL MgCl2 (2.5 m mol/L) 2.5pL dNTP (2.5 m mol/L) l.OjxL 上游引物(10nmol/L) 0.5pL 下游引物(10pmol/L) 0.5^L
pcDNA3.1-PSF (连接位点为￡coi I和￡coi V) 0.1 TaqDNA聚合酶(5 U尔L) 0.1 pL PfiiDNA聚合酶(5U4iL) 0.3pL ddH20 40pL 矿物油30pL
反应参数为94。Clmin(预变性)；94。C30sec (变性)，65°C30sec (复性)，72。C2min (延伸)，所述变性-复性-延伸23个循环；72'C10min (终延伸)。
引物序列如下
上游引物(FP): 5，-ATATTACCATATGTCTCGGGATCGGTTCCGG-3，(下划线标示 AWe I酶切位点)
下游引物(RP): 5，-GGGCTCGAGCTAAAATCGGGGTTTTTTGTT-3，(下划线标示 ^Tw I酶切位点)
3.2.2 His-PSF融合蛋白的原核表达载体的构建
将PSF的编码序列通过AWe I禾Q Wo I酶切位点克隆到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点区，得到重组质粒pET-28a(+)-PSF (载体多克隆位点区末端自带组氨酸His 标签)。
3.2.3 His-PSF融合蛋白的表达
1)将本实施例3.2.2所得重组质粒pET-28a(+)-PSF转化到五.co" BL21菌株中； 2)接种转化了重组质粒pET-28a(+)-PSF的Eco"BL21单菌落于LB液体 培养基(含50吗/ml卡那霉素)中，37'C震荡培养；
3)检测菌液OD600至0.6-0.7时加入1.0mmol/LIPTG，并将温度调至25。C， 诱导培养过夜。
3.2.4 His-PSF融合蛋白的亲和纯化
1) 离心收集菌体，菌体经PBS缓冲液(140mmol/LNaCl， 2.7mmol/LKCl， 5mmol/LNa2HP04， 1.8mmol/L KH2P04及5mmol/L EDTA， pH7.2)洗涤后重新悬
浮于20mL PBS(含0.5 mol/LNaCl， lmmol/L PMSF及lmmol/L DTT);
2) 冰浴超声破壁，13，000x g离心30min收集上清；
3) 沉淀以相同步骤重复处理一次，合并两次上清收集液，得到蛋白粗提液；
4) 将TALON金属离子亲和树脂(BDClontech)用平衡-洗涤缓冲液(250mmol/L Na3P04, 1.5mol/LNaCl, pH7.0)预平衡；
5) 加适量蛋白粗提液于预平衡后的TALON金属离子亲和树脂，轻柔摇晃1.5hrs;
6) 加入平衡-洗涤缓冲液(含有10mmol/L咪唑)洗涤树脂两次；
7) 用平衡-洗涤缓冲液(含有250mmol/L咪唑)洗脱树脂上结合的His-PSF重组蛋
白；
8) 洗脱得到的重组蛋白用50倍体积的透析缓冲液(20rnM H印es， 20%glycerol, 100mMKCl， 0.2mMEDTA， 0.2mMPMSF， 0.5mMDTT， pH7.9)在4。C透析过夜，中 途更换透析缓冲液一次；
9) 得到的透析产物用液氮速冻，lh后长期冻存于-8(TC;
3.3 PSF蛋白结合RNA的筛选及编码PSF结合RNA的cDNA子文库的构建 利用组氨酸标签将原核重组质粒表达的His-PSF融合蛋白结合于TALON金属离子 树脂上；用T7 RNA聚合酶将yusac细胞总cDNA文库中的cDNA插入片段体外转录为 RNA混合体，RNA混合体通过5次反复过柱，使能够与PSF蛋白结合的RNA吸附于 树脂上；将RNA从树脂上洗脱，逆转录合成cDNA，将cDNA连接到PCR-blunt-TOPO 载体上构建cDNA子文库，文库中富集了编码与PSF蛋白结合的RNA的克隆，挑取阳 性克隆测序。
3.4所获克隆序列的分析
所获克隆序列测序，对人基因组序列(1111 ://^^11(^.111111.&1^(^/1>1&30进行BLAST分析，并找到它们在人染色体上的精确定位(http:〃genome.ucsc.edu/)。挑选出^200bp且 位于基因组非蛋白质编码区的序列。其中获得一条239nt的lncRNA,其序列如序列表 中SEQ ID NO: 1所示，定位于6号染色体的165453538-165453778位核苷酸，其为一 未知序列编码，命名为lncRNA-UN。 3.5 lncRNA-UN的RT-PCR鉴定
