专利名称：：一种酿酒酵母、含有该酵母的酵母制剂、饲料、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种酿酒酵母、含有该酵母的酵母制剂、饲料、其制备方法及其用途，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：自从发现词用抗生素可以通过影响倡导微生物初期在宿主体内的定植，从而起到促进生长的作用之后，抗生素的应用在畜牧业方面产生了巨大的经济效益。但是由于抗生素的大量使用，随之出现的负面效应也日益突出，表现为病原微生物产生耐药性和药物在动物产品中残留，从而对人类的健康产生潜在的危害。因此，抗生素类替代品益生菌、酶制剂、酸制剂等的研究与开发成为近年来绿色饲料添加剂的热点，其中益生菌备受关注。作为益生菌的一种，酵母菌制剂在动物生产中的作用是畜牧业的科研和生产人员关注的焦点。所谓酵母伺料，是指利用酵母菌的新陈代谢和繁殖菌体，经过发酵和干燥等特殊工艺制成的含有活菌和酵母细胞代谢产物的安全、无污染、无残留的优质饲料，主要的酵母培养物(yeastcultures,简称YC)是一种含有酵母菌赖以生长的培养基经过酵母培养物转化的产品，它营养丰富，含有维生素，矿物质、消化酶、促生长因子和较齐全的氨基酸，适口性极好，是集营养保健为一体的生物活性添加剂。酵母培养物最早是用于反刍动物的蛋白质补充料。Lei和Stahl(2001)研究表明，酵母培养物可提高反刍动物对词料干物质、纤维素、半纤维素、蛋白质等有机物和磷的消化率，在饲料中添加酵母培养物可有效提高家畜对饲料粗蛋白质、粗纤维，、一物质、维生素等养分及能量的消化吸收;预防和治疗腹胀腹泻等消化不良症状;促进幼、病畜胃肠道发育，增强机体的免疫力和抗病力，提高家畜生产性能对反刍动物主要是提高泌乳性能和产肉性能。酵母类产品的开发利用已成为饲料工业一个活跃领域，但也存在一些亟待解决的问题如产品质量不稳定、消化率低和成本高等。因此，培养繁殖力强、抗杂菌能力强、能产生齐全氨基酸和较高消化酶的菌种以生产出产量高、质量稳定、在体温范围内具有较高活性的酵母类产品，以提高其利用率，同时改进工艺、降低生产成本、提高产品的市场竞争力以及对于畜牧业的发展和人类的健康都非常有意义。
发明内容本发明的第一个目的在于提供一种酿酒酵母，该酿酒酵培养繁殖力强、抗杂菌能力强、能产生齐全氨基酸和较高消化酶。本发明的第二个目的在于提供一种含有上述酿酒酵母的酿酒酵母制剂，该制剂能够替代现有的抗生素饲料，并具有抗病、促生长的作用。本发明的第三个目的在于提供含有上述酵母制剂的动物饲料，该饲料具有与抗生素饲料类似的功能，但无抗生素饲料的副作用。本发明的第四个目的在于提供上述酵母制剂、动物词料的制备方法，该方法工艺简单、生产成本低。本发明的第五个目的在于提供上述酿酒酵母、酵母制剂在制备动物饲料方面的用途。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种酿酒酵母(Saccharomycescervisiae)，S19,2006年3月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏中心登记入册编号CGMCCNo,1666。该酿酒酵母细胞为卵圆形、圆形或圆柱形，无鞭毛，不运动，真菌细胞，细胞壁不含纤维素，以葡聚糖、甘露聚糖等多糖为主，还含有蛋白质，脂类及几丁质等组分。酵母菌是一种结构简单的单细胞真核微生物，属真菌类。酵母菌呈卵圆形、圆形或圆柱形，个体大，蛋白质含量高；种类多，发酵底物范围广，易于培养；繁殖迅速，代谢旺盛且代谢产物很多。数千年前，酵母菌已被用于腌菜、酿酒和制面包，现代科技发展，使人们对酵母菌优良特征的认识更加深入，对其开发利用的热潮连绵不断。在畜牧业中，酵母菌的开发利用也不断深化，结合酵母菌的特征，开辟出各种应用途径。酵母菌分布广，在动物消化道中含有大量的酵母菌。研究表明，有些酵母菌可以在动物的消化道内存活，对动物有益生作用。因此，本发明从仔猪的消化道内的食糜及粪便中分离酵母菌，并研究其抗逆性能。本发明的酿酒酵母制剂为采用上述酿酒酵母在培养基中经过充分培养、发酵后的代谢产物与无机物混合，经后处理得到的。所述的培养、发酵包括将酿酒酵母接种于斜面培养基进行培养，得到的种子培养物再接种于液体培养基中培养。其中的斜面培养基为适合酵母培养的任何培养基，本领域技术人员都知晓何种培养基适合酵母培养。然而可以优选为麦芽汁斜面培养基，这里所述的麦芽汁斜面培养基理解为以麦芽汁为主要成分，并还有其它合适成分的斜面培养基，并非仅仅含有麦芽汁的斜面培养基。所述其它合适成分可以为现有技术任何适合酿酒酵母培养的其它成分，这为本领域技术人员所知晓，但是仍可进一步优选培养基的配方为麦芽汁粉1030g，葡萄糖粉220g,琼脂1030g，水5002000ml;优选为麦芽汁粉1525g，葡萄糖粉515g,琼脂1525g，水7001500ml;更优选麦芽汁粉20g，葡萄糖粉10g,琼脂20g，水1000ml。其中的液体培养基为适合酵母培养的任何培养基，本领域技术人员也知晓这种液体培养基，其中可优选麦芽汁斜面培养基，这里所述的麦芽汁斜面培养基理解为以麦芽汁为主要成分，并还有其它合适成分的斜面培养基，并非仅仅含有麦芽汁的斜面培养基。所述其它合适成分可以为现有技术任何适合酿酒酵母培养的其它成分，这为本领域技术人员所知晓，然而进一步优选的培养基配方为麦芽汁粉1030g，葡萄糖粉220g,水5002000ml;优选麦芽汁粉1525g，葡萄糖粉515g,水7001500ml;更优选麦芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，水1000ml。