专利名称：一种降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种菌种的筛选方法。
背景技术：
煤化工企业排放的废水水质复杂，C0Dcr为2000 5000mg/L， B0D5/C0Dcr为0. 25 0. 4，总酚浓度为500 1200mg/L，挥发酚为150 300mg/L，氨氮为150 500mg/L，并含有少量的多环芳香族化合物、杂环化合物、石油烃和氰化物、硫化物等。在很多煤化工实际生产中产生的酚类物质可以占到总COD的一半以上，因此煤化工废水处理效果的关键就在于酚类物质的处理。煤化工废水中基本的酚类物质有苯酚，间苯二酚，邻苯二酚，对苯二酚，间甲基苯酚，对甲基苯酚，邻甲基苯酚，2-甲基-1 ， 3-苯二酚，3-甲基-1和2-苯二酚，其中邻甲基苯酚是最难被降解的物质之一。 目前降解邻甲基苯酚使用的生物强化法，通常采用单一的酚作为碳源直接从菌群中筛选高效降解菌种，由于碳源的单一性，导致此方式获得的菌株对煤化工废水中其他化学物质的抗性低，在实际的煤化工废水处理中，菌种的存活率低，无法实现菌种特有的降解性能，导致邻甲基苯酚的降解率低，仅为30. 5 51. 8%，影响出水效果。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有生物强化法筛选的菌株对煤化工废水中其他化学物质的抗性低，导致邻甲基苯酚的降解率低的问题，而提供一种降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法。 降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法按以下步骤实现一、取煤化工好氧段废水处理系统的污泥废水混合物，在34 36t:下曝气48 50h，然后按1 : 5的体积比将曝气后的污泥废水混合物接种于混合酚浓度为400mg/L的培养基中，在34 36。C下震荡培养18 24h后沉降30 40min，取上层菌液，然后向上层菌液中投加药剂，搅拌均匀后在34 36t:下震荡培养18 24h，得菌悬液a;二、按l : 20的体积比将菌悬液a接种于邻甲基苯酚浓度为200mg/L的筛选培养基中，然后在34 36。C下震荡培养18 24h，得培养物I;三、按1 : 20的体积比将培养物I接种于邻甲基苯酚浓度为400mg/L的筛选培养基中，然后在34 36t:下震荡培养18 24h，得培养物II;四、按l : 20的体积比将培养物II接种于邻甲基苯酚浓度为600mg/L的筛选培养基中，然后在34 36。C下震荡培养18 24h，得培养物III;五、按l : 20的体积比将培养物III接种于邻甲基苯酚浓度为800mg/L的筛选培养基中，然后在34 36。C下震荡培养18 24h，得培养物IV ;六、采用平板划线分离法将培养物IV接种于富集培养基上，在34 36t:下震荡培养18 24h，即得降解邻甲基苯酚菌种；其中步骤一中混合酚浓度为400mg/L的培养基为每升培养基中由0. 2gMgS04 H20、0. lgFeS04 H20、0. lgMnS04 H20、0. 2gCaCl2、0. 5gK2HP04、0. 5gNH2P04、0. 45g(NH4)2S04、0. lgNaCl、400mg混合酚和余量的蒸馏水组成，并调节pH至6. 9 7. 1，
混合酚由苯酚、甲基酚、二甲基苯酚和苯二酚按质量比30 : io : io : 25混合而成；步骤一中投加药剂的每升菌悬液a中有0. 1 0. 3g MgS04 H20、0. 05 0. lgFeS04 H20、0. 05 0. lg MnS04 H20、0. 1 0. 3g CaCl2、0. 4 0. 6g K2HP04、0. 4 0. 6gKH2P04、0. 4 0. 5g(NH4)2S04、0.05 0. lg NaCl和1. 5 2. 5g葡萄糖；步骤二中邻甲基苯酚浓度为200mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 1 0. 3gMgS04 H20、0. 05 0. lgFeS04 H20、0. 05 0. lgMnS04 H20、0. 1 0. 3gCaCl2、0. 4 0. 6gK2HP04、0. 4 0. 6gKH2P04、0. 4 0. 5g(NH4)2S04、0. 05 0. lgNaCl、200mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤三中邻甲基苯酚浓度为400mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 1 0. 3gMgS04 H20、0. 05 0. lgFeS04 H20、0. 05 0. lgMnS04 H20、0. 1 0. 