专利名称：快速检测杜氏利什曼原虫的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于人兽共患传染病病原体的检测技术领域，尤其涉及一种快速检测杜氏利 什曼原虫的荧光定量PCR试剂盒，适用于杜氏利什曼原虫定性定量检测。
背景技术：
黑热病(Visceral Leishmaniasis, VL)是由杜氏利什曼原虫引起的、以白蛉为传 播媒介的人兽共患传染病，临床上以长期不规则发热、肝脾肿大、贫血以及外周血白 细胞减少为主要特征。近年来VL与结核病、艾滋病合并感染逐年增多。
中华白蛉是我国VL的主要媒介，分布极广。 一般5月初开始出现， 一年只繁殖一 个世代，高峰多见于6月，仅个别地区在7、 8月会出现小高峰。按生态习性差异，我 国中华白蛉可分为2种不同类型平原地区主要是家栖型，嗜吸人血；而在山丘地区 则属近野栖或野栖型，嗜吸各种牲畜和犬类的血液，兼吸人血，且能自体生殖。病犬 是VL主要的传染源，在黑热病的传播起重要作用，通过禁止养犬和消灭犬源型VL是 防制黑热病最有效的措施，但是实践证明这些措施并不能从根本上消灭黑热病。由于
其对人类健康及农牧业生产存在很大的潜在危害，快速、准确地诊断杜氏利什曼原虫 病显得十分重要。
实时荧光定量PCR是近年来发展起来的一种新型核酸扩增技术，它可在PCR产物聚集 的时候检测，即"实时"检测，PCR反应在指数扩增范围内检测反应产物的量。根据在 指数扩增期的产物量来推算初始模板的量。方法操作简便，产出率高，且兼具高敏感 性和可信的特异性。因此将荧光定量PCR应用于杜氏利什曼原虫定性定量检测具有较强 的实用性和可行性，但国内外还未见到有检测杜氏利什曼原虫的荧光定量检测试剂和 上市。
临床检测上，传统的病原学检査方法具有检出率不高、培养时间长等不足，传统的 血清学方法由于简便、快速、敏感性尚佳，仍然是各实验室的常用方法，但血清学只 是感染的间接标志，当机体免疫力低下时，则很难获得可供诊断的血清学结果。并且， 由于人群感染杜氏利什曼原虫的普遍性，血清学检测对现症感染的诊断价值受到一定 限制。常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使其在临床诊断上受到一些限 制，因此急需一种精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速检测利什曼原虫 的荧光定量PCR试剂盒。
本发明采用以下技术方案 一、PCR试剂盒
该试剂盒包括DNA提取液、荧光定量PCR反应液、标准阳性模板pMD-kDNA、 kDNA 基因特异性引物和阴性质控标准品。具体地说
(1) DNA提取液配制裂解缓冲液，包括如下组分0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 0.15 M NaCl， 0. 1 0. 5 M EDTA (pH 8. O)和1% 4% SDS。配制蛋白酶K的贮存 液，浓度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体，终浓度 为4ng/ul，即为DNA提取液。
(2) 荧光定量PCR反应液由SYBR-Green I，正反向引物kDNA-F和kDNA-R、 MgCl2、 dNTPs及无菌双蒸水组成。
(3) 标准阳性模板pMD-kDNA:标准阳性模板杜氏利什曼原虫pMD-k副A是含有杜 氏利什曼原虫高度保守基因KDNA基因117个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质 粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5a增殖后用碱裂解法提取，用分光光度计测Aw。定量 并稀释至1(T拷贝/P 1，使用前进行IO倍梯度的系列稀释。
(4 ) KDNA基因特异性引物序列正向引物kDNA-F:5 ' -CCTATTTTACACCAACCCCCAGT-3 ' ; 反向引物 kDNA-R: 为 5 ' -GGGTAGGGGCGTTCTGCGAAA-3'。
(5)阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。
本试剂盒的工作原理
SYBR-Green I是一种常用的实时定量PCR技术，它巧妙地利用了 PCR技术高效扩 增、光谱技术的敏感性及定量分析的优点，通过实时检测扩增过程中荧光物质强度的 变化来进行PCR产物的分析。SYBR-Green I具有以下特点1)它能结合到双链DNA的小 沟部位;2)它只有和双链DNA结合后才发出荧光;3)PCR反应中的高温变性时，DNA双链 分开，无荧光:4) PCR反应中的低温复性和延伸时，形成双链DNA, SYBR-Green I发荧 光，此阶段采集信号，荧光量的增加与PCR产物的累积量呈比例关系。对杜氏利什曼 原虫的定量可通过与标准品的循环域值(Ct, Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模板数呈一定比 例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性 梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起 始拷贝数。
