专利名称：：亚麻单倍体细胞悬浮系培养基的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及亚麻单倍体细胞悬浮系培养基。技术背景随着我国亚麻花药培养研究的不断进展，花药培养技术已应用于亚麻抗性育种领域。利用单倍体细胞继代培养过程中产生的高频率变异，可在细胞水平上筛选各类型突变体。由于产生突变的单倍体，只有一套染色体，所以不产生嵌合体，显性和隐性的突变形状同时表达，而且突变形状稳定，可加快抗性育种进程。目前,细胞悬浮培养已在抗性细胞筛选中广泛应用，通过细胞悬浮培养可以得到单细胞群体，在诱变剂和选择剂作用时比较均匀，不易产生嵌合体。G.Melchers(1959)在金鱼草悬浮细胞培养物中得到了温度突变体.Zenk(1974)从单倍体烟草的细胞悬浮培养物筛选出抗2.4—D的细胞系。在亚麻抗性突变体筛选研究中多采用愈伤组织为筛选材料，由于愈伤组织在突变体筛选过程中，并非所有的细胞都能与培养基直接接触，从而使细胞不能均匀地受到选择压力的作用，不利于突变体的筛选。N6、B5、MS悬浮培养基中亚麻花粉愈伤组织分散性不好，虽然细胞增殖速度较快，但获得的单细胞数量少，细胞团的比重较大。
发明内容本发明为了解决现有在亚麻抗性突变体筛选中多采用愈伤组织为筛选材料，由于愈伤组织在突变体筛选过程中，由于细胞不能全部与培养基直接接触，从而使细胞不能均匀地受到选择压力的作用，不利于突变体的筛选；N6、B5、MS悬浮培养基中花粉愈伤组织的分散性不好，虽然细胞增殖速度较快，.但获得的单细胞数量少，细胞团的比重较大的问题，提供了一种亚麻单倍体细胞悬浮系培养基，解决该问题的具体技术方案如下本发明的亚麻单倍体细胞悬浮系培养基(YHX)由1/2N6大量元素、B/微量元素、维生素、氨基酸、植物激素、添加活性炭、蔗糖和溶剂合成，其每升培养基中按重量由1/2N6大量元素2186:1mg、Bs微量元素15.8mg、盐酸硫胺素120mg、盐酸吡哆素110mg、脯氨酸100300mg、谷氨酰胺100500mg、活性炭1050mg、2.4—Dl.0mg、6—BAO,1mg、蔗糖2040g和余量为蒸馏水合成；合成后培养基的PH值为5.56.0。1/2Ne大量元素成分按重量由硝酸钾1415mg、硫酸铵231mg、硫酸镁92mg、氯化钙83mg、磷酸二氢钾200mg、硫酸亚铁27.8mg、乙二胺四乙酸二钠37.3mg和肌醇100mg构成。B5微量元素成分按重量由硫酸锰10mg、硼酸3mg、碘化钾0.75mg、硫酸锌2mg、硫酸铜0.025mg和氯化钴0.025mg构成。本发明在培养基中添加了1050mg/L的活性炭，不仅可以促进单倍体细胞的发育，而且可以清除细胞在培养过程中产生的毒副作用物质。将亚麻花粉愈伤组织转入培养基(YHX)中进行悬浮培养，与其它培养基相比，不仅分散性好，而且获得的单细胞较多，悬浮培养3天，细胞开始分裂，最终获得的单倍体胚性细胞色泽鲜黄、细胞分裂旺盛、分散性好和细胞团的比重小；本发明能大幅度提高胚性愈伤组织诱导率，经再生的愈伤组织结构紧密，成小球状，表面有小颗粒结构。具体实施方式具体实施方式一本实施方式由1/2N6大量元素、Bs微量元素、维生素、氨基酸、植物激素、添加活性炭、蔗糖和溶剂合成，其每升培养基中的浓度按重量由1/2Ne大量元素2186.1mg、Bf微量元素15.8mg、盐酸硫胺素120mg、盐酸吡哆素l10mg、脯氨酸100300mg、谷氨酰胺100500mg、活性炭1050mg、2.4—D1.0mg、6—BA0.1mg、蔗糖2040g和余量为蒸馏水合成；合成后培养基的PH值为5.56.0。亚麻单倍体细胞悬浮系培养基是建立单倍体细胞悬浮系的关键因子。具体实施方式二:本实施方式的1/2N6大量元素成分按重量由硝酸钾1415mg、硫酸铵231mg、硫酸镁92mg、氯化钙83tng、磷酸二氢钾200mg、硫酸亚铁27.8mg、乙二胺四乙酸二钠37.3mg和肌醇100mg构成；Bs微量元素成分按重量由硫酸锰10mg、硼酸3mg、碘化钾0.75mg、硫酸锌2mg、硫酸铜0.025mg和氯化钴0.025mg构成。