3gCaCl2、0. 4 0. 6gK2HP04、0. 4 0. 6gKH2P04、0. 4 0. 5g (NH4) 2S04、0. 05 0. lgNaCl、400mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤四中邻甲基苯酚浓度为600mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 1 0. 3gMgS04 H20、0. 05 0. lgFeS04 H20、0. 05 0. lgMnS04. H20、0. 1 0. 3gCaCl2、0. 4 0. 6gK2HP04、0. 4 0. 6gKH2P04、0. 4 0. 5g (NH4) 2S04、0. 05 0. lgNaCl、600mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤五中邻甲基苯酚浓度为800mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 1 0. 3gMgS04 H20、0. 05 0. lgFeS04 H20、0. 05 0. lgMnS04 H20、0. 1 0. 3gCaCl2、0. 4 0. 6gK2HP04、0. 4 0. 6gKH2P04、0. 4 0. 5g (NH4) 2S04、0. 05 0. lgNaCl、800mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤六中富集培养基由1000mL蒸馏水、4. 5 5. 5g牛肉膏、9 llg蛋白膝、19 21g琼脂禾口 4. 5 5. 5gNaCl制成，并调节pH至7. 5 8. 0。
本发明中以多种酚作为碳源，针对邻甲基苯酚进行特定筛选，所以获得的菌株对煤化工废水中其他化学物质的抗性更强，具有针对邻甲基苯酚特定的高降解性能。本发明中所得降解邻甲基苯酚菌种是酚降解菌群中的一份子，所以在投加入反应系统后，能迅速适应变化的环境配合菌群中其他菌株的降解，从而增强了对邻甲基苯酚的降解率，改善了菌群的结构，提高整体的降解效果。本发明中所得降解邻甲基苯酚菌种，在24h内对浓度为800mg/L的邻甲基苯酚的降解率达到了 99. 8% ;在废水3600C0D mg/L、酚浓度850mg/L、氰化物浓度35mg/L、氨氮浓度150mg/L、 Ph值为7. 5时投加本发明中所得降解邻甲基苯酚菌种到反应器中，水力停留时间24h， 35 °C下降解率由原来的COD 35 % 、酚45 % 、氰化物45 % ，增加为C0D45 % 、酚65 % 、氰化物55 % 、氨氮50 % ，说明本发明中所得降解邻甲基苯酚的菌种不仅对邻甲基苯酚一种物质起到高效降解的作用，同时对其他酚、氰化物也具有降解的作用，且降解效果明显提高，不造成菌群的失调致使某种产物积累，菌种的存活率高，提高了整体的降解效果。本发明的筛选方法成本低廉，简单易行。
具体实施例方式
具体实施方式
一 本实施方式降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法按以下步骤实现一、取煤化工好氧段废水处理系统的污泥废水混合物，在34 36t:下曝气48 50h，然后按l : 5的体积比将曝气后的污泥废水混合物接种于混合酚浓度为400mg/L的培养基中，在34 36t:下震荡培养18 24h后沉降30 40min，取上层菌液，然后向上层菌液中投加药剂，搅拌均匀后在34 36t:下震荡培养18 24h，得菌悬液a;二、按l : 20的体积比将菌悬液a接种于邻甲基苯酚浓度为200mg/L的筛选培养基中，然后在34 36。C下震荡培养18 24h，得培养物I ;三、按1 : 20的体积比将培养物I接种于邻甲基苯酚浓度为400mg/L的筛选培养基中，然后在34 36t:下震荡培养18 24h，得培养物II;四、按l : 20的体积比将培养物II接种于邻甲基苯酚浓度为600mg/L的筛选培养基中，然后在34 36°C下震荡培养18 24h，得培养物I11 ;五、按1 : 20的体积比将培养物III接种于邻甲基苯酚浓度为800mg/L的筛选培养基中，然后在34 36"C下震荡培养18 24h，得培养物IV ;六、采用平板划线分离法将培养物IV接种于富集培养基上，在34 36t:下震荡培养18 24h，即得降解邻甲基苯酚菌种；其中步骤一中混合酚浓度为400mg/L的培养基为每升培养基中由0. 2gMgS04 *H20、0. lgFeS04 *H20、0. lgMnS04 *H20、0. 2gCaCl2、0. 5gK2HP04、0. 5gKH2P04、0. 45g(NH4)2S04、0. lgNaCl、400mg混合酚和余量的蒸馏水组成，并调节pH至6. 9 7. 1，
