专利名称：：用寇氏隐甲藻工业化发酵生产二十二碳六烯酸的方法
技术领域：
：本发明涉及微生物发酵生产方法，具体涉及利用寇氏隐甲藻菌株发酵生产含二十二碳六烯酸混合油脂。
背景技术：
：二十二碳六烯酸(cis-4，7,10,13,16，19-docosahexaenoicacid,简称DHA)是欧米嘎3系列长链多不饱和脂肪酸，是大脑、视网膜的重要结构物质，还能够调节中枢神经系统功能、预防和治疗心血管疾病、消除炎症、抑制癌症。DHA的商业来源目前主要是鱼油和微藻。鱼油的产量和DHA含量都不稳定，提取物夹杂鱼腥味，而且从鱼油中提取的含DHA混合油脂中还含有二十碳五烯酸(EPA)，据研究，EPA对婴幼儿的发育具有不利的影响。目前的海洋渔业资源接近枯竭，从鱼油中提取DHA造成极大的浪费。微澡的培养需要光照和二氧化碳，生产工艺繁杂，成本较高。随着人口的增加，以及人们对健康的迫切需求，全世界对DHA的需求量相应增加，需要寻求大量的DHA新来源，而且最好是此来源的DHA不含有EPA。申请(专利)号200710025079.3的专利公开了一种从隐甲藻中提取并精制DHA的方法，侧重于从隐甲藻中提取并精制DHA，对隐甲藻的发酵制备DHA涉及较少，并且其所公开的提取物中DHA含量为40—50%。申请(专利)号200610125476.3的专利公开了一种从寇氏隐甲藻中发酵提取DHA的方法。其所公开的产量为海藻细胞中DHA含量在30%-50%，获得的海藻细胞为20-40g/L，海藻细胞含油量为20-50%，其生产率不超过3.5克/升.天。
发明内容本发明所要解决的问题是提供一种用寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)原始菌株为菌种，工业化发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，该方法能够低成本、大量生产高含量的甘油三酯型DHA油脂。本发明提供的技术方案是用寇氏隐甲藻(C/yp"ecoG^/"/H工业化发酵生产二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法，包括以寇氏隐甲藻为菌种，采用包含碳源、氮源和无机盐的培养基，经发酵制得二十二碳六烯酸油脂；所述氮源中含有缓效氮源豆粕粉水解汁。经发酵制得DHA含量高于50X的油脂，其中二十碳五烯酸(EPA)含量在1%以下。上述缓效氮源由下法得到:将豆粕粉溶解在水中，调节pH至9.0—10.0，并升温至70—8(TC，保温8—10h，过滤取清液得到缓效氮源；其中豆粕粉和水的用量重量比为1:3—1:10;缓效氮源的用量为培养基总重量的4.0-8.0%。上述培养基中还含有生长因子豆芽汁，生长因子的用量为培养基总重量的2.0—4.0%;生长因子由下法得到将黄豆芽洗净，沥干，用压榨机压榨取豆芽汁液得到生长因子。所述发酵用菌种为经斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养得到的寇氏隐甲藻；或为经斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养和二级扩大培养后得到的寇氏隐甲藻。上述摇瓶扩大培养所用的培养基中含有苏木糖醇和精氨酸，苏木糖醇和精氨酸的用量分别为培养基总重量的0.05—0.15%和0.05—0.15%。本发明可在发酵培养48—60h时补充菌种，菌种的补入量为发酵液体积的8—10%。本发明还可在发酵过程中，当发酵液的还原糖含量在2—3wtX时补充碳源。本发明在发酵培养过程中可逐渐增加溶氧初始通气量为0.5VVM，以后每次补充碳源后提高通气量0.02VVM。通过溶氧递增的方式既增加溶氧，又稳定代谢平衡。在发酵全过程中维持pH自然。