使用Trizol试剂从人恶性黑色素瘤组织提取总RNA (方法同本实施例3丄1 )，按照 常规RT-PCR方法检测lncRNA-UN在人恶性黑色素瘤组织中的表达。
3.5.1 RT (方法同本实施例3.1.2)获得黑色素瘤组织cDNA
3.5.2 PCR
PCR缓冲液(10x) 2.5 dNTP (2.5 mmol/L) 1.0 上游引物(10pmol/L) 1.0 下游引物(10nmol/L) 1.0 pL 黑色素瘤组织cDNA 0.3 DNA聚合酶(5 U/^iL) 0.2 ddH20 19 nL
反应参数均为94。C3min (预变性)；94°C 30 sec (变性)，64°C 30 sec (复性)， 72。C60sec (延伸)，所述变性-复性-延伸30次循环。 引物序列如下
5 ， -tttgacacgagtgactgtattttgaa-3 ， 5 ，-atttatgaattgtcacaggacctct-3'
须,检测RT-PCR扩增获得的序列，并与序列表中SEQIDNO: 1比对，结果显示 吻合。
实施例2:定量PCR检测lncRNA-UN在人恶性黑色素瘤组织及癌旁组织中的表达
1、 试剂、菌株、细胞株和载体
常规试剂、菌株、细胞株和载体与实施例一相同。 QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒购自德国Qiagen公司。
2、 实验方法
2.1.1合成的总cDNA
以人黑色素瘤组织及对应癌旁组织为材料，用Trizol试剂分别提取黑色素瘤组织及 对应癌旁组织的总RNA(方法同实施1中的3丄1)。将黑色素瘤组织总RNA和对应癌旁 组织总RNA各取1吗，用随机引物进行逆转录反应(方法同实施例l中的3丄2)获黑色 素瘤组织总cDNA和对应癌旁组织的总cDNA，合成的黑色素瘤组织及对应癌旁组织的
9总cDNA即为定量PCR反应的模板。
2.1.2黑色素瘤组织及癌旁组织的lncRNA-UN表达
以本实施例2丄1所得黑色素瘤组织总cDNA和对应癌旁组织的总cDNA为PCR反 应的模板，以特异于lncRNA-UN序列的RT-PCR引物(同实施例1的3.5.2中引物)为 引物，用QuantiTectSYBR Green PCR试剂盒进行定量PCR反应，即获黑色素瘤组织及 癌旁组织的lncRNA-UN表达。
2丄3实验结果
黑色素瘤组织及癌旁组织lncRNA-UN的表达情况见图1，图1中1， 3， 5， 7对应 的为黑色素瘤癌旁组织;2，4，6，8对应的为黑色素瘤组织。从图1可以看出，lncRNA-UN 在黑色素瘤组织中高表达，而在癌旁组织中不表达。实验结果表明，lncRNA-UN在黑 色素瘤组织和癌旁组织中的表达水平存在明显差异，因而lncRNA-UN可在制备诊断黑 色素瘤疾病的试剂中的应用。
实施例3: lncRNA-UN的过量表达对黑色素瘤细胞生长的影响
1、 试剂、菌株、细胞株和载体
常规试剂、菌株、细胞株和载体与实施例l相同。
pcDNA-3.1真核表达载体、lipofectamine2000转染试剂、G418抗生素均购自美国 Invitrogen公司；DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibico公司；硝基蓝四唑(nitro blue tetrazolium, NBT)购自美国Sigma公司。
Perfection 4990平板式扫描仪购自日本Epson公司。
BALB/c裸鼠，SPF(Specific Pathogen-free，无特定病原体)级，购自上海斯莱克实 验动物有限责任公司
2、 实验方法
2.1稳定高表达IncRNA-UN的单克隆细胞株的构建
2.1.1构建lncRNA-UN的真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN
将原本克隆于PCR-blunt-TOPO载体上的编码lncRNA-UN的DNA序列(由实施例 1的3.3和3.4获得)重新连接到真核表达载体pcDNA-3.1的I和jpfl I酶切位点， 构建lncRNA-UN的真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN。
2.1.2构建单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN
用含10%胎牛血清的DMEM培养基将人黑色素瘤细胞yusac培养于5%C02的37°C 培养箱中。转染前一天于6孔板中接入lxl()S个细胞/孔，用lipofectamine 2000进行转 染，每孔转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN 3pg。细胞转染24小时后用浓度为 700mg/L的G418连续筛选1-2周，得到稳定转染的单克隆黑色素瘤细胞株 yusac-lncRNA-UN。同时以空载体pcDNA-3.1稳定转染yusac细胞(见lipofectamine 2000说明书)，得到对照细胞株yusac-pcDNA3.1 。
2.1.3单克隆黑色素瘤细胞株中lncRNA-UN的表达量检测
以常规半定量RT-PCR检测各单克隆黑色素瘤细胞株中lncRNA-UN的表达量，挑 选得到lncRNA-UN表达量最高的稳定黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN。并以转入空 真核表达载体pcDNA-3.1的黑色素瘤细胞株yusac-pcDNA3.1作为对照。
50pL半定量PCR反应体系，其组分为
PCR缓冲液(10x) 5
MgCl2 (25mM) 5pL
dNTP (2.5蘭ol/L) 1.0
上游引物(10pmol/L) 0.5 nL
下游引物(10pmol/L) 0.5
模板 (yusac-lncRNA-UN或yusac-pcDNA3.1的cDNA) 2 |xL DNA聚合酶(5 U/|iL) 0.4 pL ddH20 35,6
所有PCR的反应参数为94。C3min (预变性)；94。C30ec (变性)，64。C30sec (复性)，72。C60sec (延伸)，所述变性-复性-延伸xn cycles。循环次数根据PCR反应 的起跳点确定， 一般情况下，每次具体的PCR反应较起跳点多1-2个循环。 2.2软琼脂集落生长检测
在6孔板中用lmL含0.6%琼脂糖、700mg/LG418及10%胎牛血清的DMEM培养 基铺设下层琼脂；待下层琼脂凝固后，将本实施例2丄2构建的单克隆黑色素瘤细胞株 yusac-lncRNA-UN和转入空真核表达载体的对照细胞株yusac-pcDNA3.1分别以5xl03 个细胞/孔的数量接入lmL含0.3%琼脂糖、700mg/LG418及10%胎牛血清的DMEM培 养基，混匀后铺设上层琼脂；待上层琼脂凝固后，培养于5。/。C02的37'C培养箱中培养。 2周后，加入400[iL 1.25g/L的硝基蓝四唑(nitro blue tetrazolium， NBT)染色液，置于 5%<:02的37'C培养箱中孵育过夜，透射扫描仪扫描的图像见图2。
图2表明，与转染空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1相比， 转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN稳定 过量表达lncRNA-UN，可以显著促进黑色素瘤细胞yusac的集落性生长，增强了 yusac 细胞的体外恶性生长特性。
2.3裸鼠移植瘤生长检测
实验裸鼠为5周龄裸鼠，分成两组，每组3只， 一组用于注射本实施例2丄2构建 的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN, —组用于注射本实施例2丄2构建的转入 空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1。将单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN和转入空真核表达载体pcDNA-3.1的 对照细胞株yusac-pcDNA3.1分别以5xl()S个细胞/注射点的剂量对裸鼠进行颈部皮下注 射(每只裸鼠2个注射点)，待移植瘤长出后，每3天检测一次大小，移植瘤长出后约一 个月，将裸鼠脱颈椎处死，取出肿瘤，两组裸鼠的实验结果见图3，从图3可以看出， 注射单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN的裸鼠长有移植瘤，注射对照细胞株 yusac-pcDNA3.1的裸鼠未长有移植瘤。
图3表明，与转染空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1相比， 转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN稳定 过量表达lncRNA-UN可以显著促进黑色素瘤细胞yusac的体内成瘤性，增强了 yusac 细胞的体内恶性生长特性。
实施例4: lncRNA-UN特异性shRNA抑制黑色素瘤细胞的恶性生长特性
1、 试剂、菌株、细胞株和载体