应用上述培养基，本领域技术人员一般都知晓具体培养过程，这里优选为上述液体培养基中培养在154(TC下，培养1096小时。其中的斜面接种优选在恒温箱中2530。C下培养3555小时。前面所述的无机物为本领域技术人员通常使用的能够作为饲料添加剂的无机物，本发明优选所述无机物为轻质碳酸钙、稻壳粉、麸皮粉、硅藻土、石粉中的一种或几种任意组合，更优选轻质碳酸钙。其中培养物与无机物的比例优选为1:0.51:10，进一步优选为1:11:5。所述的后处理为将培养液与无机物的混合物干燥、粉碎并制粒。这里所述的后处理方法为本领域常用处理方法，无需本领域技术人员再付出创造性劳动。本发明的动物饲料包括常用动物饲料和本发明的酵母制剂。其中酵母制剂的含量至少为0.001%，优选为0.0013%，更优选0.01%2%，最优选0.05%0.2%。本发明的酵母制剂可以同目前市面上任何常用动物词料进行配合，即本发明所述动物饲料保护范围不为配合的常用动物饲料种类所限制。然而其中的常用动物词料可优选为日粮，进一步优选为猪用日粮、鸡用日粮、反刍动物用日粮和水产动物用日粮。对于不同的动物，其日粮的配方各不相同，但是，现有技术中公开的任何日粮都可以作为本发明的动物词料，其配方都是该领域的公知常识。本发明的酿酒酵母、酵母制剂可以作为添加剂用于制备动物饲料，其中的动物包括但不限于猪、牛、羊、鸡等各种动物，优选作为猪。本发明的酿酒酵母及其酿酒酵母制剂主要作为动物的饲料添加剂，其可以替代现有动物日粮中的抗生素，改善消化道微生物区系、能刺激肠道内有效微生物的增生，提供营养因子、促进营养物的消化吸收、降低腹泻、促进动物的生长、提高断奶仔猪的生产性能。本发明的酿酒酵母及其酿酒酵母制剂对防治动物消化系统疾病起到保健作用，同时对幼年动物可刺激其胃肠道发育，所以将之作为饲料添加剂应用在饲料中能起到抗病促生长的作用。同时，本发明的酿酒酵母及其酿酒酵母制剂无耐药性和药物在动物产品中残留从而对人类的健康产生潜在的危害的可能，是一种有前途的绿色饲料添加剂。下面结合具体实施例详细描述本发明，所述实施利用与理解而不是限制本发明。保藏说明菌种名称酿酒酵母拉丁名Saccharomycescervisiae保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京朝阳区大屯路甲3号保藏日期2006年3月29日保藏中心登记入册编号CGMCCNo.166图1为S19菌种的发酵生长曲线；图2为pH对S19菌株生长的影响；图3为发酵温度对S19菌株生长影响；图4为用平皿挖沟法测定乳酸杆菌培养物对大肠杆菌的抑制示意图。具体实施例方式实施例l本发明的酿酒酵母是从猪粪便中提取、分离、筛选、纯化得到的。1.1试验材料从北京、内蒙古、福建、江西、广东、湖南、山东、河南、河北等猪场取健康仔猪粪便，液氮冷冻后，运回北京，于低温冰箱(85°C)保存。1.2培养基1.2.1麦芽汁培养基麦芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，水1000mL。1.2.2麦芽汁琼脂培养基麦芽汁粉20g,葡萄糖粉IOg，琼脂20g，水IOOOmL。1.2.3酵母菌富集培养基蛋白胨0.5g、酵母膏0.5g、蔗糖2.Og、可溶性淀粉1.0g、MgS040.001g、ZnS040.04g、CuS040.005g、KH2P040,2g、蒸馏水100mL(灭菌冷冻到50。C)加氨青霉素浓度为lu/mL，或1%链霉素0.6mL。1.3耐酸性能选育制备pH2.1的麦芽汁培养基，接种已培养24h的酵母菌，接种量1%，于28'C培养24h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐酸。然后镜检看是否染菌。能够生长的酵母菌的最初分离样品保存在-85'C冰箱备用。1.4耐胆盐性能选育制备含猪胆盐0.3%的麦芽汁培养基，接种已培养24h的酵母菌，接种量1%，于28。C培养24h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐胆盐。然后镜检看是否染菌。能够生长的酵母菌的最初分离样品保存在-85'C冰箱备用。1.5耐高铜性能选育制备含有0.1%五水硫酸铜的麦芽汁培养基，接种已培养24h的酵母菌，接种量1%，于28'C培养24h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐高铜。然后镜检看是否染菌。能够生长的酵母菌的最初分离样品保存在-85'C冰箱备用。1.6耐高锌性能选育制备含有1%氧化锌的麦芽汁培养基，接种已培养24h的酵母菌，接种量1%，于28'C培养24h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐高锌。然后镜检看是否染菌。能够生长的酵母菌的最初分离样品保存在-85'C冰箱备用2.结果与讨论2.1酵母菌的分离本试验从59个粪样当中筛选出786个酵母菌种。有的粪样直接用麦芽汁培养基筛选不到酵母菌，在这种情况下，本试验先用富营养培养基培养24h，然后再进行筛选。菌种的筛选是及其烦琐的过程。大多数乳酸菌的选育过程是从消化道上皮分离益生菌，这样便可已获得具有良好定植效果的菌种。由于目前的研究结果认为，酵母菌是动物消化道的路过菌，不会在消化道上皮定植，因此，本试验直接从动物的粪便中分离酵母菌，以期获得具有益生作用的菌种。2.2耐酸性能选育通过耐酸性能选育，有573株酵母可以在pH2.1的麦芽汁培养基中生长繁殖，淘汰率为27%。这说明粪便中的大多数酵母菌耐酸性能较好，有73%的可以在仔猪的胃中进行繁殖。