混合酚由苯酚、甲基酚、二甲基苯酚和苯二酚按质量比30 : io : io : 25混合而成；步
骤一中投加药剂的每升菌悬液a中有0. 1 0. 3gMgS04 H20、0. 05 0. lg FeS04 H20、0. 05 0. lg MnS04 *H20、0. 1 0. 3g CaCl2、0. 4 0. 6g K2HP04、0. 4 0. 6g KH2P04、0. 4 0. 5g(NH4)2S04、0.05 0. lg NaCl和1. 5 2. 5g葡萄糖；步骤二中邻甲基苯酚浓度为200mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 1 0. 3gMgS04 H20、0. 05 0. lgFeS04 H20、0. 05 0. lgMnS04 H20、0. 1 0. 3gCaCl2、0. 4 0. 6gK2HP04、0. 4 0. 6gKH2P04、0. 4 0. 5g(NH4)2S04、0. 05 0. lgNaCl、200mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤三中邻甲基苯酚浓度为400mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 1 0. 3gMgS04 H20、0. 05 0. lgFeS04 H20、0. 05 0. lgMnS04 H20、0. 1 0. 3gCaCl2、0. 4 0. 6gK2HP04、0. 4 0. 6gKH2P04、0. 4 0. 5g (NH4) 2S04、0. 05 0. lgNaCl、400mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤四中邻甲基苯酚浓度为600mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 1 0. 3gMgS04 H20、0. 05 0. lgFeS04 H20、0. 05 0. lgMnS04 H20、0. 1 0. 3gCaCl2、0. 4 0. 6gK2HP04、0. 4 0. 6gKH2P04、0. 4 0. 5g (NH4) 2S04、0. 05 0. lgNaCl、600mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤五中邻甲基苯酚浓度为800mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 1 0. 3gMgS04 H20、0. 05 0. lgFeS04 H20、0. 05 0. lgMnS04 H20、0. 1 0. 3gCaCl2、0. 4 0. 6gK2HP04、0. 4 0. 6gKH2P04、0. 4 0. 5g (NH4) 2S04、0. 05 0. lgNaCl、800mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤六中富集培养基由1000mL蒸馏水、4. 5 5. 5g牛肉膏、9 llg蛋白膝、19 21g琼脂禾口 4. 5 5. 5gNaCl制成，并调节pH至7. 5 8. 0。
本实施方式中取煤化工好氧段废水处理系统的污泥废水混合物，采取温度为35 4(TC;污泥废水混合物中废水水质通过色质联机测各种酚的比例为总酚75 90%、苯酚29 36%、二甲基苯酚9. 86%、多元酚25%、甲基酚10 15% (其中间甲基苯酚2 3%、对甲基苯酚2 3%、邻甲基苯酚6 9% )。 本实施方式中筛选所得降解邻甲基苯酚菌种，经鉴定为肠杆菌属。 本实施方式中筛选所得降解邻甲基苯酚菌种的最佳的固定材料为聚乙烯多孔填
料，其具有较高的漆酶产量，固定化后的降解邻甲基苯酚菌种在5(TC下也不会导致菌体严
重受损、漆酶机能变化，也不会经历一段菌体及漆酶受抑制降低再回复的过程，而是稳步升高。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一污泥废水混合物中废水水质COD为900 1500mg/L、总酚为800 1200mg/L、氨氮为150 200mg/L、油为10mg/L、氰化物为20 40mg/L、pH值为7. 5 8. 5。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一污泥废水混合物