具体实施方式三本实施方式的与具体实施方式一的不同点在于活性炭的添加量为每升培养基30mg。其它于具体实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式选择继代培养1个半月左右的色泽嫩绿、有小颗粒组成的结构紧密的花粉愈伤组织分别接种到培养基YHX、N6、B5、MS中，每25ml液体培养基中接入35g愈伤组织，放入振荡培养箱中150次/min，温度为25°C、在黑暗条件下连续振荡培养510天，对获得的细胞悬浮液，通过单层无菌纱布过滤后，再经离心机在500rpm/min的条件下收集小细胞团和单细胞。接入到YHX中的花粉愈伤组织分散性好、细胞分裂速度快，获得的单细胞较多。而接入到Ne、B5、MS悬浮培养基中的花粉愈伤组织分散性不好，虽然细胞增殖速度较快；但获得的单细胞数量少，细胞团的比重较大。将从YHX、N6、B5、MS悬浮培养基中收集的小细胞团和单细胞分别转入到浅层液体培养基中进行培养，5天后，转入固体诱导培养基进行愈伤组织的诱导。15天后，统计亚麻单倍体胚性愈伤组织的诱导率。浅层液体培养基1/2N6+0.5mg/L2.4—D。固体诱导培养基丄/2N6+2.4—D1.5mg/L+6—BA0.5mg/L表l不同培养基中胚性愈伤组织的诱导率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表1中的实验数据表明亚麻单倍体细胞悬浮培养基(YHX)胚性细胞的诱导率较高，经再生的愈伤组织结构紧密，成小球状，表面有小颗粒结构。权利要求1、亚麻单倍体细胞悬浮系培养基，其特征在于它由1/2N6大量元素、B5微量元素、维生素、氨基酸、植物激素、添加活性炭、蔗糖和溶剂合成，其每升培养基中按重量由1/2N6大量元素2186.1mg、B5微量元素15.8mg、盐酸硫胺素1～20mg、盐酸吡哆素1～10mg、脯氨酸100～300mg、谷氨酰胺100～500mg、活性炭10～50mg、2.4—D1.0mg、6—BA0.1mg、蔗糖20～40g和余量为蒸馏水合成。2、根据权利要求1所述的亚麻单倍体细胞悬浮系培养基，其特征在于1/2Ns大量元素成分按重量由硝酸钾1415mg、硫酸铵231mg、硫酸镁92mg、氯化钙83mg、磷酸二氢钾200mg、硫酸亚铁27.8mg、乙二胺四乙酸二钠37.3mg和肌醇100mg构成。3、根据权利要求1所述的亚麻单倍体细胞悬浮系培养基，其特征在于B5微量元素成分按重量由硫酸锰10mg、硼酸3mg、碘化钾0.75mg、硫酸锌2mg、硫酸铜O.025mg和氯化钴0.025mg构成。4、根据权利要求1所述的亚麻单倍体细胞悬浮系培养基，其特征在于活性炭的添加量为每升培养基30mg。5、根据权利要求1所述的亚麻单涪体细胞悬浮系培养基，其特征在于培养基的PH值为5.56.0。全文摘要亚麻单倍体细胞悬浮系培养基，它涉及亚麻单倍体细胞悬浮系培养基。它解决了N<sub>6</sub>、B<sub>5</sub>、MS悬浮培养基中的花粉愈伤组织分散性不好、单细胞数量少和细胞团的比重大的问题。本发明在其每升培养基中的浓度按重量由1/2N<sub>6</sub>大量元素2186.1mg、B<sub>5</sub>微量元素15.8mg、盐酸硫胺素1～20mg、盐酸吡哆素1～10mg、脯氨酸100～300mg、谷氨酰胺100～500mg、活性炭10～50mg、2.4-D1.0mg、6-BA0.1mg、蔗糖20～40g和余量为水合成；合成后培养基的pH值为5.5～6.0。本发明获得的单倍体胚性细胞色泽鲜黄、细胞分裂旺盛、分散性好和细胞团的比重小；能大幅度提高胚性愈伤组织诱导率，经再生的愈伤组织结构紧密，成小球状，表面有小颗粒结构。文档编号C12N5/04GK101531990SQ200910071778公开日2009年9月16日申请日期2009年4月15日优先权日2009年4月15日发明者宋淑敏申请人:黑龙江省科学院亚麻综合利用研究所