路过菌如果要发生益生作用往往是通过产生具有抗菌作用的物质或产生大量的菌体以排斥其他有害菌的生长。因此，如果菌种对胃酸没有耐受性很难对动物的生产性能产生良好的作用。2.3耐胆盐性能选育将通过耐酸性能选育的573株酵母进行耐酸性能选育，有287株酵母可以在含胆盐0.3%的麦芽汁培养基中生长繁殖，淘汰率为50%。研究表明，酵母菌的耐胆盐性能比耐酸性能好一些。有研究表明，乳酸菌的耐胆盐性能是可以驯化的，乳酸杆菌容易对胆盐产生耐受性，且具有一定的遗传性(Chou和Weimer，1999)。然而，酵母菌在这方面的报道较少。2.4耐高铜性能选育将通过耐胆盐性能选育的287株酵母进行耐高铜性能选育，有238株酵母可以在含胆盐0.3%的麦芽汁培养基中生长繁殖，淘汰率为17%。由于酵母菌本身具有耐受和吸附重金属离子的特性，其对高铜的抗逆性是较强的。由于高铜日粮具有促生长的作用，目前我国比较普遍使用的日粮，因此选择具有耐高铜的酵母菌是极其必要的。2.5耐高锌性能选育将通过耐高铜性能选育的238株酵母进行耐高锌性能选育，有63株酵母可以在200910076559.1说明书第7/22页含胆盐0.3%的麦芽汁培养基中生长繁殖，淘汰率为74%。高锌具有防止腹泻、促进生长的作用，因此在我国利用氧化锌来配制仔猪饲料，尤其是断奶仔猪饲料的厂家很多。从本试验的结果来看高锌对酵母菌的杀伤力要高于高铜。3.小结通过本试验获得63株来源于仔猪粪便，对消化道内环境有一定抵抗能力的酵母菌，这为以后的选种工作打下了基础。一种酿酒酵母(Saccharomycescervisiae),S19，2006年3月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号CGMCCNo.1666。该酿酒酵母细胞为卵圆形、圆形或圆柱形，无鞭毛，不运动，真菌细胞，细胞壁不含纤维素，以葡聚糖、甘露聚糖等多糖为主，还含有蛋白质，脂类及几丁质等组分。实施例2酵母菌S19生物学特性的研究1.材料与方法1.1菌种由本实验室筛选出的S19酵母菌。1.2培养基1.2.1麦芽汁培养基麦芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，水1000mL。1.2.2麦芽汁琼脂培养基麦芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，琼脂20g，水1000mL。1.2.3酵母菌培养基葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母膏1%、微量元素1%、琼脂2%。1.2.4其他培养基豆芽汁培养液、糖发酵基础培养基、碳源同化基础培养基、氮源同化基础培养基、无维生素基础培养基、产类淀粉化合物培养基、查氏培养基等，按现有技术方法制备。1.2.5菌种的特性1.2.5.1生物学特性S19菌接种于新鲜豆芽汁平板上，置28'C培养48h，取新鲜培养物进行涂片，革兰氏染色，显微镜观察，记录菌体的形态、大小和出芽方式。取S19菌接种于豆芽汁液体培养基，28'C培养48h后观察生长表现。取S19菌划线于新鲜豆芽汁平板，普通琼脂平板，血琼脂平板于28'C培养48h，记录结果。假菌丝的形成(Dalmau平板法)。取融化并保温在50。C左右的马铃薯浸汁琼脂斜面培养基倒入无菌培养基平皿中，使凝成平板。将平皿倒置数小时使表面稍干，取28。C培养48h的S19菌少许分别在平板上划线接种23条(拉开距离)。在其上盖上灭菌盖玻片(75%酒精浸泡灭菌，火焰烤干，待盖玻片冷却后盖上)，轻压挤出空气，使造成厌氧环境。28'C培养35d后，用低倍镜观察假菌丝的生长状况。1.2.5.2生理生化试验(1)糖发酵试验采用半固体法，按参考文献[3]的方法制备。配制后装入小试管做成半固体琼脂培养基，于1.7X105Pa灭菌30min。灭菌后，取出小试管，待温度冷却至56'C时，每管加入0.1mL菌悬液，摇匀，迅速冷却，使琼脂凝固。28'C培养l2周，记录结果。结果依下述原则描述"+"表示发酵，培养基由紫色变黄；"_"表示不发酵，培养基不变色。(2)其他生理生化试验①碳源同化试验。试验采用生长谱法(auxanographicmethod)[1-2]。取每管装有20mL碳源同化基础培养基的试管，灭菌并冷却至56'C，每管加lmL菌悬液，充分摇匀，制成平板，凝固后于28'C倒置几个小时，使表面稍干，在平板底部分区并标上碳源标记。用无菌不锈钢匙按标记于平板表面加碳源少许，28'C下培养l2d，观察结果。以葡萄糖区和空白区作对照，能同化的则在碳源周围形成生长圈，为阳性，记为"+"。有时为了避免临近不同碳源的干扰，在不同碳源的分区交界之间用小钢铲铲开一狭沟(平板中心不开沟)。②氮源同化试验。采用氮源同化基础培养基，其方法同碳源同化。在加氮源时，把少量所测氮源化合物点在平板上，如是亚硝酸盐，则用接种针尖蘸取它的潮解液点在平板上，以避免浓度过量而抑制菌的生长。以硫酸铵和空白区作对照，记录结果。阳性反应者在所加试剂处或周围有菌落生长，记为"+"。③类淀粉化合物的测定。某些菌在一定的基质上能形成胞外类淀粉多糖化合物，该化合物遇碘呈蓝色反应。将28'C培养48h的S19菌接种于产类淀粉化合物的培养液中，28'C培养3周，加路哥氏碘液(Lugol，s)l2滴，如颜色变为蓝色，表示阳性,记为"+"。石蕊牛乳试验。将28'C培养48h的S19菌分别接种于石蕊牛奶培养基，28'C下培养24周，观察牛奶颜色的变化,以及是否凝固或胨化，并记录结果。⑤耐高渗透压的测试。取28'C培养48h的S19菌分别接种于含50%和60%D-葡萄糖酵母膏琼脂斜面，用蜡纸封口以防干燥，置28'C培养12周后，观察生长与否。