专利名称：一株来自汽车排气管的耐高温的好氧反硝化细菌c-2的制作方法
技术领域：
本发明涉及工业微生物领域，更具体的说，是涉及一种优良微生物的选育。
背景技术：
反硝化细菌是指能够将N03_还原为气态氮的细菌，多为异养、兼性厌氧细菌，如反 硝化杆菌、斯氏杆菌、萤气极毛杆菌等。它们广泛分布于土壤、厩肥和污水中。反硝化机理适宜的脱氮菌在有外加碳源的情况下，以氮氧化物为氮源，将氮氧化物同化合成 为有机氮化合物，成为菌体的一部分(合成代谢)，脱氮菌本身获得生长繁殖；而异化反硝 化作用(分解代谢)则将NOx最终还原成氮气。NOx中N02和NO溶解于水的能力差别较大，因此净化机理也不同。NO不与水反应， 溶解度很小，亨利系数17. 1 31. 4Pa(0 30°C )，其净化途径可能有两条一是NO溶解于 水；二是被反硝化细菌吸附，然后在其氧化氮还原酶的作用下被还原为N2。N02先溶于水形 成NCV、N02-及N0，化学反应式为2N02+H20 — HN03+HN023HN02 — HN03+2N0+H20N03_在微生物硝酸盐还原酶的作用下还原为N02_，N02_在亚硝酸盐还原酶的作用下 再还原为N0，最后N0被吸附在微生物表面后，在氧化氮还原酶的作用下被还原为N2。脱氮微生物的种类很多且差别较大。许多属都有脱氮种，其类型有异养脱氮菌、专 性自氧菌和兼性自养菌。其中数量最多的异养脱氮菌，包括无色杆菌属(Achromobacter)、 产碱杆菌属(Alcaligenes)、杆菌属(Bacillus)、色杆菌属(Chromobacterium)、棒杆菌属 (Corynebacrerium)、盐杆菌属(Halobacterium)、生丝杆菌属(Hyphomicrobium)、微球菌 属(Micrococcus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、假单胞菌 属(Pseudomonas)、螺菌属(Spirillum)、黄单胞菌属(Xanthomonas)。这些异养脱氮菌有些 是专性好氧菌，有些是兼性厌氧菌，它们在好氧、厌氧或缺氧条件下，利用有机物进行脱氮。 此外，还有少量专性和兼性的化能自养菌也能还原NOx。如硫杆菌属(Thiobacillus)中的 脱氮硫杆菌(T. denitrificans)利用无机基质，如H2、H2S和S、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等作为 氢受体，能在厌氧条件下利用N03_或N02_作为氢受体，使处于还原价位的含硫化合物氧化， 而把NO,和NO3-还原成N2。好氧反硝化细菌的发现20世纪80年代，Robert son等人报道了好氧反硝化细菌和好氧反硝化酶系的存 在，并证实了泛养硫球菌Thiosphaera pantot ropha(现更名为脱氮副球菌Paracoccus denit rif ications)在生长过程中，02和N03_共同存在时，其生长速率比两者单独存在时 都高。目前，越来越多的研究证明细菌好氧反硝化的存在，并发现了一些在有氧条件下有较 高反硝化率的细菌。好氧反硝化细菌作用机制的电子理论
早期理论认为，O2的得电子能力阻止了电子传递给N03_或N02_，从而抑制了反硝化 的进行。而最近研究表明，细菌反硝化酶系和有氧呼吸系统同时存在。NO3-被还原的同时， O2被还原，氧不是抑制反硝化酶活性和反硝化酶生成的直接因素。缺少N03_或O2都会降低 细菌的生长率和反硝化率。Wilson等人提出了细菌反硝化过程中的电子传递模型(
图1)。 从图1中可以看出N03_、02均可作为电子最终受体。反硝化菌可将电子从被还原的物质传 递给02，同时也可通过硝酸还原酶将电子传递给N03_。鉴于当前关于好氧反硝化细菌大多从土壤或活性污泥中分离筛选，而在我国，氮 氧化物的第二大来源来自于汽车废气，于是申请人将取样目标定位在汽车排气管，从中分 离筛选好氧反硝化细菌。
发明内容
本发明是为了证明微生物的分布广，种类多，在前人的研究基础上，尝试从汽车排 气管中分离筛选出性能优良的好氧反硝化细菌，并且分离得到了该菌株。本发明通过下述技术方案实现培养基(1)富集培养基 SM(L) 丁 二酸钠 2.84g、NaNO3 0. 67g, KH2PO4 1. 36g, (NH4)2SO4O. 24g、酵母粉 1. 00g、MgSO4 · 7H20 0. 19g，Iml 微量元素溶液，pH = 7. 2。(2)鉴别培养基 BTB(L) :L-天门冬酰胺酸 l.OOg、KNO3 1. OOg, KH2PO4 1. OOg, FeCl3 · 6H20 0. 05g、CaCl2 · 2H20 0. 20g、MgSO4 · 7H20 1. OOg, ImL 溴百里酚兰(BTB)储备液 (1 % 的 BTB 乙醇溶液)，琼脂 20. 00g, pH = 7. 0-7. 3(3)菌种驯化及细菌反硝化能力测试培养基DM(L) 丁二酸钠4. 72g, NaNO3O. 67g、 KH2PO4 1. 