专利名称：一种采用脂肪酶合成天然α-生育酚琥珀酸单酯的方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，涉及一种用脂肪酶在有机溶剂中催化天然a-生 育酚和琥珀酸酐反应合成天然a-生育酚琥珀酸单酯的方法。
背景技术：
维生素E，包括生育酚和生育三烯酚，是一类天然抗氧化剂，是人体内一种 必需的天然营养成分，具有显著的抗氧化、消除体内自由基、消除性功能障碍、 促进血液循环、防止早衰、预防癌症发生、提高机体免疫力等功能。维生素E 包括四种生育酚同系物和四种生育三烯酚同系物，其中以a-生育酚生物活性最 强。目前a-生育酚可由天然植物提取或化学合成得到。天然a-生育酚的生物活 性是合成生育酚的2 3倍。
由于a-生育酚侧链上有三个不对称的手性碳原子，可以形成八种不同的光 学异构体。化学合成的ot-生育酚是八种异构体近似等摩尔比例的混合物(外消 旋生育酚，表示为dl-a-生育酚)。而天然a-生育酚仅包括右旋光异构体(表示 为d-cx-生育酚)，是通过天然植物分离提纯获得，产品安全性更高。所以天然ot-生育酚广泛应用在医药、食品、化妆品等与人体有关的领域。
在缺氧条件下，a-生育酚对热和碱稳定，直到10(TC也不受影响。但是它在 空气中会缓慢发生氧化反应，暴露在光、热、碱并有重金属离子存在的条件下， 氧化过程会加速进行，给产品的制备、贮存等带来许多不便。而且a-生育酚的 表面活性差，不具有润湿、保湿等美化皮肤的功效，限制了其在化妆品中的应 用。a-生育酚酯类产品则弥补了a-生育酚在这些方面的不足，拓展了它的应用领域。并且随着修饰基团的加入，赋予了a-生育酚一些新的生物功能。
在众多的a-生育酚酯类产品中，天然a-生育酚琥珀酸单酯由于其良好的稳 定性，较高的生物活性以及多样的功能而受到越来越多的重视。oc-生育酚琥珀 酸单酯是由a-生育酚酚环上的6位上引入了琥珀酰基得到。不但保持了a-生育 酚的生物活性，而且其化学稳定性大大高于a-生育酚，便于制剂、贮藏及运输。 琥珀酰基引入后，极大地提高了产品的表面活性，使其可作为化妆品中保湿的 成分发挥作用。此外，oc-生育酚琥珀酸单酯还具有抑制肿瘤细胞增生，促进肿 瘤细胞退化的作用，并且治疗过程中不会损害正常的体细胞。研究发现，a-生 育酚琥珀酸单酯的抗癌活性与机制均不同于维生素E。 a-生育酚琥珀酸单酯作 为癌症抑制剂具有非常广阔的前景。
但长期以来，工业上a-生育酚琥珀酸单酯和维生素E琥珀酸单酯(a-生育 酚及其它同系物琥珀酸单酯的混合物)都是通过化学法来生产。 一般以生育酚 和琥珀酸酐作为底物，反应需要高温，所用催化剂多采用毒性高的叔胺、吡啶 或碱金属盐作为催化剂。
Peter等人在专利US3538119 (1967)中提供了一种不用溶剂，用无水碱金 属盐为催化剂，在120-14(TC下制备维生素E琥珀酸单酯的方法。该方法使用的 催化剂需在使用前经烧熔后迅速与反应原料混合并反应，这给实际应用带来困 难。
冀亚飞等人(维生素E琥珀酸钙的合成[J].中国医药工业杂志，1996， 27(2):
59-60.)的合成研究方法是在dl-a-生育酚中加入琥珀酸酐，以4-二甲胺基吡啶
为催化剂，外加锌粉、环己烷，加热回流5h。冷却，滤除不溶物，常压蒸出环
己烷，得黄色油状物生育酚琥珀酸单酯。
