专利名称：：一种辅酶q10的生产发酵工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及辅酶Q10生产工艺的改进，特别是涉及到辅酶QIO的中间代谢工艺及其发酵配方改进的一种辅酶QIO的生产发酵工艺。
背景技术：
：辅酶QIO，化学名为2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3-甲基丁烯基-2)-苯醌，英文名Ubidecarenone，又名Coenzyme-10。辅酶Q10是一种代谢激活剂，能激活细胞呼吸；加速产生三磷酸腺苷(ATP)，并起到解毒急救作用；可改变细胞和组织的缺氧状态，对肝、脑、心脏及神经系统均有较好的保护和改善作用；它还能增强体内的非特异性免疫力。辅酶Q10是细胞自身产生的天然抗氧剂，能抑制线粒体的过氧化，保护生物膜结构的完整性，对免疫力有特异的增强作用，能提高吞噬细胞的吞噬率，增加抗体的产生，改善T细胞功能。目前，中国生产辅酶Q10多从动物组织提取或化学提取及微生物发酵培养，而国外是利用生物合成法或微生物发酵生产。组织提取法和化学提取法成本较高、工艺复杂，且产率一般，现已不作为主要发展方向。因此，用微生物发酵法生产辅酶Q10更具有推广性。近几年来，国内关于用微生物发酵提取法生产辅酶Q10的研究巳取得一定的进展，如广州微生物研究所与中山大学联合采用的农杆菌LQ10发酵生产辅酶QIO，上海方益工程有限公司的酶工程法生产辅酶QIO，但是生产水平都比较低、成本高、无法满足实际生产的需要。
发明内容本发明涉及一种辅酶Q10的生产发酵工艺，它针对辅酶Q10发酵现有技术存在的不足，在保持辅酶Q10发酵品质的前提下，根据辅酶Q10产生菌代谢过程中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10的合成速率及其含量变化，反馈调节代谢初始反应，并对合成代谢起限速作用，从而对细胞内目的产物辅酶Q10的积累进行反馈调节，最终影响发酵，降低生产成本。本发明的目的是这样实现的使用的微生物用来生产本发明所述的辅酶Q10产品的微生物菌种为荚膜红假单胞菌，拉丁学名为^oJoA9eWo卿朋sc邵sWat"s(Molisch)。该菌种购自广东省微生物研究所菌种保藏中心，保藏编号为ATCC11166。荚膜红假单胞菌具有下述性质1、形态特征细胞球形，卵形到杆状，0.51.2X22.5微米，有时可长达6微米，在ra7.o以下的培养基中，细胞呈球形，常常规则排列成链与链球菌相似。2、在培养基上的特征在PH7.0以上培养基中，细胞为特征性的卵形和杆状。在ffl8.0以上，形成不规则的丝状体，同时培养基变粘。显著的特征细胞呈"乙"形排列成链。3、生理生化特征以二分分裂繁殖。光合作用内膜系统为囊型。厌氧液体培养物呈淡黄棕色(有的菌株有绿的色调)，后为深棕色。当在空气中生长时，培养物有暗红到紫红色。厌氧生长的细胞在空气中震荡几个小时后明显地光促进这个颜色的变化。4、光能异养菌，兼性好氧生长，在有光是营厌氧生活、在黑暗中营好氧生活。可长在具有简单有机物和碳酸氢钠，并补以硫胺素的矿物培养基中；有的菌株还需要加入生物素。PH范围5.5~8.5;最适合PH7.0。最适合温度25~30°C。不利用柠檬酸盐、乙醇、葡萄糖酸盐、甘油、甘露醇、甘露糖、山梨醇、酒石酸盐、亮氨酸、硫化物和硫代硫酸盐。有氢化酶和接触酶。本发明一种辅酶QIO的生产发酵工艺，其特征在于它包括以下步骤-(1)菌种传代荚膜红假单胞菌(劭oab/^ew/，o/7ascaps"2aATCC11166采用斜面传代，培养基为肉汤培养基，培养温度为3(TC，培养时间为96小时，至长出淡黄色的菌落，菌落长度为1-1.5mm;(2)菌种扩大培养将步骤(1)的菌种接入已灭菌的种子罐，进行两级培养，在无光照的条件下，控制温度为30~35°C，搅拌100500rpm，压力0.02~0.05Mpa，培养2024小时；(3)发酵补料培养在无菌条件下，将步骤(2)培养出的种子液接入发酵罐，在无光照的条件下，控制发酵温度3035'C，搅拌100300rpm，压力0.02~0.05Mpa，培养时间90~110小时，在发酵过程进行两次补入葡萄糖溶液、氨水和磷酸二氢钾溶液，第一次补料时间在20~40小时，第二次补料时间在45~65小时，补料体积分别为发酵罐计料体积的2~10%，发酵过程中，通过检测发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10和目的产物辅酶Q10的含量，补入葡萄糖溶液，使得发酵过程总糖和还原糖的含量控制在0.5~1.5%之间，补入氨水使得发酵过程pH控制在6.5~7.0之间，氨基氮含量控制在1.05.Omg/ml之间，补入磷酸二氢钾溶液使得溶磷控制在50~500ug/ml之间，当发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10与目的产物辅酶Q10的含量比值低于10%时放罐。