优选地，本发明在发酵进入稳定期(本发明所用菌种进入稳定期的时间为66-72h)前控制温度为29—31'C，在进入稳定期后控制温度为22—24。C。本发明利用寇氏隐甲藻发酵生产DHA的方法，其提取物中DHA含量为51—55%，且其中的EPA含量不超过1X，DHA生产率可以达到4.6克/升.天，大大降低了DHA的发酵成本。本发明的技术指标均明显高于现有技术的技术指标，所制得的DHA质量更优，成本更低，有利于大规模的工业化生产制造，并降低DHA的消费门槛，以利于DHA的推广应用。具体实施例方式本发明通过优化培养基和培养条件采用传统的发酵方法生产二十二碳六烯酸油脂。优化的摇瓶培养基配方如下表优化的摇瓶培养基配方(以克/100ffll培养基计)项目含量项目含量豆粕粉水解汁2.0-4.0豆芽汁2.0-4.0酵母膏0.3-0.6谷氨酸钠0.8-1.2葡萄糖2.0-5.0糖蜜0.8-1.2磷酸二氢钾0.2-0.6七水硫酸镁0.2-0.8海盐0.3-1.2精氨酸0.05—0.15苏木糖醇0.05—0.15优化的一级、二级及发酵培养基配方如下:表优化的一级、二级及发酵培养基配方(以克/100ml培养基计)项目含量项目含量豆粕粉水解汁4.0-8.0豆芽汁2.0-4.0酵母膏0.4-0.8谷氨酸钠1.0-3.0葡萄糖4.0-8.0玉米浆0.2-0.7磷酸二氢钾0.2-0.6七水硫酸镁0.2-0.8海盐0.3-1.2取活化好的斜面菌种经摇瓶、一级和二级种子罐扩大培养后，按照8—10%的接种量接入发酵罐中，PH自然，初始控制罐温29—3rC，发酵66—72h后调节发酵温度至22—24'C，初始空气流量为0.5VVM，发酵全程控制发酵液中还原糖浓度在2.0%以上，当发酵液的还原糖含量在2—3wtX时补糖(补充碳源)；每次补糖后增加空气流量0.02VVM，在发酵至48—60h时在发酵液中补充8—10%的菌种。由此发酵工艺生产DHA,干菌体中含油量为60—80%,油脂中DHA含量为51—55%，而且其中EPA含量不超过1.0X，DHA生产率达到4.6克/(升.天)5在本发明方法中，在适合于生产含DHA油的条件下培养寇氏隐甲藻。一般，真菌培养技术是本领域技术人员所熟知的，这些技术可以用于本发明方法。通常采用斜面菌种接种摇瓶，摇瓶接种一级种子罐，一级种子罐接种二级种子罐，二级种子罐接种发酵罐的工艺流程进行发酵培养寇氏隐甲藻生产含甘油三酯型DHA的混合油脂。发酵培养基的组成可以不相同，但都含有碳源和氮源。较好的碳源是葡萄糖，其含量为每升发酵培养基中约40-80克。用量可以随最终培养物密度而不同。可以使用的碳源包括葡萄糖，糖蜜，玉米糖浆或其他用于发酵的低成本常规碳源。本领域熟练技术人员很容易确定这些碳源的合适用量。通常，在培养过程中需要分批另外补充碳源，以满足微生物对碳源的消耗，而一次性加入全部碳源则会抑制微生物的生长。氮源通常选择有机和无机氮源。有机氮源包括酵母膏、酵母提取物、蛋白胨等，无机氮源包括硝酸钠、硝酸氨、硫酸铵等。但在本发酵研究生产DHA油脂中发现使用水解处理的缓效有机氮源豆粕粉水解汁不仅能够满足菌体生长繁殖的需求，并能够有效提高产油量，并提高油脂中的DHA含量。所使用的豆粕粉水解汁可在配制培养基时一次性的加入。其中豆粕粉水解汁制备方法是将豆粕粉和水按照1:3—1:10的比例配制溶解后，调节pH至9.0—10.0，并升温至70—80。C，并保温8—10h，过滤取清液备用。本发明在培养基中添加促生长因子，以促进菌体的生长，并提高DHA含量和产率。本研究发现，在发酵培养基中添加2—4%豆芽汁作为寇氏隐甲藻发酵的生长因子，不仅能够有效促进菌体的生长，并可以较高的提高DHA的含量和产率。本发明的培养基中是否添加微量元素对本发明的结果没有实质性影响。