6中废水水质C0D为1000 1400mg/L、总酚为900 1100mg/L、氨氮为160 180mg/L、油为10mg/L、氰化物为25 35mg/L、pH值为7. 8 8. 2。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一污泥废水混合物中废水水质COD为1200mg/L、总酚为1000mg/L、氨氮为170mg/L、油为10mg/L、氰化物为30mg/L、pH值为8。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一、二、三或四不同的是步骤一中投加药剂的每升菌悬液a中有0. 2g MgS04 H20、0. 08g FeS04 H20、0. 08gMnS04 H20、0. 2gCaCl2、0. 5g K2HP04、0. 5g KH2P04、0. 45g (NH4) 2S04、0. 08gNaCl和2g葡萄糖。其它步骤及参数与具体实施方式
一、二、三或四相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
五不同的是步骤二中邻甲基苯酚浓度为200mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 2gMgS04 H20、0. 08gFeS04 H20、0. 08gMnS04 H20、0. 2gCaCl2、0. 5gK2HP04、0. 4 0. 6gKH2P04、0. 45g (NH4) 2S04、0. 08gNaCl、200mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式
五相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
六不同的是步骤六中富集培养基由lOOOmL蒸馏水、5g牛肉膏、10g蛋白膝、20g琼脂和5gNaCl制成，并调节pH至7. 8。其它步骤及参数与具体实施方式
六相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
七不同的是步骤一、二、三、四、五和六中震荡培养的条件均为150 180r/min。其它步骤及参数与具体实施方式
七相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
七不同的是步骤一、二、三、四、五和六中震荡培养的条件均为170r/min。其它步骤及参数与具体实施方式
七相同。
具体实施方式
十本实施方式降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法按以下步骤实现一、取煤化工好氧段废水处理系统的污泥废水混合物，在34t:下曝气48h，然后按l : 5的体积比将曝气后的污泥废水混合物接种于混合酚浓度为400mg/L的培养基中，在34°CT震荡培养18h后沉降30min，取上层菌液，然后向上层菌液中投加药剂，搅拌均匀后在34°C下震荡培养18h，得菌悬液a;二、按l : 20的体积比将菌悬液a接种于邻甲基苯酚浓度为200mg/L的筛选培养基中，然后在34t:下震荡培养18h，得培养物I;三、按l : 20的体积比将培养物I接种于邻甲基苯酚浓度为400mg/L的筛选培养基中，然后在34t:下震荡培养18h，得培养物II;四、按l : 20的体积比将培养物II接种于邻甲基苯酚浓度为600mg/L的筛选培养基中，然后在34t:下震荡培养18h，得培养物III;五、按l : 20的体积比将培养物III接种于邻甲基苯酚浓度为800mg/L的筛选培养基中，然后在34t:下震荡培养18h，得培养物IV ;六、采用平板划线分离法将培养物IV接种于富集培养基上，在34t:下震荡培养18h，即得降解邻甲基苯酚菌种；其中步骤一中混合酚浓度为400mg/L的培养基为每升培养基中由O. 2gMgS04 H20、0. lgFeS04 H20、0. lgMnS04 H20、0. 2gCaCl2、0. 5gK2HP04、0. 5gKH2P04、0. 45g (NH4) 2S04、0. lgNaCl、400mg混合酚和余量的蒸馏水组成，并调节pH至6.9，混合酚由苯酚、甲基酚、二甲基苯酚和苯二酚按质量比30 : 10 : 10 : 25混合而成；步骤一中投加药剂的每升菌悬液a中有0. lg MgS04 *H20、0. 05g FeS04 *H20、0. 05gMnS04 H20、0. lg CaCl2、0. 4gK2HP04、0. 4g KH2P04、0. 4g (NH4) 2S04、0. 05g NaCl禾卩1. 5g葡萄糖；步骤二中邻甲基苯酚浓度为200mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. lgMgS04 *H20、0. 05 0. lgFeS04 *H20、0. 05gMnS04 *H20、0. lgCaCl2、0. 4gK2HP04、0. 4gKH2P04、0. 4g(NH4)2S04、 0. 05gNaCl、200mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤三中邻甲基苯酚浓度为400mg/ L的筛选培养基为每升培养基中由0. lgMgS04 H20、0. 