其中步骤(2)中种子罐的培养基配方，按质量比计为硫酸铵0.10~0.50%硫酸镁0.10~0.50%磷酸二氢钾0.02-0.10%葡萄糖0.30~1.00%玉米浆粉0.02-0.10%碳酸药0.35~0.90%维生素Bi0.001~0.01%水97~99%pH值6.8培养基灭菌温度为118-12rC，时间为30分钟；其中步骤(3)中发酵罐的培养基配方，按质量比计为<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>培养基灭菌温度为118~121。C，时间为30分钟。本发明通过对发酵配方中主要底物浓度的优化，及在发酵过程中对搅拌转速的优化调控，使辅酶Q10的发酵水平有较大幅度的提升，辅酶Q10发酵水平可提高到3000u/ml以上；放罐最佳时机的确定提高了细胞内辅酶Q10生产的时间利用率，降低了发酵成本，使发酵原材料消耗大大降低。下面接合附图对本发明作进一步描述。图l为本发明的工艺流程图。图2为本发明发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10和目的产物辅酶Q10的HPLC图。图3为本发明发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10和目的产物辅酶Q10的含量及比值对比图。具体实施例方式以下的实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例l在培养基为肉汤培养基试管斜面上，将荚膜红假单胞菌在无菌条件下接种于该培养基上，控制培养温度为3(TC,培养时间为96小时，以长出淡黄色单菌落，菌落长度为1~1.5mm，然后将上述菌种在无菌条件下接入已灭菌好的装有7.5L培养基的一级种子罐中，在无需光照的条件下，控制搅拌转速400rpm，培养温度33°C,压力0.04Mpa，培养时间24小时，再移入已灭菌好的装有37.5L培养基的二级种子罐中，在无需光照的条件下，控制搅拌转速300rpm，培养温度33°C，压力0.04Mpa，培养时间24小时。一级种子罐和二级种子罐的培养基配方(按质量比)为硫酸铵0.30%，硫酸镁0.25%,磷酸二氢钾0.08%，葡萄糖0.50%，玉米浆粉0.08%，碳酸钙0.75%，维生素Bl0.005%，水97~99%，pH值为6.8，培养基在12rC灭菌30分钟。将上述种子45L全部移入500L发酵罐中在无需光照的条件下进行培养，发酵罐配料体积300L，控制发酵罐搅拌转速160rpm，培养温度34'C，压力0.03Mpa，培养110小时。发酵罐培养基配方(按质量比)为葡萄糖1.00%，玉米浆粉0.45%，硫酸铵0.33%，磷酸二氢钾O.17%，硫酸镁O.75%，维生素B10.01%，水97~99°/。，培养基在121。C灭菌30分钟。搅拌均匀后，加入氨水调节pH稳定在6.807.00间，培养基在12rC灭菌30分钟。检测得到发酵液中总糖含量、还原糖含量、氨基氮含量、磷含量。发酵过程总共进行两次补料，第一次补料时间在35小时，第二次补料时间在55小时，补料体积分别为发酵罐计料体积的5%，两次补料的原材料用量分别为发酵罐配方的5%,原材料总用量为发酵罐配方的10%。发酵过程中，通过检测发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10和目的产物辅酶Q10的含量及比值如图3，不断补加葡萄糖和氨水，使得发酵过程总糖和还原糖的含量控制在0.5~1.5%之间，发酵pH控制在6.5~7.0之间，氨基氮含量控制在1.0~5.Omg/ml之间，溶磷控制在50~500ug/ml，在30小时转速增加10rpm。