所述微量元素为维生素Bi、维生素B6和维生素Bu中的一种或几种，当为其中一种时，添加量为培养基重量的0.002—0.01%;当为其中几种时，任意一种组分的添加量为培养基重量的O.002—0.01%。通常，在摇瓶中按照优化的培养基配方配制摇瓶培养基。例如，可以按照每升培养基中添加40克豆粕水解汁，40克豆芽汁，5克酵母膏，IO克谷氨酸钠，50克葡萄糖，IO克糖蜜，4克磷酸二氢钾，3克七水硫酸镁，IO克海盐，l克苏木糖醇，l克精氨酸，并加水至所需体积，维持pH自然。将配制好的培养基经高温灭菌(12rC，30min,0.1—0.12Mpa)，并冷却至约306°c后接入培养好的寇氏隐甲藻菌种进行培养。通常，按照优化的一级、二级及发酵培养基配方在发酵罐中配制种子和发酵培养基。例如，可以按照每升培养基中添加60克豆粕水解汁，40克豆芽汁，5克酵母膏，20克谷氨酸钠，60克葡萄糖，5克玉米浆，5克磷酸二氢钾，6克七水硫酸镁，10克海盐，，并加水至所需体积，维持pH自然。将配制好的培养基经高温灭菌(121°C，30min，0.1—O.12Mpa),并冷却至约30'C后接入培养好的寇氏隐甲藻菌种进行培养。在发酵液中通入空气进行气体交换，供给菌体生长所需要的氧气，在发酵培养过程中逐渐增加溶氧，通过溶氧递增的方式既增加溶氧，又稳定代谢平衡。通常在发酵初始空气流量为0.5VVM，后每次补糖后增加空气流量0.02VVM。接种量以8—10%为好，最好使用约10%体积的接种量。发酵过程中需要监测营养物消耗水平。发酵液中还原糖含量最好不低于2.0%;建议当发酵液的还原糖含量在2—3wtX时补充葡萄糖。在一个优选的实施例中，一个发酵周期消耗每升培养基150克葡萄糖。发酵温度一般控制在22至3rC。在发酵的不同阶段控制不同的温度，一般在发酵的初始阶段控制在稍高的温度，较好的是控制在29-3rc，以利于菌体的生长和繁殖，而在油脂积累的阶段将温度控制在诱导DHA优先产生积累的值，优选的是控制在22-24。C。在发酵至48—60h时补充发酵液体积10%的菌种。在发酵的全过程中维持pH自然，无需进行控制。发酵结束后通过离心或过滤的方法收获藻体细胞，通过挤压或酶解的方法破壁后加入有机溶剂正己烷进行萃取，再经脱除溶剂后得到毛油，毛油经碱炼、脱色、脱臭后得到精炼DHA油脂。进行一项或多项的改进，可以发酵得到含有高于50%DHA残基的甘油三酯类油脂，最佳条件下可以得到含有55%的DHA残基的甘油三酯类油脂。在最佳的实施方式中，发酵培养基中豆粕粉水解汁浓度为60g/l，酵母膏浓度约6g/l，豆芽汁浓度为40g/1，谷氨酸钠浓度为20g/l，葡萄糖浓度约80g/1，玉米浆浓度为5g/1，磷酸二氢钾浓度为5g/1，七水硫酸镁浓度为4g/1，海盐添加量为10g/1，并加水至所需体积，维持pH自然。初始空气流量为0.5VVM,当发酵液中还原糖含量在2—3wtX时即补入葡萄糖，每次补糖后增加空气流量0.02VVM,在发酵至48小时时补入发酵液体积10%的菌种，整个发酵过程中维持pH自然。当发酵液中氨基氮含量低于0.035%时结束发酵，如此可以获得DHA含量为55%的混合油脂，并且其中EPA含量不超过0.5%。通过以上发酵过程优化，能够获得较高的生物量，其中含有60%至80%的油脂，其中甘油三酯形式的DHA残基占51%至55%,并且其中的EPA含量小于1%。以上对本发明进行了全面的描述，以下非限定性实施例用于进一步说明本发明。实施例l.