常规试剂、菌株、细胞株和载体与实施例l相同。
正义链DNA和反义链DNA模板由美国Invitrogen公司合成；限制性内切酶5"wHl 和历wrflll均购自立陶宛Fermentas公司；真核表达载体pGenesil-l购自武汉赛晶公司。
2、 实验方法
2.1 lncRNA-UN特异性RNA干扰载体的构建
将lncRNA-UN的序列信息提交siRNA互联网设计工具(www.dharmacon.com)，获 得可信度最高的RNAi靶点序列(如序列表中SEQIDNO: 2所示)。根据lncRNA-UN 的RNAi耙点序列设计编码特异性shRNA分子的正义链DNA和反义链DNA模板，将 所述正义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DNA片段克隆进RNA干扰载体 pGenesil-l,构建lncRNA-UN干扰重组质粒。将构建好的lncRNA-UN干扰重组质粒导 入哺乳动物细胞后，能在其中转录出shRNA(如序列表中SEQIDNO: 3所示)，shRNA 在动物细胞内被动物细胞固有的Dicer酶进一步切割形成具有RNA干扰功能的siRNA (如序列表中SEQIDNO: 4所示)，从而诱导RNA干扰程序的启动。正义链DNA和 反义链DNA模板序列如下
1) 编码lncRNA-UN RNAi靶点shRNA的正义链DNA:
5'^^grGGTCTTCCTCAGCTCCATTTCAAGAGAATGGAGCTGAGGAAGACCATmTI@~3'
2) 编码lncRNA-UN RNAi靶点shRNA的反义链DNA:
序列中下划线部分为靶基因的RNAi靶点序列及相应互补序列；方框部分为限制性 内切酶5amHl和州wdll的识别位点，用于退火后形成的双链DNA片段克隆进RNA干 扰载体；中间未标示部分编码shRNA的茎环(loop)。2丄1正义链DNA和反义链DNA的退火
将编码lncRNA-UN RNAi靶点的shRNA的正义链DNA和反义链DNA片段浓度分 别调整为25(VM，退火形成互补双链DNA分子(经退火处理后5'及3'端分别带有 BamHl/Hindm酶切位点)。退火反应条件如下
shRNA-S模板(250pM) 5
shRNA-A模板(250pM) 5
lOx退火缓冲液(100mMTris-HCl,pH7.5， lOmMEDTA, lMNaCl) 1.25pL H20 1.25nL
混匀，石蜡油覆盖后离心10s， 95°C温育5min，经1-2小时缓慢降温至室温，此 时两条寡核苷酸精确退火为寡核苷酸双链(浓度为lOOpM);退火后的双链DNA用灭菌 水稀释100倍，浓度为lpM。
2.1.2构建lncRNA-UN干扰重组质粒
将退火形成的双链DNA片段连接到RNA干扰载体pGenesil-1的5amHl////mmi酶 切位点，构建lncRNA-UN特异性shRNA的真核重组质粒pGenesil-shUN。连接反应条 件如下
pGenesil-1载体(约0.005pM) 10 |aL 双链DNA(l一) 0.5|aL 10 x连接酶缓冲液2
H20 5.5 连接酶2|iL
混匀，离心5sec， 16°C连接过夜，70。C10min灭活连接酶，-20°C保存样。 2.1.3构建作为负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC
构建作为负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC的方法同本实施例2丄1和 2丄2。将负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC导入哺乳动物细胞后转录出萤火 虫荧光素酶基因/wczy^fl^特异的shRNA-shLUC，其编码DNA序列的正义及反义链分 别为
5'-[gg|gg|gtagcgcggtgtattatacttcaagagagtataatacaccgcgctactttttt§-3' 5 '-|ggg^aaaaaagtagcgcggtgtattatactctcttgaagtataatacaccgcgctac§-3'。 2.2稳定低表达lncRNA-UN的单克隆细胞株的构建
同实施例3中的2丄2所述方法将获得的真核重组质粒pGenesil-shUN稳定转染人黑 色素瘤细胞yusac，经G418筛选、半定量RT-PCR检测后，获得IncRNA-UC表达量最 低、RNAi效果最好的稳定细胞株yusac-shUN。同时，以负对照的RNA干扰重组质粒 pGenesil-shLUC转染yusac细胞，得到对照细胞株yusac-shLUC。 lncRNA-UN在对照细