◎尿素分解试验。有些菌能产生脲酶，可分解尿素形成大量的氨，使培养基pH值升高，从而使酚红指示剂呈红色。取28'C培养48h的S19菌分别接种于水解尿素试验的琼脂斜面上，28。C培养57d，每天观察结果。如琼脂斜面变为红色，表示阳性,记为"+"。⑦无维生素培养基生长试验。无维生素培养基生长试验目的是测定菌体本身是否能合成它生长所需的全部维生素。取28'C培养48h的S19菌接种于无维生素的培养液中，28i:下培养l2周，以不接菌的无维生素培养基作对照，观察生长情况。为了防止造成假象，可将上述试验中的菌液再接种1次，培养2周后观察结果。在无维生素培养基中能生长者，表示它自身能合成生长所需的全部维生素,液体变混浊表示阳性，记为"+"。⑧37'C生长试验。取28。C培养48h的S19菌分别接种于豆芽汁琼脂斜面，置37°C下培养34d，观察结果。如生长表示阳性，记为"+"。1.3发酵试验1.3.1生长曲线测定将活化的S19菌种液体种子以0.5M(v/v)的接种量接种于麦芽汁培养基中，培养温度3rC，摇床转速为120rmin-l，定期采用稀释平板计数法测定活菌数。1.3.2最优发酵pH测定将活化的S19菌种液体种子以0.5%(v/v)的接种量接种于麦芽汁培养基中(pH28)，培养温度31。C，摇床转速为120r，min-1，于发酵28h采用稀释平板计数法测定活菌数。1.3.3最优发酵温度测定将活化的S19菌种液体种子以0.5%(v/v)的接种量接种于麦芽汁培养基中(pH6)，培养温度2(TC50。C,摇床转速为120rmin-1，于发酵28h采用稀释平板计数法测定活菌数。2.结果与讨论2.1S19酵母菌的生物学特性28。C培养48h后，在豆芽汁琼脂平板上，S19为直径23mm，白色，圆形，中央隆起，边缘整齐，不透明，表面干燥，有皱褶，中等大小的菌落。在豆芽汁液11体培养基中，S19菌液体稍浑浊，无沉淀，表面形成松散菌膜，细菌沿管壁匐行。在普通琼脂平板和血琼脂平板上均生长不良，且在血琼脂平板上均不溶血。S19菌的染色、形态、大小、繁殖方式与假菌丝的形成见表1。表1S19的生物学特性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.2S19酵母菌的生理生化试验结果S19酵母菌生理试验结果见表2。表2酵母菌生理试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>综合上述试验结果，依据《酵母菌的特征与鉴定手册》、《微生物学实验手册》和《菌种保藏手册》中的有关描述，S19菌为酿酒酵母(Saccharomycoscerevisiae)。到目前为止，所发现的酵母种已超过500种(分属于60多属)。在酵母属的区分中，主要根据其形态学特征(细胞形态、培养特征、能否产生子囊孢子及假菌丝)，并结合少量生理生化特性。由于酵母形态比较简单，缺乏明显的细胞分化，对于种的划分主要依靠生理生化特性，其中以糖的发酵和同化为最重要。在酵母菌糖发酵试验中，常采用杜氏管法和艾氏管法，根据管中的产气量进行判断结果。而在本试验中,采用了半固体琼脂法。以酵母菌标准菌株(产朊假丝酵母，由西北农林科技大学资源环境学院微生物实验室提供)作对照，根据发酵培养基的变色和有无气体的产生来判断结果，克服了杜氏管法和艾氏管法中的一些缺点。在酵母菌的同化试验中，最常用的试验方法是液体培养试管法和生长谱法。在碳源同化试验中，一些糖类在液体培养试管法中易造成假阳性结果，故采用生长谱法；在氮源同化试验中，由于有些氮源化合物被酵母菌同化分解后的中间产物对酵母菌本身的生长有抑制作用，在液体培养试管法中常出现假阴性反应，因此，在本试验氮源同化过程中也采用了生长谱法。2.3发酵试验2.3.1S19菌株的生长曲线S19菌种的发酵生长曲线见图1。生长曲线反映该菌的生长规律，作为一个生长菌种必须具有较短的迟滞期和较长的生长稳定期。最初l12h为迟滞期，1228h为对数生长期，芽率较高，30h后进入稳定期，45h后进入衰亡期，此时菌体死亡较多，活菌数较少，并出现菌体自溶现象。2.3.2S19菌株的发酵最优pHpH对S19菌株生长的影响见图2。S19在pH值28的范围内都能生长，pH值为56时生长状态最好，菌数最多，镜检时菌体形态规则，出芽率高。因此，在发酵过程中，起始pH应调至5.5左右。2.3.3S19菌株的发酵最优温度发酵温度对S19菌株生长影响见图3。可以看出发酵温度在2535'C之间菌种生长较好，在253(TC培养时活菌数最高。考虑到其他发酵因素的影响，发酵温度应在28°C。3小结通过S19菌种的生物学特性和生理生化试验初步判定为酿酒酵母。其最适发酵温度、时间和pH分别为28。C、24h和5.5。实施例3将实施例l得到的酿酒酵母(Saccharomycescervisiae),S19,CGMCCNo.1666接种于麦芽汁斜面培养基，培养基的配方为麦芽汁粉20g，葡萄糖粉10g,琼脂20g，水1000ml，在恒温箱中25'C下培养55小时，得到种子培养物，将该种子培养物接种于麦芽汁液体培养基中，麦芽汁液体培养基配方为麦芽汁粉20g,葡萄糖粉10g,水1000ml，在30'C下培养30小时，得到的培养物与轻质碳酸钙按照l:5的比例混合，经干燥、粉碎得到酿酒酵母制剂。将上述酵母制剂同常见猪饲料混合，譬如糠麸类饲料、饼粕类饲料、糟渣类饲料、粮食类饲料、动物性词料、青绿饲料等。其中酵母制剂含量为O.1%，用于猪用日粮。