本发明的使用方法包括以下步骤
(l)对贮存液浓度为1(T拷贝/u 1标准阳性模板pMD-kDNA进行IO倍的系列稀释， 制备阳性标准品；
(2 )从待测标本中提取基因组DNA;
(3) 分别取步骤2中的DNA和同样量的系列稀释的步骤1中的两种阳性标准品加 入到荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测；
(4) 通过比较待测样品和相应标准品的循环域值Ct值，对待测样品的起始拷贝 数进行定量。
本发明与现有技术相比具有定量准确、检测速度快，仅2小时、特异性好，灵敏度 高、使用步骤简单，可重复性好等特点。
总之，本发明可以杜氏利什曼原虫样品进行定性定量检测，可以替代传统的病原 学和血清学检测方法。
以下实验表明试剂盒可以快速检测利什曼原虫
(1) 取新鲜或冰冻脾组织块0. lg (0.5cm3)，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加 入lml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K
(500ug/ml) 20u 1，混匀。在65。C恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37。C水浴12
24 h，用酚-氯仿-异戊醇(酚氯仿异戊醇=25: 24: 1)抽提2次，无水乙醇沉淀
后用30u 1 TE (0. 1M Tris-HC1， lmM EDTA pH8. 0)溶解，取1 u 1做PCR反应。
(2) 将阳性标准模板系列稀释为1(f拷贝/ul、 108拷贝/111、 K)7拷贝/ul、 106 拷贝/ul、 105拷贝/ui1。
(3) 分别取荧光定量PCR反应液各24y 1，取第①步所得利什曼原虫DNA和第② 步稀释的利什曼原虫阳性标准模板各1 Ul，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应 管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为95。C预变性60s; 95°C 15 s ， 56°C 15 s ， 72°C 45 s ，扩增40个循环。
循环结束后，运用仪器自带软件，读取待测样品拷贝数。结果为109拷贝"1、1。 8拷贝/u 1、 107拷贝/^ 1、 106拷贝/11 1的C t值分别为23.09， 23.69， 24.84， 26.40; 阴性对照为0 。
反复重复试验3次，得到Ct值进行统计学分析A0.05,数据差异无显著意义，说 明不同批次之间的检测结果具有可比性和良好的重复性。
从上述实例可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光 定量PCR检测试剂盒对样品(DNA)的检测仅需2个小时就能完成。
本发明与现有技术相比其积极效果在于具有定量准确、检测速度快，仅2小时、 特异性好，灵敏度高、使用步骤简单，可重复性好，可以利什曼原虫样品进行定性定 量检测，可以替代传统的病原学和血清学方法。
图l:利什曼原虫标准阳性模板109拷贝"1、 108拷贝"1、 K)7拷贝/Hl、 106拷
贝/iil、 1(f拷贝/u I不同稀释度PCR扩增结果。1为DL2000 Marker; 2 9分别为利 什曼原虫标准阳性模板106拷贝/"1、 1()5拷贝/ul、 H)4拷贝/ul、 1()3拷贝/!il、 102 拷贝/ul、 10拷贝/ul、 l拷贝/ul、 0. l拷贝/yl为模板的PCR扩增产物。
图2:质粒pMD-kDNA的标准曲线。
具体实施例方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明
下列实例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克 等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出 版社，2001，细胞实验指南，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例l:试剂盒组成与配制
(1) DNA提取液配制裂解缓冲液，包括如下组分0.1 M Tris-HC1 (pH 8.0)， 0.1 0.15 M NaCl， 0. 1 0. 5 M EDTA (pH 8. O)和1% 4% SDS。配制蛋白酶K的贮存 液，浓度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体，终浓度 为4ug/ul，即为DNA提取液。
(2) 荧光定量PCR反应液配制反应液SYBR-Green I (10X) 0. 5u 1， 10Xbuffer
2. 5ul， dNTP (2.5鹏ol/L) 2ul， Taq酶(5U/ul) 0. 2ul， MgCl2 (2. 5mmol/L) 3.5"1，正向引物和反向引物各lu 1 (10umol/L)，无菌双蒸水14. 3ul。
(3) 标准阳性模板贮存液浓度为1(T拷贝/ul标准阳性模板pMD-kDNA。(4)阴性指控标准品为无菌双蒸水。 实施例2:试剂盒的特异性试验