13胞株yusac-shLUC和稳定细胞株yusac-shUN中的表达情况见图4。图4表明，稳定细胞 株yusac-shUN中，lncRNA-UN的表达量较对照细胞株yusac-shLUC明显降低，说明选 用的RNAi耙点序列正确无误，shRNA诱导的RNAi效果明显，稳定低表达lncRNA-UN 的单克隆细胞株构建成功。 2.3软琼脂集落生长检测
同实施例3中2.2所述方法分别对稳定细胞株yusac-shUN和对照细胞株 yusac-shLUC进行软琼脂集落生长检测(细胞接种量为1><104个细胞/孔)，检测结果见图 5。由图5可知，转染真核重组质粒pGenesil-shUN降解yusac细胞内源性lncRNA-UN 后，yusac细胞的集落性生长受到了一定程度的抑制，其体外恶性生长特性减弱，而转 染对照重组质粒pGenesil-shLUC对yusac细胞的体外恶性生长特性没有影响。这表明 lncRNA-UN特异性的shRNA对黑色素瘤细胞的生长具有抑制作用，并具有治疗黑色素 瘤疾病的作用，可在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。
2.4裸鼠移植瘤生长检测
同实施例3中的2.3所述方法分别对稳定细胞株yusac-shUN和对照细胞株 yusac-shLUC进行裸鼠移植瘤生长检测(细胞注射剂量为2><106个细胞/注射点)，检测结 果见图6。由图6可知，转染真核重组质粒pGenesil-shUN降解yusac细胞内源性 lncRNA-UN后，yusac细胞的体内成瘤性受到了一定程度的抑制，其体内恶性生长特性 减弱，而转染对照真核重组质粒pGenesil-shLUC对yusac细胞的体内恶性生长特性没有 影响。这进一步表明lncRNA-UN特异性的shRNA对黑色素瘤的发生发展具有抑制作用， 具有治疗黑色素瘤相关疾病的用途，可在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。序列表
<110>四川大学
< 120>人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA序列及其用途 <160> 6
<170〉 PatenlnVersion 3.2
<210> 1 <211> 239 <212〉 RNA <213〉人
<400〉 1
ugugugugug
ccauuugcca
cauauauuuu
gacaauucau
uaugugagag agagagagag agagcccucu cuucaugguc uuccucagcu 60
gaguuugaca cgagugacug uauuuugaau cuuacaacuu ucacagauua 120
aagaaaauuc cuacuuaagc uagaugagcu uucucuuuca gagguccugu 180
aaauuuaaug uuugcauuua aaucuuacuu gcuua皿aug agcauuguu 239
<210> 2 <211> 19 <212> RNA <213>人
<400> 2
uggucuuccu cagcuccau 19
<210> 3 <211> 47 <212> RNA <213〉人工序列
<400> 3
uggucuuccucagcuccauu ucaagagaau ggagcugagg aagacca 47
<210> 4 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列
<400> 4ugguc皿ccu cagcuccau 19 accagaagga gucgaggua 19
<210> 5
<211> 59
<212> DNA <213〉人工序列
<400> 5
gatcctggtc ttcctcagct ccatttcaag agaatggagc tgaggaagac catttttta 59
<210> 6 <211> 59 <212〉 DNA <213>人工序列
<400> 6
agcttaaaaa atggtcttcc tcagctccat tctcttgaaa tggagctgag gaagaccag 59
权利要求