05gFeS04 H20、0. 05gMnS04 H20、 0. lgCaCl2、0. 4gK2HP04、0. 4gKH2P04、0. 4g (NH4) 2S04、0. 05gNaCl、400mg邻甲基苯酚和余量 的蒸馏水组成；步骤四中邻甲基苯酚浓度为600mg/L的筛选培养基为每升培养基中由 0. lgMgS04 H20、0. 05gFeS04 H20、0. 05gMnS04 H20、0. lgCaCl2、0. 4gK2HP04、0. 4gKH2P04、 0. 4g (NH4) 2S04、 0. 05gNaCl 、 600mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤五中邻甲基苯 酚浓度为800mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. lgMgS04 H20、0. 05gFeS04 H20、 0. 05gMnS04 H20、0. lgCaCl2、0. 4gK2HP04、0. 4gKH2P04、0. 4g (NH4) 2S04、0. 05gNaCl、800mg邻甲 基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤六中富集培养基由lOOOmL蒸馏水、4. 5g牛肉膏、9g蛋白 膝、19g琼脂和4. 5gNaCl制成，并调节pH至7. 5。 本实施方式中的污泥废水混合物取自中煤龙华哈尔滨煤化工有限公司好氧段废 水处理系统。 本实施方式中筛选所得降解邻甲基苯酚菌种，经鉴定为肠杆菌属。 本实施方式中筛选所得降解邻甲基苯酚菌种，在24h内对浓度为800mg/L的邻甲
基苯酚的降解率达到了 99.8%。
具体实施方式
十一 本实施方式降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法按以下步骤实 现一、取煤化工好氧段废水处理系统的污泥废水混合物，在36t:下曝气50h，然后按l : 5 的体积比将曝气后的污泥废水混合物接种于混合酚浓度为400mg/L的培养基中，在36°CT 震荡培养24h后沉降40min，取上层菌液，然后向上层菌液中投加药剂，搅拌均匀后在36°C 下震荡培养24h，得菌悬液a;二、按l : 20的体积比将菌悬液a接种于邻甲基苯酚浓度为 200mg/L的筛选培养基中，然后在36t:下震荡培养24h，得培养物I;三、按l : 20的体积 比将培养物I接种于邻甲基苯酚浓度为400mg/L的筛选培养基中，然后在36t:下震荡培养 24h，得培养物I1 ;四、按1 : 20的体积比将培养物II接种于邻甲基苯酚浓度为600mg/L的 筛选培养基中，然后在36t:下震荡培养24h，得培养物III;五、按l : 20的体积比将培养 物III接种于邻甲基苯酚浓度为800mg/L的筛选培养基中，然后在36t:下震荡培养24h，得 培养物IV ;六、采用平板划线分离法将培养物IV接种于富集培养基上，在36t:下震荡培养 24h，即得降解邻甲基苯酚菌种；其中步骤一中混合酚浓度为400mg/L的培养基为每升培养 基中由0. 2gMgS04 *H20、0. lgFeS04 *H20、0. lgMnS04 *H20、0. 2gCaCl2、0. 5gK2HP04、0. 5gKH2P04、 0. 45g(NH4)2S04、0. lgNaCl、400mg混合酚和余量的蒸馏水组成，并调节pH至7. 1，混合酚
由苯酚、甲基酚、二甲基苯酚和苯二酚按质量比30 : io : io : 25混合而成；步骤一中
投加药剂的每升菌悬液a中有0. 3g MgS04 H20、0. lg FeS04 H20、0. lg MnS04 H20、0. 3g CaCl2、0. 6gK2HP04、0. 6g KH2P04、0. 5g(NH4)2S04、0. lg NaCl和2. 5g葡萄糖；步骤二中邻甲 基苯酚浓度为200mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 3gMgS04 H20、0. lgFeS04 H20、 0. lgMnS04 H20、0. 3gCaCl2、0. 6gK2HP04、0. 6gKH2P04、0. 5g (NH4) 2S04、0. lgNaCl、200mg邻 甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤三中邻甲基苯酚浓度为400mg/L的筛选培养基为每 升培养基中由0. 3gMgS04 H20、0. lgFeS04 H20、0. lgMnS04 H20、0. 3gCaCl2、0. 6gK2HP04、 0. 6gKH2P04、0. 