实施例4将实施例l得到的酿酒酵母(Saccharomycescervisiae)，S19，CGMCCNo.1666接种于麦芽汁斜面培养基，培养基的配方为麦芽汁粉30g，葡萄糖粉20g,琼脂10g，水2000ml，在恒温箱中30'C下培养35小时，得到种子培养物，将该种子培养物接种于麦芽汁液体培养基中，麦芽汁液体培养基配方为麦芽汁粉25g，葡萄糖粉15g，水1500ml，在15'C下培养96小时，得到的培养物与稻壳粉按照l:0.5的比例混合，经干燥得到酿酒酵母制剂。将上述酵母制剂同常用家禽饲料混合，譬如碳水化合物类饲料、蛋白质类饲料、青绿饲料等。其中酵母制剂含量为0.2%，用于鸡用日粮。实施例5将实施例l得到的酿酒酵母(Saccharomycescervisiae),S19，CGMCCNo.1666接种于麦芽汁斜面培养基，培养基的配方为麦芽汁粉10g,葡萄糖粉3g,琼脂15g，水800ml，在恒温箱中27'C下培养35小时，得到种子培养物，将该种子培养物接种于麦芽汁液体培养基中，麦芽汁液体培养基配方为麦芽汁粉10g,葡萄糖粉2g，水500ml，在4(TC下培养IO小时，得到的培养物与麸皮粉按照l:IO的比例混合，经干燥得到酿酒酵母制剂。将上述酵母制剂同各种羊饲料混合，譬如青贮饲料、干草饲料、秸秆类饲料、精细饲料类等。其中酵母制剂含量为2%，用于羊用日粮。实施例6将实施例1得到的酿酒酵母(Saccharomycescervisiae),S19，CGMCCNo.1666接种于麦芽汁斜面培养基，培养基的配方为麦芽汁粉25g，葡萄糖粉15g，琼脂25g，水1300ml，在恒温箱中28'C下培养45小时，得到种子培养物，将该种子培养物接种于麦芽汁液体培养基中，麦芽汁液体培养基配方为麦芽汁粉25g，葡萄糖粉15g，水1600ml，在22'C下培养48小时，得到的培养物与硅藻土按照1:8的比例混合，经干燥、制粒得到酿酒酵母制剂。将上述酵母制剂同常用鱼类饲料混合，其中酵母制剂含量为0.01%，用于鱼用日粮。实施例7将实施例l得到的酿酒酵母(Saccha，ycescervisiae)，S19，CGMCCNo.1666接种于麦芽汁斜面培养基，培养基的配方为麦芽汁粉15g，葡萄糖粉2g，琼脂15g，水800ml，在恒温箱中26。C下培养40小时，得到种子培养物，将该种子培养物接种于麦芽汁液体培养基中，麦芽汁液体培养基配方为麦芽汁粉15g，葡萄糖粉5g，水700ml，在22'C下培养50小时，得到的培养物与石粉按照l:7的比例混合，经干燥、制粒得到酿酒酵母制剂。将上述酵母制剂同常用牛饲料混合，其中酵母制剂含量为3%，用于牛用日粮。实验例l酿酒酵母对仔猪生产性能和消化道微生物区系的影响。1.l材料与方法实验动物选取20日龄断奶的壮长大三元杂种仔猪180头，平均体重7.56±0.52(断奶后在哺乳舍饲养料7天，饲养教槽料)，按体重随机区组分为5个处理组，每组六个重复，每个重复六头仔猪。1.2酿酒酵母制剂，采用实施例25的酿酒酵母制剂，每克样品中含有109个酵母。1.3饲养管理试验于国家饲料工程技术研究中心实验猪场进行。实验动物饲养于封闭、半漏缝地板式猪舍，每个重复饲养予一栏，自由采食，饮水。按常规免疫程序饲养管理。于每天7:00;12:00;4:30测定温度、相对湿度，晚间250w红外线灯泡保温(悬挂，高出创面70厘米)。试验期21天。根据黄霉素和酿酒酵母制剂的添加水平设计五种日粮，分别是基础日粮、基础日粮+10mg/kg，基础日粮+0.05%酿酒酵母制剂，基础日粮+0.1%酿酒酵母制剂，基础日粮+0.15%酿酒酵母制剂。酿酒酵母制剂可以直接加到基础日粮中混合喂食，也可以单独喂食；酿酒酵母制剂采用实施例3的产品。基础日粮的组成及营养水平见表4:表4基础日粮的组成及营养水平原料配方(%)营养成分营养水平玉米54DE34401cal/kg膨化全脂大豆14Cp(%)20.50带皮豆粕14Lys赖氨酸(％)1.40秘鲁鱼粉4Met蛋氨酸(%)0.38SDPP-13M+C(%)0.77低蛋白乳清粉6.7Ca%0.82大豆油1P(%)0.66石粉0.88TP%0.50磷酸二氢钙1.1Salt%0.51^"盐0.1赖氨酸0.19蛋氨酸0.03复合预混料1总计100.001.4测定指标试于0d，10d，21d早晨空腹称重一次，及酸品均日增重，品均料肉比，全期腹泻率。实验结束时，对照组、抗生素组和酿酒酵母制剂2的每个重复随机取1投仔猪，宰杀后取十二指肠、空肠和回肠食糜，与-8(TC冷冻保存，待测。大肠杆菌用麦康凯培养基计数，酵母军用麦芽汁培养基计数，乳酸菌用MRS滚管法计数。1.5统计分析测定结果利用SAS软件采用GLM程序进行统计分析，并进行Duncun(Duncun需要解释一下，前面两个比较通用，Duncun不熟悉，可能会公开不充分)多重比较。2.结果与讨论饲料中添加不同水平的酿酒酵母制剂对断奶仔猪生产性能的影响见表5。实验结果表明，日粮中添加黄霉素可以显著提高断奶仔猪前期的日增重(ADG，P<0.05)，抗生素组的仔猪平均日增重较对照组提高了8%，而黄霉素组对断奶仔猪的料肉比(F/g)没有显著影响(P>0.05)。断奶仔猪日粮中添加酿酒酵母可以显著提高断奶仔猪前期的日增重(P<0.05)，酿酒酵母组l的仔猪平均日增重(ADG)较对照组提高了8%，酿酒酵母组2较对照组提高了12%,酿酒酵母组3与对照组没有显著性影响(P〉0.05)。抗生素和酿酒酵母对仔猪生产性能的影响没有显著性差异(P〉0.05)。在试验后期，虽然抗生素和酿酒酵母对仔猪生产性能有影响，但是没有统计学上的差异(P〉0.05)。16日粮中添加抗生素可以降低断奶仔猪腹泻率(P<0.05)，日粮中添加酿酒酵母也可以降低端奶仔猪腹泻率(P<0.05)。酿酒酵母组l对仔猪腹泻的防治效果要好于抗生素(P<0.05=，其他组无显著性差异(P>0.05)。