中国专利CN101139336 (2007)公开了一种天然a-生育酚琥珀酸单酯的制备方法。以Ct-生育酚和琥珀酸酐为原料，以三乙醇胺为催化剂，置于反应釜中 反应；过程中需要通氮气。整个工艺过程的总收率达90%以上。
虽然维生素E酯化学合成产率较高，但也存在以下许多难以克服的缺点。 (1)反应需要高温，能耗高。(2)催化剂专一性差，导致副反应多，产物色 泽深、分离和精制困难等，最终产品品质差。(3)反应过程温度高导致维生素E 容易氧化变质，所以需通入氮气保护，增加了生产成本及反应器的复杂性。(4) 采用的催化剂为高毒性叔胺类或吡啶，如三乙胺、三乙醇胺、4-二甲胺基吡啶等。 由于维生素E琥珀酸单酯主要应用于食品、药品或保健品，对安全有着较高的 要求。化学法合成的产品必须经过多次处理纯化，这样必然增加生产成本。
随着生物技术的发展，特别是酶工程的研究，为生物催化剂合成功能性维 生素E酯提供了新的方法。与传统的化学法相比，酶法合成具有反应条件温和 (室温，常压)，专一性强，基本无副反应，产物品质高等特点。特别是近年来 非水相中酶促反应的发展，拓宽了酶的应用范围和领域，成为酶学研究的热点。
众多的研究报道和综合评述都展示了非水相中的酶反应的明显优势，如稳 定性更高，并且有机溶剂能保持一个较低的水活度，可以降低酯化和水解反应 的热力学和动力学障碍。更为重要的是对于水溶性差的底物，有机溶剂的引入 增强了反应物的溶解度，大大提高反应速度，拓宽了酶的应用范围。因此，在 非水体系中的酯化反应可实现高转化率，简化分离工艺。
Pamela Torres等人(Acetylation of vitamin E by cotwcfe/a Jwto/rft'ca lipase B immobilized on different carriers[J]. Process Biochemistry, 2008， 43: 145-153.)石开究 了以Novozym 435作催化剂，在叔戊醇和正己烷(体积比为10 :卯)的混合溶 剂中，以维生素E和醋酸乙烯酯作为底物进行转酯反应，反应十八天后，维生 素E醋酸酯转化率仅达到60%。反应过程耗时较长，没有实际的工业化价值。而且维生素E醋酸酯作为维生素E的替代品，仅可以增强其稳定性，并无其它 附加功能。
专利CN 101240303A中，王芳等人以天然生育酚与不饱和脂肪酸酯(即羧酸 乙烯、丙烯酯，包括乙烯醋酸酯、乙烯月桂酸酯、乙烯棕榈酸酯、丙烯醋酸酯、 丙烯月桂酸酯或丙烯棕榈酸酯)为底物，合成了相应的天然生育酚酯。反应所 用溶剂为非极性有机溶剂，包括正己烷，环己烷，石油醚，正庚烷或其混合物。 所用底物不饱和羧酸酯制备工艺复杂，价格相对较高。并且反应过程需额外加 入吸水剂用以提高转化率，加大了生产成本，也不利于后续的分离纯化操作。
发明内容
本发明的目的是用无毒，高效的脂肪酶为催化剂，替代化学法中高毒性的 叔胺或吡啶，克服高温下反应维生素E容易降解变性的缺点。反应过程中也无 须通入氮气保护，简化了反应工艺流程，降低了设备复杂性。催化剂固定化脂 肪酶可以进行多次重复利用，大大的降低了生产成本。
一种采用脂肪酶合成天然a-生育酚琥珀酸单酯的方法，制备方法是
将底物天然a-生育酚和琥珀酸酐按摩尔比为l : 1-1 : 8的比例加入有机溶剂 中，加入脂肪酶开始反应，在20-45t:的条件下，振荡或搅拌反应20-72小时， 天然a-生育酚转化率达80-98.39%。