50g、Na2HPO4 0. 42g、MgSO4 · 7H20 1. 00g，2ml 微量元素溶液，pH = 7. 2，固体培养 基中时加入20. OOg琼脂粉。(4)微量元素溶液(L) =CuSO4 ·5Η20 4. 00g、FeS04 ·7Η20 0. 70g、FeCl3 ·6Η207· 00g、 CoCl2 · 6H20 0. 20g、NaMoO4 · 2H20 3. 40g 和 CaCl2 · 2H20 2. 00g。(1)富集培养从汽车排气管取样品0. 5g，加入盛有50mL SM培养基的250mL锥形 瓶中，在30°C、120r/min条件下富集培养3天，将2mL培养物接种到新鲜的SM培养基，以相 同的条件进行培养。如此重复3次。(2)初筛富集培养物在BTB培养基(BTB培养基中加入丁二酸钠8. 50g/L)上划 线培养，30°C培养1 3天。挑取使BTB培养基呈现蓝色的菌落进行复筛。(3)复筛将初筛菌落在DM培养基上划线分离3次，以获得纯培养物，并依据菌种 在DM培养基的生长情况，挑选生长旺盛的菌株，之后通过测定各菌株的反硝化能力进行复 筛，反硝化能力的检测主要分亚硝酸盐生成和N2、N2O等气体生成的检测。(4)N2, N2O等气体生成的检测参照细菌糖类发酵试验的方法进行，即将具有反硝 化能力的细菌纯培养物接种到盛有IOmL DM培养液、且放置有小倒管的大试管中，37°C连续 培养，每天观察产气情况。(5)好氧反硝化细菌的生长规律的测定在容积为250mL的锥形瓶中，加入DM培 养液IOOmL,接种ImL菌悬液(0D = 1)，在30°C、120r/min条件下培养，每隔4h取一次样在 波长540nm处用722S型可见分光光度计测其光密度。
(6)最佳生长pH值的测定配制不同pH值的DM培养液，各取30mL分装到容积250mL的锥形瓶中，接种0. 5mL菌悬液，30°C、120r/min条件下培养20h，以DM培养液作空 白，在波长540nm处测定菌悬液的光密度。(7)最佳生长温度的测定将pH7. 2的DM培养液30ml置于250mL锥形瓶中，接种 0. 5mL 菌悬液，分别在 10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、37°C、50°C和 60°C条件下培养 20h，在波 长540nm处测定其光密度值。(8)好氧反硝化细菌的形态观察_革兰氏染色镜检.本发明具有以下技术效果1、分离筛选得到好氧反硝化细菌功能性菌株C-2。2、菌株C-2在培养的12h内已经进入了对数生长期，其生长速度较快，从20h开始 进入稳定生长期。3、菌株C-2在pH5. 0-8. 5范围内的生长良好，最适生长pH值为6. 7-7. 5。4、菌株C-2在50°C条件下，0D值最大，生长状况最佳，属于耐高温菌。经试验，该 菌株在90°C的环境下能生长。5、经革兰氏染色可知，菌株C-2为革兰氏阴性短杆菌，菌体两端浑圆，单独分散排 列。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明详细说明。实施例1 工艺流程取样一富集一初筛一复筛一N2、N20等气体生成的检测一好氧反硝化细菌的生长 规律的测定一最佳生长PH值的测定一最佳生长温度的测定一好氧反硝化细菌的形态观察 —得到好氧反硝化细菌C-2。
权利要求
一株来自汽车排气管的耐高温的好氧反硝化细菌C 2，其特征在于是由汽车排气管中取样分离筛选的。
2.针对权利要求1所述的细菌，其特征在于菌株C-2在培养的12h内已经进入了对数 生长期，其生长速度较快，从20h开始进入稳定生长期。在pH5. 0 8. 5范围内的生长良好， 最适生长PH值为6. 7 7. 5。在50°C条件下，生长状况最佳，属于耐高温菌。经试验，该菌 株在90°C的环境下能生长。经革兰氏染色可知，菌株C-2为革兰氏阴性短杆菌，菌体两端浑 圆，单独分散排列。
全文摘要
本发明为一株来自汽车排气管的耐高温的好氧反硝化细菌C-2。其分离筛选方法是取样、富集、初筛、复筛、N2、N2O等气体生成的检测、好氧反硝化细菌的生长规律的测定、最佳生长pH值的测定、最佳生长温度的测定以及好氧反硝化细菌的形态观察。其性能是菌株C-2在培养的12h内已经进入了对数生长期，其生长速度较快，从20h开始进入稳定生长期。pH值在5.0～8.5范围内的生长良好，最适生长pH值为6.7～7.5。温度在50℃条件下，生长状况最佳，属于耐高温菌。经试验，该菌株在90℃的环境下能生长。经革兰氏染色可知，为革兰氏阴性短杆菌，菌体两端浑圆，单独分散排列。通过此菌株的性能检测，可以看出，将此菌株应用于工业废弃的处理之上，会获得巨大的经济价值，而从长远意义上讲，将会对环境保护工作起到一定程度的推动作用。
文档编号C12N1/20GK101988042SQ20091007007
公开日2011年3月23日 申请日期2009年8月6日 优先权日2009年8月6日
发明者李建颖, 林翠仪, 池凌钰 申请人:天津市玄真生物医药科技发展有限公司