表5词料中添加不同水平的酿酒酵母制剂对断奶仔猪生产性能的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>其中F/G为料肉比。饲料中添加不同水平的酿酒酵母制剂对断奶仔猪粪便微生态区系的影响见表6。可以看出，饲料中添加酿酒酵母后，可以明显改变消化道区微生态区系(P<0.05)。添加酿酒酵母制剂后，在仔猪十二指肠、空肠和回肠食糜中酵母菌的检出数量较抗生素组和对照组显著提高(P<0.01)。添加抗生素和酿酒酵母制剂显著提高十二指肠、空肠和回肠食糜中乳酸菌的检出数量(P<0.05)。同时，大肠杆菌的检出数量显著降低(P<0.05)这表明，酿酒酵母制剂和抗生素一样通过改变消化道区微生态区系，使之有利于仔猪的消化道健康，从而达到提高动物生产性能的目的。表6饲料中添加的酿酒酵母制剂对断奶仔消化道微生态区系的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>对于动物词料中常用的其他抗生素，维吉尼霉素、恩3立霉素、泰乐菌素、土霉素或金霉素也分别进行了上述实验，同样发现，在饲料中添加本发明的酿酒酵母制剂后，抗生素和酿酒酵母对仔猪生产性能的影响没有显著性差异(P>0.05)，酿酒酵母对仔猪腹泻的防治效果要好于抗生素(P<0.05);添加本发明的酿酒酵母制剂后，在仔猪十二指肠、空肠和回肠食糜中酵母菌、乳酸菌的检出数量较抗生素组和对照组显著提高(P<0.01);大肠杆菌的检出数量显著降低(P<0.05)。实验例2本试验使用实施例25的酿酒酵母分别以0.1%和0.05%添加到肉鸡日粮中，与正对照(使用抗生素)和负对照(不使用抗生素)进行对比试验，进一步验证酿酒酵母对肉鸡生产性能及其在肉鸡生产中的适宜添加量。1、材料与方法1.1试验动物与设计试验选用1日龄健康肉鸡雏480羽，公母各半按体重随机分成4个处理。处理A为正对照组(使用抗生素)；处理B为负对照(不使用抗生素)；处理D为0.10X酿酒酵母组；处理E为0.05X酿酒酵母组。具体试验设计见表7。1.2饲养管理试验山东进行。试验鸡采用网上平养方式，家用煤炉供暖。自由采食和饮水。03曰龄光照时间为24h/d，4日龄到出栏光照时间为23h/d。按照公司现行肉鸡免疫程序接种疫苗，除进鸡雏前后三天外，每天两次带鸡消毒。1.3试验日粮配制各组试验日粮均按照《鸡饲养标准》2004配制，日粮组成及营养成分见表7。表7:试验设计处理基础日粮添加剂及添加量处理重复数重复鸡数备注A白羽鸡日粮抗生素620正对照B白羽鸡日粮空白620负对照D白羽鸡日粮0.1%添加酿酒酵母620试验组E白羽鸡日粮0.05%添加酿酒酵母620试验组1.4测量指标鸡群在l、21、42、49日龄以栏为单位对试验鸡进行称重，在21、42、49日龄以栏为单位记录耗料量和鸡只的死淘数，并计算平均日增重、平均日采食量和料肉比。181.5统计分析所有数据采用ExceL和SAS软件进行统计分析。2、试验结果2.1酿酒酵母对肉鸡生产性能的影响分别对肉鸡生长过程中的各个阶段和全程的生产性能数据进行数理统计，观察鸡在各个阶段的生长情况，进而分析日粮中添加酿酒酵母对肉鸡生长性能的影响，酿酒酵母不同添加量对肉鸡的影响及酿酒酵母作为抗生素替代品在肉鸡生产中应用的可能性。肉鸡各个不同生长阶段生产性能的结果见表8。表8试验基础日粮组成及营养水平<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*预混料为每公斤全价料提供维生素A，14400IU;维生素D，1800IU;维生素E，20mg;维生素K,1.5mg;维生素B〃2.25mg;维生素B2，9mg;泛酸钙，15mg;烟酸，30mg;维生素B6，3mg;维生素Bu，0.025mg;叶酸，0.75;胆碱，雨Omg;Mn，60mg;Zn，40mg;Fe，80mg;Cu，8mg;1,0.35;Se,0.15mg。从表9可以看出，在前21天，酿酒酵母组肉鸡的平均日增重与对照组没有显著差异(p>0.05)，酿酒酵母组间亦没有显著差异(p>0.05);在平均日采食量方面，E组(含0.05%酿酒酵母)肉鸡显著低于对照组和D组(含0.10%酿酒酵母)(p<0.05);E组(含0.05%酿酒酵母)的料肉比显著低于对照组和D组(含0.10%酿酒酵母)(p<0.05)。在成活率方面，E组(含0.05%酿酒酵母)略高于其他几组但差异不显著(p>0.05)。在前42天，酿酒酵母组肉鸡的平均日增重显著高于对照组(p<0.05)，料肉比显著低于对照组(p<0.05)，而两个酿酒酵母组间差异不显著(p>0.05);平均日采食量各组间没有显著差异(p>0.05)。成活率方面，A纟卩.(抗生素组)略低于其他二组，但差异不显著(p>0.05)。从整个试验来看，酿酒酵母组肉鸡的平均日增重显著高于对照组(p<0.05)，料肉比显著低于对照组(p<0.05);D组(含0.10%酿酒酵母)肉鸡的平均日增重高于E组(含0.05%酿酒酵母)，但差异不显著(p>0.05);在料肉比上E组(含0.10%酿酒酵母)略好于D组(含0.05%酿酒酵母)，但差异不显著(p>0.05)。A组(抗生素组)的平均日增重和料肉比两项指标略好于B组(空白组)，但差异不显著(p〉0.05)。成活率各组间没有显著差异(p>0.05)。