反应所用的有机溶剂为二甲基亚砜或者是二甲基亚砜与丙酮的混合溶剂、 二甲基亚砜与叔戊醇的混合溶剂或二甲基亚砜与叔丁醇的混合溶剂。其中二甲 基亚砜与丙酮的混合溶剂体积比为1:9-9:1， 二甲基亚砜与叔戊醇的混合溶剂体 积比为1:9-9:1， 二甲基亚砜与叔丁醇的混合溶剂体积比为1:9-9:1。
反应所用脂肪酶为游离假丝酵母脂肪酶或根霉脂肪酶或者是通过载体将游 离假丝酵母脂肪酶、根霉脂肪酶固定化后的酶。同定酶所用载体为硅藻土，硅胶或树脂。
本发明在有机溶剂中完成的酯化反应方程式为:
本发明具有如下几个特点 1.所用的脂肪酶为处理后的游离脂肪酶或固定化脂肪酶。
2.采用极性有机溶剂或混合极性有机溶剂作为反应的介质，增加了底物溶 解度，同时最大限度减少溶剂对酶的损害。
与传统的化学合成法相比，本发明采用脂肪酶作为催化剂，反应专一性强、 副产物少。脂肪酶的化学本质是一种蛋白质，对人体无毒害作用。采用固定化 处理后，脂肪酶可以非常便利地从反应体系中滤除，并且可以重复多次使用。 既简化了后续分离步骤，又降低了生产成本。本反应所采用的有机溶剂主要为 二甲基亚砜，二甲基亚砜毒性极低，可以直接作为药物使用，其它的溶剂也为 毒性低或无毒的常用极性溶剂。在25X:的条件下，反应转化率达到90%以上，极 大地节约了能源，大大降低了生产成本。所以说本工艺是绿色环保、节能的合
成天然a-生育酚琥珀酸单酯的方法。
脂肪酶活力采用橄榄油乳化法测定，并定义脂肪酶在4(TC、 pH8.0下每分钟 产生^mol脂肪酸所需的酶量，即为l个脂肪酶国际单位，以U表示。
具体实施例方式
实施例1:0.02g游离假丝酵母脂肪酶(酶活30000U/g)加入到含0.64g天然a-生育 酚(1.5mmol)和1.20g琥珀酸酐(12mmo1)的5mL混合溶剂(二甲基亚砜与叔 戊醇体积比l : 1)中，25'C条件下，振荡反应(200r/min) ， 72hr反应转化率 达96. 22%。 实施例2:
操作步骤同实施例l，不同之处在于反应温度由25'C改为37"C， 72hr反 应转化率达到97. 84%。 实施例3:
操作步骤同实施例l，不同之处在于反应温度由25。C改为45X:， 72hr反 应转化率达到98. 39%。
实施例4:
操作步骤同实施例1，不同之处在于反应溶剂改为5mL二甲基亚砜，72hr 反应转化率达到98. 19。/。。 实施例5:
操作步骤同实施例l，不同之处在于反应介质改为二甲基亚砜与叔丁醇混
合溶剂(体积比l:l)， 72hr反应转化率达95. 88%。 实施例6:
操作步骤同实施例l，不同之处在于反应介质改为二甲基亚砜与丙酮混合 溶剂(体积比l:l)， 72hr反应转化率达92. 88%。 实施例7:
0.02g游离假丝酵母脂肪酶(酶活30000U/g)加入到含0.64g天然a-生育 酚(1.5mmol)和1.20g琥珀酸酐(12mmo1)的5mL混合溶剂(二甲基亚砜与叔 戊醇体积比1 : 1)中。45'C条件下，振荡反应(200r/min) , 24hr反应转化率达88. 72%o 实施例8:
操作步骤同实施例7，不同之处在于催化剂用量由0.02g游离假丝酵母脂 肪酶改为0.04g游离假丝酵母脂肪酶，反应转化率达到92. 72%。 实施例9:
O.lOg固定化脂肪酶(处理后的Novozym435)加入到含0.64g天然a-生育 酚(1.5mmo1)和1.20g琥珀酸酐(12mmo1)的5mL 二甲基亚砜中。45。C条件 下，振荡反应(200r/min)， 72hr反应转化率达83.40%。 实施例10:
操作歩骤同实施例9，不同之处在于反应底物浓度由0.64g天然oc-生育 酚(1.5mmo1)和1.20g琥珀酸酐(12mmo1)改为0.43g天然a-生育酚(lmmol) 和0.80g琥珀酸酐(8mmo1)， 72hr反应转化率达80.86%。 实施例11:
操作步骤同实施例9，不同之处在于反应底物浓度由0.64g天然a-生育 酚(1.5mmol)和1.20g琥珀酸酐(12mmol)改为0.22g天然a-生育酚(0.5mmo1) 和0.40g琥珀酸酐(4mmo1)， 72hr反应转化率达81.56%。 实施例12:
O.lg硅藻土固定化假丝酵母脂肪酶(表观酶活1000U/g)加入到含0.64g天 然a-生育酚(1.5mmol)和1.20g琥珀酸酐(12mmo1)的5mL混合溶剂(二甲基 亚砜与叔戊醇体积比l : 1)中，25。C条件下，振荡反应(200r/min) ， 72hr反 应转化率达90. 22%。
说明以上实施例所说反应转化率都是指天然a-生育酚合成天然a-生育 酚琥珀酸酯的转化率。
权利要求
1. 一种采用脂肪酶合成天然α-生育酚琥珀酸单酯的方法，其特征在于制备方法是将底物天然α-生育酚和琥珀酸酐按摩尔比为1∶1-1∶8的比例加入有机溶剂中，加入脂肪酶开始反应，在20-45℃的条件下，振荡或搅拌反应20-72小时，天然α-生育酚转化率达80-98.39％。
2. 如权利要求1所述一种采用脂肪酶合成天然a-生育酚琥珀酸单酯 的方法，其特征是反应所用的有机溶剂为二甲基亚砜或者是二甲 基亚砜与丙酮的混合溶剂、二甲基亚砜与叔戊醇的混合溶剂或二 甲基亚砜与叔丁醇的混合溶剂；其中二甲基亚砜与丙酮的混合溶 剂体积比为1:9-9:1， 二甲基亚砜与叔戊醇的混合溶剂体积比为 1:9-9:1， 二甲基亚砜与叔丁醇的混合溶剂体积比为1:9-9:1。
3. 如权利要求1所述一种采用脂肪酶合成天然a-生育酚琥珀酸单酯 的方法，其特征是反应所用脂肪酶为游离假丝酵母脂肪酶或根霉 脂肪酶或者是通过载体将游离假丝酵母脂肪酶、根霉脂肪酶固定 化后的酶。
4. 如权利要求3所述一种采用脂肪酶合成天然a-生育酚琥珀酸单酯 的方法，其特征是脂肪酶固定化载体为硅藻土，硅胶或树脂。
全文摘要
一种采用脂肪酶合成天然α-生育酚琥珀酸单酯的方法，属于生物化工领域。其特征在于制备方法是将底物天然α-生育酚和琥珀酸酐按摩尔比为1∶1-1∶8的比例加入有机溶剂中，加入脂肪酶开始反应，在20-45℃的条件下，振荡或搅拌反应20-72小时，天然α-生育酚转化率达80-98.39％。与目前工业中使用高毒性化学催化剂在高温下进行酯化的工艺方法相比，本方法具有反应条件温和(室温，常压)，能耗低，催化剂无毒、专一性强，反应效率高，副产物少等优点。
文档编号C12P17/02GK101475968SQ200910076860
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月23日
发明者刘江帆, 尹春华 申请人:北京科技大学