摇瓶培养基筛选配方a强化缓释氮源一豆粕粉水解汁(g/100ml培养基)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>配方d综合实验(g/100ml培养基)项目含量项目含量豆粕粉水解汁4.0豆芽汁3.0酵母膏0.6谷氨酸钠0.8葡萄糖5.0糖蜜1.0磷酸二氢钾0.6七水硫酸镁0.3海盐1.0精氨酸0.1苏木糖醇0.1配方e空白对照实验(g/100ml培养基)项目含量项目含量酵母膏0.6谷氨酸钠0.8葡萄糖5.0糖蜜1.0磷酸二氢钾0.6七水硫酸镁0.3海盐1.0维生素B,0.005维生素B120.005配方f普通发酵培养基配方(g/100ml培养基)项目含量项目含量酵母膏0.5谷氨酸钠1.0葡萄糖6.0玉米浆0.5磷酸二氢钾0.4七水硫酸镁0.3海盐1.0维生素B10.005维生素B120.005上述豆粕粉水解汁由下法制得:将豆粕粉溶解在水中，调节pH至9.O—IO.0，并升温至75t:，保温9h，过滤取清液得到豆粕粉水解汁；其中豆粕粉和水的用量重量比为1:6。豆芽汁由下法得到将新鲜黄豆芽洗净，沥干，用压榨机压榨取豆芽汁液得到豆芽汁。按照上述培养基a/b/c/d/e配方，在500ml摇瓶中配制100ml培养基，pH自然，9经高温灭菌，冷却备用。将活化好的寇氏隐甲藻斜面菌种接入上述a/b/c/d/e摇瓶培养基中，维持温度30°C，转速180rpm，培养48h，制得寇氏隐甲藻种子液。按照培养基f的配方，制备一级和发酵培养基，将制得的种子液接入一级种子罐中，通入0.25VVM的空气，维持温度为30。C，维持pH自然，发酵培养48h。将上述扩培种子液按照10%的接种量加入50升发酵罐，通入0.5VVM的空气，维持温度为3(TC，维持pH自然，发酵过程中维持发酵液中还原糖浓度为3%以上，当还原糖量低于3%时补充葡萄糖，随即增加空气流量0.02VVM，发酵至48h时补充10X的新鲜菌种，发酵至70h调整发酵温度为23-C，发酵至100小时，发酵液中氨基氮浓度为0.03%，终止发酵。发酵结束后通过离心的方法收获藻体细胞，通过酶解的方法破壁后加入有机溶剂正己烷进行萃取，再经脱除溶剂后得到毛油，毛油经碱炼、脱色、脱臭后得到精炼DHA油脂。发酵结果见下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由上表可以看出，强化各因素的实验在指标上均优于空白对照，且综合因素的配方各项技术指标最高，均优于其他，优选作为摇瓶培养基配方。实施例250升罐发酵培养寇氏隐甲藻生产DHA培养基配方(g/100ml培养基)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上述豆粕粉水解汁由下法得到:将豆粕粉溶解在水中，调节pH至9.0，并升温至80°C，保温8，过滤取清液得到豆粕粉水解汁；其中豆粕粉和水的用量重量比为1:3。豆芽汁的制备同实施例l。加水至所需体积，pH自然，高温灭菌，冷却至30。C备用。将实施例1配方d制备得到的摇瓶菌种按照10%的接种量接入含30升培养基的50升发酵罐中，通入0.5VVM的空气，维持温度为3(TC，维持pH自然，发酵过程中维持发酵液中还原糖浓度为3%以上，当还原糖量低于3%时补充葡萄糖，随即增加空气流量0.02VVM，共计补入4%葡萄糖，发酵至48h时补充10X的新鲜菌种，发酵至68h调整发酵温度为23。C，发酵至96小时，发酵液中氨基氮浓度为0.03%，终止发酵。发酵结束后通过离心的方法收获藻体细胞，通过酶解的方法破壁后加入有机溶剂正己垸进行萃取，再经脱除溶剂后得到毛油，毛油经碱炼、脱色、脱臭后得到精炼DHA油脂。进行相关指标分析获得生物量为41g/1，油脂含量为60%，气相色谱检测DHA含量为53.鄉，EPA含量为0.6tDHA生产率为4.2g/升.天。以下为发酵后所得混合油脂的组成成分C12:00.1023C14:04.4136C16:018.9548C16:l1.1578C18:00.6745C18:l0.3457C18:20.3173C18:30.1084C20:41.6938C20:50.4124C22:518.374711C22:653.2673实施例3500升罐发酵培养寇氏隐甲藻生产DHA培养基配方(g/100ml培养基)项目含量项目含量豆粕粉水解汁8.0豆芽汁3.0酵母膏0.5谷氨酸钠1.0葡萄糖6.0玉米浆0.5磷酸二氢钾0.4七水硫酸镁0.3海盐1.0上述豆粕粉水解汁由下法得到:将豆粕粉溶解在水中，调节pH至lO.O，并升温至70°C，保温10h，过滤取清液得到缓效氮源；其中豆粕粉和水的用量重量比为1:10。