表9:肉鸡生产性能结果曰龄组别Ac正对照)B(负对照)D(0.1%酿酒酵母)E(0.05%酿酒酵母)平均日增重(g)30.33士0,56a30.45士0.29a30.17士0.44a30.43士0.23a1-21平均日采食量(g)41.71土0.81a41.59士0.61a41.21士0.63a40.76士0.64b料肉比1.376±0.010a1.366士0.013a1.366土0.015a1.340士0.017b成活率(％)98.34±5.1298.33±4.3698.34±3.6899.17±0.78平均日增重(g)48.69士0.36a48.036士0,25a50.68士0.98b50.61士0.42b1-42平均日采食量(g)90.26±3.2189.83±0.3989.54±0.5389.08±0.43料肉比1.854士0.018a1.870±0.013a1.768士0.023b1.761士0細b成活率(％)95.85±2.3196.65±1.0296.65±2.0196.65±1.32平均日增重(g)53.95土0.58a54.82土0.34a56.28士0.48b55.76土0.19b1-49平均日采食量(g)104.58±0.67104.81±0.30106.13±0.29104.76±0.27料肉比1.944士0.068a1.915士0.045a1.889士0.019b1.881士0.052b成活率(％)95±1.4395±2.1395±1.5495士1.363.讨论本次试验的结果表明，前21天在提高肉仔鸡的生产性能方面，酿酒酵母与抗生素具有同样的作用效果。到了42天，酿酒酵母的作用效果逐渐明显，酿酒酵母组肉仔鸡的平均日增重显著高于对照组(正、负)(p<0.05),料肉比显著低于对照组(正、20负)(p<0.05)。从49天的试验来看，酿酒酵母组肉仔鸡的平均日增重显著高于对照组(正、负)(p<0.05)，料肉比显著低于对照组(正、负)(p〈0.05);而两组酿酒酵母组在平均日增重和料肉比方面差异不显著(p>0.05)。以上的试验结果表明，酿酒酵母应用在肉仔鸡日粮中可以提高肉仔鸡的生产性能，比抗生素的作用效果更加明显。两组酿酒酵母组(0.10%、0.05%)之间没有显著差异(P>0.05)，因此酿酒酵母在肉仔鸡日粮中添加量可以考虑在0.05%为宜。4.结论本次试验可以得出以下结论1)在肉鸡日粮中酿酒酵母可以促进肉鸡的生长，提高饲料的转化效率；2)酿酒酵母可以替代抗生素在肉鸡日粮中应用，其适宜的添加量为0.05%。采用牛、羊、鸭、鱼等各种动物分别进行上述实验，结果相似。对本发明实施例46得到的酿酒酵母制剂也分别进行了实验，结果基本相同。对于其他常用动物词料也进行了实验，结果与本实验例基本相同。上述实验表明，饲料中添加酿酒酵母制剂可以替代抗生素，促进动物生长、改善消化道微生态区系、提高动物的细胞免疫水平。实验例3不同酵母菌对于大肠杆菌的作用比较1.材料与方法1.1酵母菌代谢产物抑制大肠杆菌能力的选育大肠杆菌(K88、K99和987P)购自中国兽药监察所。K88在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为CMCC44742，K99在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为CMCC44820，987P在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为CMCC44317。酵母菌63株耐酸、胆盐、高铜和高锌的酵母菌。培养基麦康凯(MacConkay)培养基(购自北京天坛生物制品股份有限公司)。麦芽汁培养基麦芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，水1000mL。抑制大肠杆菌试验制作麦康凯培养基，加热溶解后在121'C高压灭菌15min后，无菌倾倒平皿。用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌培养液(4.0X108CFU/mL)于培养基表面，然后在距平皿中线约3cm的地方挖一宽为0.5cm的沟，沟与接种划线垂直，用热接种棒补底，如图4所示。分别用不同的酵母菌培养物将沟填满(不能溢出)，其中图4中1即为填充酵母菌培养物的沟，置普通培养箱28'C培养24h后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离。每个酵母菌作两个平行样，以平均值表示结果。1.2酵母菌与大肠杆菌混合培养抑制作用选育大肠杆菌(K88、K99和987P)来源同上。酵母菌11株肠代谢产物对大肠杆菌具有较强抑制作用的酵母菌。大肠杆菌的检测培养基麦康凯(MacConkay)培养基同上。随机选择一株酵母菌，取5mL培养物(8.2xl09CFU/mL)分别与15mL营养肉汤混合，制成含酵母菌培养物浓度的营养肉汤，接种大肠杆菌，接种量为培养液的5%，置37'C培养箱培养4、8和18h后，分别用无菌注射器取出培养液，培养液经梯度稀释成10-210-5后，每个稀释度作4个平行样，取0.3mL稀释液，用"L"棒均匀涂布于麦康凯琼脂平板上，置于37°C，普通培养箱培养18h，取菌落数在50150个的平皿计数，以平均值表示结果，计算每毫升培养液中大肠杆菌的数量。1.3酵母P-1,3/1,6-葡聚糖含量检测1.3.1主要试剂氢氧化钠(分析纯)；醋酸(分析纯)；葡萄糖(分析纯)。1.3.2主要实验设备干燥箱；三角瓶；高压锅；恒温水浴锅；分光光度计；分析天平(感量为0.001克)。1.3.3主要试剂的配制氢氧化钠溶液分别配制3%的氢氧化钠溶液。3%醋酸取3mL冰醋酸溶液定容至100mL。1.3.4酵母e-1,3/1,6-葡聚糖的制备过程取不同酵母发酵液离心，固形物干燥，取50g，加入250mL氢氧化钠溶液，在120。C加热3h。等冷却至室温后，离心(1000xg，IO分钟)，进行固液分离。弃去上清液后，加250mL水于剩余不溶物中，搅拌均匀，再离心(方法同上)。