在发酵末期(90~110小时)，发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10与目的产物辅酶QIO的含量比值低于10%时放罐。发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10和目的产物辅酶Q10的HPLC图见图2，发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10和目的产物辅酶Q10的含量及比值对比如图3所示。发酵目的产物辅酶Q10检测方法(参照中国药典2005年版)1、色谱系统色谱柱BDSC185um250ramX4.6mm流动相甲醇:无水乙醇=50:50检测波长:275nm流速1.0ml/min柱温35'C进样量20u1记录图谱时间2倍辅酶Q10保留时间辅酶Q10保留时间大约在13士lmin，若保留时间不在此范围内，可适当调节流动相比例或改变流速。2、辅酶Q10标准溶液的配制精密称定辅酶Q10标准品约100mg(万分之一电子天平)至100ml棕色容量瓶中，加入约90ml无水乙醇，在50'C水浴中超声溶解20min，冷却后定容。取定容后的溶液2.5ml至25ml棕色容量瓶中，用无水乙醇定容，作为供试品。取供试品溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。理论板数按辅酶Q10峰计算应不小于3000。3、发酵液中辅酶Q10效价检测3.1效价低于200ug/g用lml移液枪取发酵液至10ml棕色容量瓶中，并称取加入的发酵液质量,然后加入100yllmol/L盐酸和100yl35%双氧水，用无水乙醇定容。在5(TC水浴中超声20min，热过滤后进行HPLC检测(注意避光)。3.2效价高于200pg/g低于1000ug/g用lml移液枪取发酵液至25ml棕色容量瓶中，并称取加入的发酵液质量，然后加入100nllmol/L盐酸和100ul35%双氧水，用无水乙醇定容。在50'C水浴中超声20min,热过滤后进行HPLC检测(注意避光)。3.3效价高于1000ug/g用lml移液枪取发酵液至50ml棕色容量瓶中，并称取加入的发酵液质量,然后加入100wllmol/L盐酸和100ul35%双氧水，用无水乙醇定容。在5(TC水浴中超声30min，热过滤后进行HPLC检测(注意避光)。发酵液中QIO效价的计算-C样(yg/g):BXC标XPMXVX1000/A/m样式中A—标准品峰面积B—供试品峰面积C标一标准品中辅酶Q10的浓度(mg/ml)P呢一标准品中辅酶Q10的含量m样一发酵液的质量(g)V—溶液体积(ml)实施例2在培养基为肉汤培养基试管斜面上，将荚膜红假单胞菌在无菌条件下接种于该培养基上，控制培养温度为3(TC，培养时间为96小时，以长出淡黄色单菌落，菌落长度为11.5mm，然后将上述菌种在无菌条件下接入已灭菌好的装有1.0吨培养基的一级种子罐中，在无需光照的条件下，控制搅拌转速250卬m，培养温度33'C，压力0.04Mpa，培养时间24小时；再移入已灭菌好的装有5.0吨培养基的二级种子罐中，在无需光照的条件下，控制搅拌转速200rpm，培养温度33°C，压力0.04Mpa，培养时间24小时。一级种子罐和二级种子罐的培养基配方(按质量比)为硫酸铵0.30%，硫酸镁0.25%,磷酸二氢钾0.08%,葡萄糖0.50%，玉米浆粉0.08%,碳酸钙0.75%，维生素Bl0.005%，水97~99%，pH值为6.8，培养基在12rC灭菌30分钟。将上述种子6.0吨全部移入60吨发酵罐中在无需光照的条件下进行培养，发酵罐配料体积40吨，控制发酵罐搅拌转速120rpm，培养温度34。C，压力0.03Mpa，培养110小时。发酵罐培养基配方(按质量比)为葡萄糖1.00%,玉米浆粉0.45%，硫酸铵0.33%，磷酸二氢钾O.17%,硫酸镁0.75%，维生素B10.01%，水97~99%，搅拌均匀后，加入氨水调节pH稳定在6.807.00间，培养基在121'C灭菌30分钟。检测得到发酵液中总糖含量、还原糖含量、氨基氮含量、磷含量。发酵过程总共进行两次补料，第一次补料时间在35小时，第二次补料时间在55小时，补料体积分别为发酵罐计料体积的5%，两次补料的原材料用量分别为发酵罐配方的5%，原材料总用量为发酵罐配方的10%。