用经过DNA有效性验证毛滴虫、贾第虫、微小隐孢子虫、弓形虫、柔嫩艾美尔球 虫等5种对照阳性样品各1 U 1为模板进行荧光定量PCR反应，同时设空白对照组和阳 性对照组。
PCR扩增条件为循环条件为95。C预变性60 s ; 95°C 15 s ， 56°C 15 s ， 72°C 45 s ,扩增40个循环。
结果只有利什曼原虫检测有扩增曲线，而毛滴虫、贾第虫、微小隐孢子虫、弓形 虫、柔嫩艾美尔球虫均无扩增曲线。将利什曼原虫经三次重复，溶解曲线的溶解温度 稳定，说明目的基因PCR扩增产物特异性较好；获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳， 均与目的条带大小(117bp)相近。上述结果说明试剂盒具有较好的特异性。 实施例3试剂盒的敏感性试验
首先将计数后的利什曼原虫前鞭毛体DNA进行稀释，检测其总DNA含量，采用倍 比法作10X， 100X， 1000X， 2000X， 4000X， 8000X稀释利什曼原虫DNA，各lul 为模板进行荧光定量PCR反应，同时设空白对照组。
PCR扩增条件为循环条件为95。C预变性60 s ; 95°C 15 s ， 56°C 15 s ， 72°C 45 s ，扩增40个循环。
通过实验结果确定试剂盒的敏感性，通过6个稀释度的扩增曲线，表明该荧光定 量PCR试剂盒最多能检测到0. 5个利什曼原虫。
权利要求
1、一种快速检测杜氏利什曼原虫的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于由DNA提取液，荧光定量PCR反应液，标准阳性模板杜氏利什曼原虫pMD-kDNA、杜氏利什曼原虫kDNA基因特异性引物对、阴性质控标准品组成；正向引物kDNA-F5′-CCTATTTTACACCAACCCCCAGT-3′；反向引物kDNA-R为5′-GGGTAGGGGCGTTCTGCGAAA-3′；标准阳性模板pMD-kDNA含有杜氏利什曼原虫高度保守基因的117个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是荧光定量PCR反应液是荧光定量PCR反应液由SYBR-Green I，正 反向引物kDNA-F和kDNA-R、 MgCl2、 dNTPs及无菌双蒸水组成。
3、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是杜氏利什曼原虫标准 阳性模板所包含的kDNA基因的核苷酸序列为5' -cctattttacacc犯cccctagtttcccgcctccgagcccaaa犯tggcaattttcggccaaa aa"tcgaacggggtttctgcacccatttttcg犯tttcgcagaacgcccctaccc-3'。
4、权利要求1所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤l)DNA提取液配制裂解缓冲液，包括如下组分0. lMTris-HC1(pH 8.0)， 0.1 0. 15 M NaCl， 0. 1 0. 5 M EDTA (pH 8.0)和1% 4%SDS。配制蛋白酶K的贮存液，浓度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体，终浓度为4ug/ul，即为 DNA提取液。2)定量PCR反应液包括由SYBR-Green I，正反向引物kDNA-F 和kDNA-R、 MgCl2、 dNTPs及无菌双蒸水组成；3)标准阳性模板pMD-kDNA:标准阳性模板杜氏利什曼原虫 pMD-kDNA:标准阳性模板杜氏利什曼原虫pMD-kDNA是含有杜氏利什 曼原虫高度保守基因KDNA基因117个碱基的核苷酸片段构成的 pMD-18重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5 a增殖后用碱裂解法 提取，用分光光度计测A，定量并稀释至1(T拷贝/ul，使用前进行 IO倍梯度的系列稀释。(4) 杜氏利什曼原虫KDNA基因特异性引物序列正向引物kDNA-F:5' -CCTATTTTACACCAACCCCCAGT-3';反向引物 kDNA-R:为5' -GGGTAGGGGCGTTCTGCGAAA-3'。(5) 阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测杜氏利什曼原虫的荧光定量PCR试剂盒，涉及一种人兽共患传染病病原体的基因检测技术，适用于杜氏利什曼原虫定性定量检测。本发明由标准阳性模板、荧光定量PCR反应液、杜氏利什曼原虫kDNA基因特异性引物、阴性质控标准品组成。本发明定量准确，检测速度快，特异性好，灵敏度高，使用步骤简单，可重复性高，可以替代传统的病原学检测方法。
文档编号C12Q1/68GK101613752SQ20091006702
公开日2009年12月30日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者全 刘, 商立民 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所