豆芽汁的制备同实施例l。加水至所需体积，pH自然，高温灭菌，冷却至30。C备用。将实施例1配方d制备得到的摇瓶菌种按照10%的接种量接入含30升培养基的50升发酵罐中，通入0.25VVM的空气，维持温度为29°C，维持pH自然，发酵培养48h，得到扩培种子液。将上述扩培种子液按照10%的接种量接入含300升培养基的500升发酵罐，通入0.5VVM的空气，维持温度为3rC，维持pH自然，发酵过程中维持发酵液中还原糖浓度为3%以上，当还原糖量低于3%时补充葡萄糖，随即增加空气流量0.02VVM，共计补入4.5%葡萄糖，发酵至48h时补充10%的新鲜菌种，发酵至70h调整发酵温度为23'C，发酵至100小时，发酵液中氨基氮浓度为0.03%，终止发酵。发酵结束后通过离心的方法收获藻体细胞，通过酶解的方法破壁后加入有机溶剂正己垸进行萃取，再经脱除溶剂后得到毛油，毛油经碱炼、脱色、脱臭后得到精炼DHA油脂。进行相关指标分析获得生物量为51g/1，油脂含量为72%，气相色谱检测DHA含量为55.3%，EPA含量为0.2%，DHA生产率为4.6g/升.天。以下为发酵后所得混合油脂的组成成分C12:00.101512C14:04.4264C16:017.2475C16:l1.1723C18:00.6612C18:l0.3245C18:20.3194C18:30.1218C20:41.6836C20:50.2144C22:518.3592C22:655.3345实施例45吨罐发酵培养寇氏隐甲藻生产DHA培养基配方(g/100ml培养基)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>豆粕粉水解汁和豆芽汁的制备同实施例1。加水至所需体积，pH自然，高温灭菌，冷却至30'C备用。将实施例1配方d制备得到的摇瓶菌种按照10%的接种量接入含30升培养基的50升发酵罐中，通入0.25VVM的空气，维持温度为3(TC，维持pH自然，发酵培养48h，得到一级扩培种子液。将上述一级扩培种子液按照10%的接种量接入含300升培养基的500升发酵罐，通入0.25VVM的空气，维持温度为30。C，维持pH自然，发酵培养48h，得到二级扩培种子液。将上述二级扩培种子液按照10%的接种量接入含3吨培养基的5吨发酵罐，通入0.5VVM的空气，维持温度为3(TC，维持pH自然，发酵过程中维持发酵液中还原糖浓度为3%以上，当还原糖量低于3%时补充葡萄糖，随即增加空气流量0.02VVM，共计补入4.0%葡萄糖，发酵至55h时补充10%的新鲜菌种，发酵至70h调整发酵温度为22°C，发酵至115小时，发酵液中氨基氮浓度为0.03%，终止发酵。发酵结束后通过离心的方法收获藻体细胞，通过酶解的方法破壁后加入有机溶剂正己垸进行萃取，再经脱除溶剂后得到毛油，毛油经碱炼、脱色、脱臭后得到精炼DHA油脂。进行相关指标分析获得生物量为53g/1，油脂含量为68%，气相色谱检测DHA含量为54.7%，EPA含量为0.3呢，DHA生产率为4.5g/升.天。以下为发酵后所得混合油脂的组成成分C12:00.1426C14:04.4482C16:017.5257C16:l1.1246C18:00.6857C18:l0.3572C18:20.3146C18:3O.簡C20:41.6367C20:50.3163C22:518.6045C22:654.725权利要求1.用寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)工业化发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，包括以寇氏隐甲藻为菌种，采用包含碳源、氮源和无机盐的培养基，经发酵制得二十二碳六烯酸油脂；其特征在于所述氮源中含有缓效氮源豆粕粉水解汁。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于缓效氮源由下法得到:将豆粕粉溶解在水中，调节pH至9.0—10.0，并升温至70—80'C，保温8—10h，过滤取清液得到缓效氮源；其中豆粕粉和水的用量重量比为1:3—1:10;缓效氮源的用量为培养基总重量的4.0-8.0%。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于培养基中还含有生长因子豆芽汁，生长因子的用量为培养基总重量的2.0_4.0%;生长因子由下法得到将黄豆芽洗净，沥干，用压榨机压榨取黄豆芽汁液得到生长因子。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述发酵用菌种为经斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养得到的寇氏隐甲藻；或为经斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养和二级扩大培养后得到的寇氏隐甲藻。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于摇瓶扩大培养所用的培养基中含有苏木糖醇和精氨酸，苏木糖醇和精氨酸的用量分别为培养基总重量的0.05—0.15%和0.05—0.15%。6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在发酵培养48—60h时补充菌种，菌种的补入量为发酵液体积的8_10%。7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在发酵过程中，当发酵液的还原糖含量在2—3wt^时补充碳源。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在发酵培养过程中逐渐增加溶氧初始通气量为0.5VVM，以后每次补充碳源后提高通气量0.02VVM。9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在发酵进入稳定期前期，控制温度为29—3rC，在进入稳定期后控制温度为22—24'C。全文摘要利用寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)工业化发酵生产含甘油三酯型二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法，包括以寇氏隐甲藻为菌种，采用包含碳源、氮源和无机盐的培养基，经发酵制得二十二碳六烯酸油脂；所述氮源中含有缓效氮源豆粕粉水解汁。经发酵制得DHA含量高于50％的油脂，其中二十碳五烯酸(EPA)含量在1％以下，DHA生产率达到4.6g/升.天。本发明DHA产量高、纯度高，质量安全可靠，生产成本低，生产稳定，并且基本不含EPA；能够低成本、大量生产绿色、安全的高含量的甘油三酯型DHA油脂。文档编号C12P7/64GK101538592SQ20091006183公开日2009年9月23日申请日期2009年4月28日优先权日2009年4月28日发明者吴艳荣,夏德才,宁超美,徐丛英,林绍朗,解秀娟申请人:湖北福星生物科技有限公司