发酵过程中，通过检测发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10和目的产物辅酶Q10的含量及比值如图3，不断补加葡萄糖和氨水，使得发酵过程总糖和还原糖的含量控制在0.5辅酶Q10~l.5%之间，发酵pH控制在6.5~7.0之间，氨基氮含量控制在1.0~5.Omg/ml之间，溶磷控制在5(T500ug/ml，在30小时转速增加10rpm。在发酵末期(90~110小时)，发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10与目的产物辅酶QIO的含量比值低于10%时放罐。发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10和目的产物辅酶Q10的HPLC图见图2,发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10和目的产物辅酶Q10的含量及比值对比如图3所示。发酵目的产物辅酶Q10检测方法同实施例1。权利要求1、一种辅酶Q10的生产发酵工艺，其特征在于它包括以下步骤(1)菌种传代荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonascapsulatus)ATCC11166采用斜面传代，培养基为肉汤培养基，培养温度为30℃，培养时间为96小时，至长出淡黄色的菌落，菌落长度为1～1.5mm；(2)菌种扩大培养将步骤(1)的菌种接入已灭菌的种子罐，进行两级培养，在无光照的条件下，控制温度为30～35℃，搅拌100～500rpm，压力0.02～0.05Mpa，培养20～24小时；(3)发酵补料培养在无菌条件下，将步骤(2)培养出的种子液接入发酵罐，在无光照的条件下，控制发酵温度30～35℃，搅拌100～300rpm，压力0.02～0.05Mpa，培养时间90～110小时，在发酵过程进行两次补入葡萄糖溶液、氨水和磷酸二氢钾溶液，第一次补料时间在20～40小时，第二次补料时间在45～65小时，补料体积分别为发酵罐计料体积的2～10％，发酵过程中，通过检测发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10和目的产物辅酶Q10的含量，补入葡萄糖溶液，使得发酵过程总糖和还原糖的含量控制在0.5～1.5％之间，补入氨水使得发酵过程pH控制在6.5～7.0之间，氨基氮含量控制在1.0～5.0mg/ml之间，补入磷酸二氢钾溶液使得溶磷控制在50～500ug/ml之间，当发酵液中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10与目的产物辅酶Q10的含量比值低于10％时放罐；其中步骤(2)中种子罐的培养基配方，按质量比计为硫酸铵0.10～0.50％硫酸镁0.10～0.50％磷酸二氢钾0.02～0.10％葡萄糖0.30～1.00％玉米浆粉0.02～0.10％碳酸钙0.35～0.90％维生素B10.001～0.01％水97～99％pH值6.8培养基灭菌温度为118～121℃，时间为30分钟；其中步骤(3)中发酵罐的培养基配方，按质量比计为葡萄糖0.50～1.50％玉米浆粉0.20～0.80％硫酸铵0.10～0.50％磷酸二氢钾0.05～0.30％硫酸镁0.50～2.00％维生素B10.001～0.01％水97～99％pH值6.8培养基灭菌温度为118～121℃，时间为30分钟。全文摘要本发明公开了一种辅酶Q10的生产发酵工艺，在保持辅酶Q10发酵品质的前提下，根据辅酶Q10产生菌代谢过程中主要副产物5-脱甲氧基辅酶Q10的合成速率及其含量变化，反馈调节代谢初始反应，并对合成代谢起限速作用，从而对细胞内目的产物辅酶Q10的积累进行反馈调节，通过对发酵配方中主要底物浓度的优化，及在发酵过程中对搅拌转速的优化调控，使辅酶Q10的发酵水平有较大幅度的提升，辅酶Q10发酵水平可提高到3000u/ml以上，放罐最佳时机的确定提高了细胞内辅酶Q10生产的时间利用率，降低了发酵成本，使发酵原材料消耗大大降低。文档编号C12P7/66GK101519681SQ20091006137公开日2009年9月2日申请日期2009年4月1日优先权日2009年4月1日发明者姚荣清,伟曾,朱英伟,李万钧,路赵,杨高申请人:宜都东阳光生化制药有限公司