5g(NH4)2S04、0. lgNaCl、400mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤四中邻 甲基苯酚浓度为600mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 3gMgS04 *H20、0. lgFeS04 *H20、0. lgMnS04 H20、0. 3gCaCl2、0. 6gK2HP04、0. 6gKH2P04、0. 5g (NH4) 2S04、0. lgNaCl、600mg邻甲基 苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤五中邻甲基苯酚浓度为800mg/L的筛选培养基为每升培养 基中由0. 3gMgS04 *H20、0. lgFeS04 *H20、0. lgMnS04 *H20、0. 3gCaCl2、0. 6gK2HP04、0. 6gKH2P04、 0. 5g(NH4)2S04、0. lgNaCl、800mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤六中富集培养基由 lOOOmL蒸馏水、5. 5g牛肉膏、llg蛋白膝、21g琼脂和5. 5gNaCl制成，并调节pH至8. 0。
本实施方式中的污泥废水混合物取自七台河宝泰隆煤化工股份有限公司好氧段 废水处理系统。 本实施方式中筛选所得降解邻甲基苯酚菌种，经鉴定为肠杆菌属。 本实施方式中筛选所得降解邻甲基苯酚菌种，在24h内对浓度为800mg/L的邻甲
基苯酚的降解率达到了 99.6%。
具体实施方式
十二 本实施方式降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法按以下步骤实 现一、取煤化工好氧段废水处理系统的污泥废水混合物，在35t:下曝气49h，然后按l : 5 的体积比将曝气后的污泥废水混合物接种于混合酚浓度为400mg/L的培养基中，在35°C 下震荡培养20h后沉降35min，取上层菌液，然后向上层菌液中投加药剂，搅拌均匀后在 35t:下震荡培养20h，得菌悬液a;二、按1 : 20的体积比将菌悬液a接种于邻甲基苯酚 浓度为200mg/L的筛选培养基中，然后在35t:下震荡培养20h，得培养物I;三、按l : 20 的体积比将培养物I接种于邻甲基苯酚浓度为400mg/L的筛选培养基中，然后在35t:下 震荡培养20h，得培养物II;四、按l : 20的体积比将培养物II接种于邻甲基苯酚浓度 为600mg/L的筛选培养基中，然后在35t:下震荡培养20h，得培养物I11 ;五、按1 : 20的 体积比将培养物III接种于邻甲基苯酚浓度为800mg/L的筛选培养基中，然后在35t:下 震荡培养20h，得培养物IV ;六、采用平板划线分离法将培养物IV接种于富集培养基上， 在35t:下震荡培养20h，即得降解邻甲基苯酚菌种；其中步骤一中混合酚浓度为400mg/L 的培养基为每升培养基中由0. 2gMgS04 H20、0. lgFeS04 H20、0. lgMnS04 H20、0. 2gCaCl2、 0. 5gK2HP04、0. 5gKH2P04、0. 45g (NH4) 2S04、0. lgNaCl、400mg混合酚和余量的蒸馏水组成，并调
节pH至7.o，混合酚由苯酚、甲基酚、二甲基苯酚和苯二酚按质量比30 : io : io : 25混
合而成；步骤一中投加药剂的每升菌悬液a中有0. 2g MgS04 ^20、0. 08g FeS04 ^20、0. 08g MnS04 H20、0. 2CaCl2、0. 5gK2HP04、0. 5g KH2P04、0. 45g(NH4)2S04、0. 08g NaCl和2g葡萄糖； 步骤二中邻甲基苯酚浓度为200mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 2gMgS04 H20、 0. 08gFeS04 H20、0. 08gMnS04 H20、0. 2gCaCl2、0. 5gK2HP04、0. 5gKH2P04、0. 45g (NH4) 2S04、 0. 08gNaCl、200mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤三中邻甲基苯酚浓度为400mg/ L的筛选培养基为每升培养基中由0. 2gMgS04 H20、0. 08gFeS04 H20、0. 08gMnS04 H20、 0. 2gCaCl2、0. 5gK2HP04、0. 5gKH2P04、0. 45g(NH4)2S04、0. 08gNaCl、400mg邻甲基苯酚和余量 的蒸馏水组成；步骤四中邻甲基苯酚浓度为600mg/L的筛选培养基为每升培养基中由 0. 2gMgS04 H20、0. 08gFeS04 H20、0. 