1、一种人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA，其特征在于它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO1所示，或与序列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性，或为序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
2、 一种权利要求1所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰耙 点，其特征在于它含有序列表中SEQIDNO: 2所示的核苷酸序列，或与序列表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性，或为序列表中SEQ ID NO: 2所 示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
3、 一种权利要求2所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰耙 点的短发夹RNA，其特征在于它含有序列表中SEQIDNO: 3所示的核苷酸序列，或与 序列表中SEQIDNO: 3所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性，或为序列表中SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
4、 一种权利要求2所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰耙 点的小分子干扰RNA，其特征在于它含有序列表中SEQIDNO: 4所示的核苷酸序列， 或与序列表中SEQIDNO: 4所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性，或为序列表中 SEQ ID NO: 4所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
5、 一种编码权利要求3所述短发夹RNA的正义链DNA和反义链DNA,其特征在 于所述正义链DNA含有序列表中SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列，或与序列表中SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性，或为序列表中SEQIDNO: 5所 示核苷酸序列进行了硫代修饰的序列；所述反义链DNA含有序列表中SEQ ID NO: 6 所示的核苷酸序列，或与序列表中SEQIDNO: 6所示的核苷酸序列具有90%以上的同 源性，或为序列表中SEQIDNO: 6所示核苷酸序列进行了硫代修饰的序列。
6、 一种转录权利要求3所述短发夹RNA的真核重组质粒，含有权利要求5所述正 义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DNA片段。
7、 权利要求1所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA在制备诊断黑色素瘤 疾病的试剂中的应用。
8、 权利要求3所述短发夹RNA在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。
9、 权利要求4所述小分子干扰RNA在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA(lncRNA-UN)及其RNA干扰靶点，以及RNA干扰靶点的短发夹RNA(shRNA)、小分子干扰RNA(siRNA)、编码短发夹RNA的正义链DNA和反义链DNA、转录短发夹RNA的重组质粒。实验表明，lncRNA-UN在黑色素瘤组织中高表达，在癌旁组织中不表达，可在制备诊断黑色素瘤疾病的试剂中应用。实验表明，转录短发夹RNA的重组质粒在黑色素瘤细胞中表达shRNA和siRNA能明显降解细胞内源性lncRNA-UN并抑制黑色素瘤细胞的恶性生长，因而本发明所述lncRNA-UN的RNA干扰靶点的shRNA及siRNA，以及转录shRNA的重组质粒可在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中应用。
文档编号C12N15/11GK101619312SQ20091005995
公开日2010年1月6日 申请日期2009年7月10日 优先权日2009年7月10日
发明者俸婷婷, 旭 宋, 张广丰, 灵 李, 连莹莹 申请人:四川大学