如此重复2次。再向不溶物中加入2.5L醋酸溶液(3%，v/v)搅拌均匀。然后在85'C水浴中保温1h。如上述方法再进行固液分离，并同样洗涤2次。剩余不溶物在40'C干燥。2.结果与讨论2.1酵母菌代谢产物对大肠杆菌的抑制作用酵母菌代谢产物抑制大肠杆菌的效果以离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离为指标，距离越大，说明抑菌效果越好。本试验所采用的平皿挖沟法是对经典的平皿挖孔法的改进，基本原理是放置在沟中的抗菌物质能渗透过琼脂来抑制大肠杆菌，随着离沟距离的增大，能渗透过去的抗菌物质的浓度就越小。大肠杆菌菌落与小沟的距离越大，说明酵母菌代谢产物所含抗菌物质的抑菌能力越强。用平皿挖沟法在同一平皿可以同时测定酵母菌代谢产物对3株大肠杆菌的抑制作用，而用平皿挖孔法在同一平皿只能测定对一株大肠杆菌的抑制作用。63株酵母菌对大肠杆菌K88、K99和987p的抑菌距离在1.02.6ctn之间，其中11株抑菌较好的见表10。表10酵母菌对大肠杆菌的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>2.2酵母p-l,3/l,6-葡聚糖含量检测由表11可以看出S19、H02和H14的|3-1,3/1,6-葡聚糖含量分别为9.2%、8.9%禾口9.1%。P-l,3/l,6-葡聚糖具有提高动物免疫机能的作用，因此，含量越高该菌种产生的益生作用越好。表11酵母e-1,3/1,6-葡聚糖含量<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>2.3酵母菌与大肠杆菌混合培养抑制作用选育由表12可以看出，酵母菌对大肠杆菌的抑制作用是不同的，但是基本上与上一个试验结果吻合。这说明酵母菌主要是通过代谢产物抑制大肠杆菌的增值，其中与S19混合培养的大肠杆菌未检出。表12酵母菌与大肠杆菌混合培养的抑制作用(单位CFU/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>63.小结通过本研究表明，酵母菌的益生作用主要是通过代谢产物产生的。从综合益生效果来看S19是最佳菌株。权利要求1.一种酿酒酵母，为SaccharomycescervisiaeS19，2006年3月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号CGMCCNo.1666。2.—种酿酒酵母制剂，其特征在于，为采用权利要求1的酿酒酵母在培养基中经过充分培养、发酵后的代谢产物与无机物混合，经后处理得到的。3.根据权利要求2所述的酿酒酵母制剂，其特征在于，所述的培养、发酵包括将酿酒酵母接种于斜面培养基进行培养，得到的种子培养物再接种于液体培养基中培养。4.根据权利要求3所述的酿酒酵母制剂，其特征在于，所述的斜面培养基为适合酵母培养的任何培养基，优选麦芽汁斜面培养基，其中优选的培养基的配方为麦芽汁粉1030g,葡萄糖粉220g，琼脂1030g，水5002000ml;优选为麦芽汁粉1525g,葡萄糖粉515g，琼脂1525g，水7001500ml;更优选麦芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，琼脂20g，水1000ml;所述的液体培养基为适合酵母培养的任何培养基，优选麦芽汁斜面培养基，其中培养基的配方为麦芽汁粉1030g，葡萄糖粉220g，水5002000ml;优选麦芽汁粉1525g,葡萄糖粉515g,水700■ml;更优选麦芽汁粉20g,葡萄糖粉10g，水1000ml。5.根据权利要求34任何一项所述的酿酒酵母制剂，其特征在于，所述液体培养基中培养为在154(TC下，培养1096小时；其中的斜面接种优选在恒温箱中，253(TC下培养3555小时。6.根据权利要求2所述的酿酒酵母制剂，其特征在于，所述的无机物为适合作为饲料添加剂的无机物，其中优选轻质碳酸钙、稻壳粉、麸皮粉、硅藻土、石粉，更优选轻质碳酸钙，培养物与无机物的比例为1:0.51:10，优选l:11:5。7.根据权利要求2所述的酿酒酵母制剂，其特征在于，所述的后处理为将培养液与无机物的混合物干燥、粉碎并制粒。8.含有权利要求27任何一项的酵母制剂的动物饲料，包括常用动物饲料和权利要求27任何一项的酵母制剂，其中酵母制剂的含量为0.001%3%，优选9.根据权利要求8所述的动物饲料，其中的常用动物饲料为日粮，优选猪用日粮、鸡用日粮、反刍动物用日粮或水产动物用日粮。10.权利要求l的酿酒酵母或权利要求27任何一项的酿酒酵母制剂在制备动物饲料上的用途。全文摘要本发明公开了一种酿酒酵母、含有该酿酒酵母的酿酒酵母制剂、动物饲料、其制备方法及其用途，其中的酿酒酵母为SaccharomycescervisiaeS19，2006年3月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号CGMCCNo.1666。所述的酿酒酵母制剂，为采用该酿酒酵母在培养基中经过充分培养、发酵后的代谢产物与无机物混合，经后处理得到的。本发明的酿酒酵母及其酿酒酵母制剂主要作为动物的饲料添加剂，其可以替代现有动物日粮中的抗生素，改善消化道微生物区系、能刺激肠道内有效微生物的增生，提供营养因子、促进营养物的消化吸收、降低腹泻、促进动物的生长、提高断奶仔猪的生产性能。文档编号C12N1/18GK101463329SQ200910076559公开日2009年6月24日申请日期2009年1月7日优先权日2009年1月7日发明者宋青龙,张建东,汪梅芳,谯仕彦申请人:北京龙科方舟生物工程技术中心