08gMnS04 H20、0. 2gCaCl2、0. 5gK2HP04、0. 5gKH2P04、 0. 45g(NH4)2S04、0. 08gNaCl、600mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤五中邻甲基苯 酚浓度为800mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 2gMgS04 H20、0. 08gFeS04 H20、 0. 08gMnS04 *H20、0. 2gCaCl2、0. 5gK2HP04、0. 5gKH2P04、0. 45g (NH4) 2S04、0. 08gNaCl、800mg邻甲 基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤六中富集培养基由1000mL蒸馏水、5. Og牛肉膏、10g蛋白 膝、20g琼脂和5. OgNaCl制成，并调节pH至7. 8。
本实施方式中的污泥废水混合物取自黑龙江顺隆煤化工有限公司好氧段废水处 理系统。 本实施方式中筛选所得降解邻甲基苯酚菌种，经鉴定为肠杆菌属。 本实施方式中筛选所得降解邻甲基苯酚菌种，在24h内对浓度为800mg/L的邻甲
基苯酚的降解率达到了 99. 7%。
权利要求
一种降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法，其特征在于降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法按以下步骤实现一、取煤化工好氧段废水处理系统的污泥废水混合物，在34～36℃下曝气48～50h，然后按1∶5的体积比将曝气后的污泥废水混合物接种于混合酚浓度为400mg/L的培养基中，在34～36℃下震荡培养18～24h后沉降30～40min，取上层菌液，然后向上层菌液中投加药剂，搅拌均匀后在34～36℃下震荡培养18～24h，得菌悬液a；二、按1∶20的体积比将菌悬液a接种于邻甲基苯酚浓度为200mg/L的筛选培养基中，然后在34～36℃下震荡培养18～24h，得培养物I；三、按1∶20的体积比将培养物I接种于邻甲基苯酚浓度为400mg/L的筛选培养基中，然后在34～36℃下震荡培养18～24h，得培养物II；四、按1∶20的体积比将培养物II接种于邻甲基苯酚浓度为600mg/L的筛选培养基中，然后在34～36℃下震荡培养18～24h，得培养物III；五、按1∶20的体积比将培养物III接种于邻甲基苯酚浓度为800mg/L的筛选培养基中，然后在34～36℃下震荡培养18～24h，得培养物IV；六、采用平板划线分离法将培养物IV接种于富集培养基上，在34～36℃下震荡培养18～24h，即得降解邻甲基苯酚菌种；其中步骤一中混合酚浓度为400mg/L的培养基为每升培养基中由0.2gMgSO4·H2O、0.1gFeSO4·H2O、0.1gMnSO4·H2O、0.2gCaCl2、0.5gK2HPO4、0.5gKH2PO4、0.45g(NH4)2SO4、0.1gNaCl、400mg混合酚和余量的蒸馏水组成，并调节pH至6.9～7.1，混合酚由苯酚、甲基酚、二甲基苯酚和苯二酚按质量比30∶10∶10∶25混合而成；步骤一中投加药剂的每升菌悬液a中有0.1～0.3g MgSO4·H2O、0.05～0.1g FeSO4·H2O、0.05～0.1gMnSO4·H2O、0.1～0.3g CaCl2、0.4～0.6g K2HPO4、0.4～0.6g KH2PO4、0.4～0.5g(NH4)2SO4、0.05～0.1g NaCl和1.5～2.5g葡萄糖；步骤二中邻甲基苯酚浓度为200mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0.1～0.3gMgSO4·H2O、0.05～0.1gFeSO4·H2O、0.05～0.1gMnSO4·H2O、0.1～0.3gCaCl2、0.4～0.6gK2HPO4、0.4～0.6gKH2PO4、0.4～0.5g(NH4)2SO4、0.05～0.1gNaCl、200mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤三中邻甲基苯酚浓度为400mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0.1～0.3gMgSO4·H2O、0.05～0.1gFeSO4·H2O、0.05～0.1gMnSO4·H2O、0.1～0.3gCaCl2、0.4～0.6gK2HPO4、0.4～0.6gKH2PO4、0.4～0.5g(NH4)2SO4、0.05～0.1gNaCl、400mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤四中邻甲基苯酚浓度为600mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0.1～0.3gMgSO4·H2O、0.05～0.1gFeSO4·H2O、0.05～0.1gMnSO4·H2O、0.1～0.3gCaCl2、0.4～0.6gK2HPO4、0.4～0.6gKH2PO4、0.4～0.5g(NH4)2SO4、0.05～0.1gNaCl、600mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤五中邻甲基苯酚浓度为800mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0.1～0.3gMgSO4·H2O、0.05～0.1gFeSO4·H2O、0.05～0.1gMnSO4·H2O、0.1～0.3gCaCl2、0.4～0.6gK2HPO4、0.4～0.6gKH2PO4、0.4～0.5g(NH4)2SO4、0.05～0.1gNaCl、800mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成；步骤六中富集培养基由1000mL蒸馏水、4.5～5.5g牛肉膏、9～11g蛋白膝、19～21g琼脂和4.5～5.5gNaCl制成，并调节pH至7.5～8.0。
2. 根据权利要求1所述的一种降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法，其特征在于步骤一污泥废水混合物中废水水质COD为900 1500mg/L、总酚为800 1200mg/L、氨氮为150 200mg/L、油为10mg/L、氰化物为20 40mg/L、pH值为7. 5 8. 5。
3. 根据权利要求1所述的一种降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法，其特征在于步骤一污泥废水混合物中废水水质COD为1200mg/L、总酚为1000mg/L、氨氮为170mg/L、油为10mg/L、氰化物为30mg/L、 pH值为8。
4. 根据权利要求1、2或3所述的一种降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法，其特征在于步骤一中投加药剂的每升菌悬液a中有0. 2g MgS04 *H20、0. 08gFeS04 *H20、0. 08g MnS04 *H20、0. 2g CaCl2、0. 5g K2HP04、0. 5g KH2P04、0. 45g(NH4)2S04、0. 08g NaCl和2g葡萄糖。
5.根据权利要求4所述的一种降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法，其特征在于步骤二中邻甲基苯酚浓度为200mg/L的筛选培养基为每升培养基中由0. 2gMgS04 *H20、0. 08gFeS04 H20、0. 08gMnS04 H20、0. 2gCaCl2、0. 5gK2HP04、0. 4 0. 6gKH2P04、0. 45g(NH4)2S04、0. 08gNaCl、200mg邻甲基苯酚和余量的蒸馏水组成。
6. 根据权利要求5所述的一种降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法，其特征在于步骤六中富集培养基由lOOOmL蒸馏水、5g牛肉膏、10g蛋白膝、20g琼脂和5gNaCl制成，并调节pH至7. 8。
7. 根据权利要求6所述的一种降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法，其特征在于步骤一、二、三、四、五和六中震荡培养的条件均为150 180r/min。
全文摘要
一种降解邻甲基苯酚菌种的筛选方法，它涉及一种菌种的筛选方法。它解决了现有生物强化法筛选的菌株对煤化工废水中其他化学物质的抗性低，导致邻甲基苯酚的降解率低的问题。方法一、取污泥废水混合物曝气后接种并培养，沉降后取上层菌液，投加药剂，培养后得菌悬液a；二、将菌悬液a接种并筛选培养，得培养物I；三、将培养物I接种并筛选培养，得培养物II；四、将培养物II接种于并筛选培养，得培养物III；五、将培养物III接种并筛选培养，得培养物IV；六、将培养物IV接种并富集培养，即得降解邻甲基苯酚菌种。本发明获得的菌株对煤化工废水中其他化学物质的抗性更强，对浓度为800mg/L的邻甲基苯酚的降解率达到了99.8％。
文档编号C12Q1/04GK101760504SQ200910073100
公开日2010年6月30日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者方芳, 王伟, 韩洪军 申请人:哈尔滨工业大学