专利名称：用于组织工程皮肤运输的培养基及其配制方法
技术领域：
本发明属于一种组织工程皮肤研究中的生物试剂类，特别是一种用于组织工程皮肤运输的培养基。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，它由三部分即表皮层、真皮层和皮下层构成。表皮层位于皮肤的最外层，厚度介于0.06 0.8mm之间，其微结构由基底层、棘细胞层、颗粒细胞层和角质层构成。角质层是角质形成细胞分化的最后产物，其组成中75% 80°/。为蛋白质，5% 15%为脂类，由10 15层细胞构成厚度大约10pm的结构。角质层有着许多重要的生理功能，能够有效阻挡外界毒性化合物对皮肤活性细胞的损伤，特别是对化妆品成分中潜在可能产生的细胞毒性有着极为重要的屏障作用。
组织工程皮肤经历了从表皮替代物、真皮替代物到双层结构的组织工程皮肤替代物的阶段，其基础研究和应用研究有了广泛的进步。应用研究涉及体内应用和体外应用，体内应用集中在各种皮肤创伤的治疗，体外主要运用于化合物的毒性检测，如化合物的腐蚀性、刺激性、光毒性、生殖毒性等的检测。体外毒性检测方面，欧洲替代方法验证中心(ECVAM)主导的对各种动物替代方法进行的验证工作是一项系统工程，引起了世界范围的关注。以组织工程皮肤为例，进行的化合物腐蚀性检测目前有EpiDerm和EpiSkin两种产品通过验证，刺激性检测目前有EpiSkin、 SkinEthic RHE和EpiDerm SIT通过了验证。虽然在验证阶段已经通过了审查，有的甚至被法规接受，但是，基于组织工程皮肤^化合物检测在实验室研究或者是企业产品上的运用并没有得到推广。很大程度上是因为迄今为止没有开发出适合运输且具备良好性能的组织工程皮肤运输培养液所致。 一方面，组织工程研究属于高精技术领域，普通实验室或者公司根本没有实力开发组织工程产品；另一方面，有能力开发的单位因为没有找到合适的运输培养液而限制了产品的推广甚至是放弃了产品的研发和投入。
目前，市场上还没有商业化的组织工程皮肤运输培养液。经检索，具有稳定性高、操作简便、组织培养效果好且能有效维持运输过程中组织工程皮肤的结构和功能的培养液，至今尚未见公开资料。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于组织工程皮肤运输的培养基，其稳定性高、操作简便、组织培养效果好且能有效维持运输过程中组织工程皮肤的结构和功能，具有很高的商业产业化前景。
一种用于组织工程皮肤运输的培养基，其组分及各组分的用量为
(1) 基础培养液由以下体积百分比的物质混配而成
DMEM培养液 60 70%
F12培养液 20 25%
胎牛血清 5 20%
(2) 营养物质-
氢化可的松0.4 0.5 itig/mL
表皮细胞生长因子5 15 ng/mL
异丙基肾上腺素1 3xl(T6 mol/L
胰岛素5 15pg/mL
转铁蛋白5 10 )a_g/mL
三碘甲状腺氨酸2 6xl(T9 mol/L
腺嘌呤1 3xl0"4 mol/L
维生素c50 100pg/mL
霍乱毒素0.1 ~1腿ol/L
L-丝氨酸l 3xl(T2mol/L
L-肉毒碱1 5x10-5 mol/L
软脂酸15 35 nmol/L
亚油酸5 25 |_imol/L
花生四烯酸5 10 |_imol/L
牛脑垂体提取物10 50 pg/mL
牛血清白蛋白2 7xl(T5 mol/L
青霉素100U/mL
链霉素100 mg/mL
两性霉素B1 4 mg/mL
(3)琼脂 10 25g/LPH值调整为7.2 7.4。
本发明的用于组织工程皮肤运输的培养基，其配制方法包括以下步骤(l)将购买的商用DMEM和F12粉剂分别按照说明书的要求配制成溶液;
5(2) 取步骤(1)配制的DMEM培养液、F12培养液和胎牛血清混合使其体积浓度分别占到总体积的60 70%、 20 25%和5 20%，充分混合，三者体积份数和为100%，制成基础培养液；
(3) 将氢化可的松、表皮细胞生长因子、异丙基肾上腺素、胰岛素、维生素C、转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸、腺嘌呤、霍乱毒素、L-丝氨酸、L-肉毒碱、软脂酸、亚油酸、花生四烯酸、牛脑垂体提取物、牛血清白蛋白、青霉素、链霉素、两性霉素B按照所述用量添加到基础培养液中，调节PH值7.2 7.4;并将得到的溶液用0.2 nm滤器过滤除菌；
(4) 琼脂以50 100 g/L浓度加热搅拌溶于双蒸水中，高压灭菌，作为储存品；
(5) 将步骤(3)得到的培养液无菌放入水浴锅45 55'C加热；
(6) 将步骤(4)得到的琼脂储存品无菌放入水浴锅95'C加热，直至完全熔化；
(7) 取步骤(6)得到的液态琼脂加入步骤(5)的培养液中，使琼脂的终浓度达到10 25 g/L,搅拌并充分混合，分装冷却后即得本发明的组织工程皮肤运输培养基。本发明的培养基，在配制好后趁热加入到细胞培养孔板中，待冷却后即将构建好的组织
工程皮肤等放置其上后密闭即可。用此保存的组织工程皮肤可长时间保存和运输。
本发明用于组织工程皮肤运输的培养基具有以下优点 一是本发明培养基的稳定性强，保质期长达12个月左右，完全满足组织工程皮肤产品跨大范围地域的运输；二是本发明培养基能有效维持运输过程中组织工程皮肤的结构和功能；三是本发明培养基配制方法简便，添加物均溶于液体，便于产品的合成和规模生产；四是本发明培养基冷却后为固态，便于运输途中挪动。
具体实施例方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体阐述一、本发明用于组织工程皮肤运输的培养基的配制1、其组分及各组分的用量为
(1) 基础培养液由以下体积百分比的物质混配而成-
DMEM培养液 65%
F12培养液 25%
胎牛血清 10°/。
(2) 营养物质
氢化可的松 0.4 0.5 ng/mL
6表皮细胞生长因子5 15 ng/mL
异丙基肾上腺素l 3xl0—6mol/L
胰岛素
转铁蛋白5 10 (ig/mL
三碘甲状腺氨酸2 6xlO-9mol/L
腺嘌呤1 3xl()4mol/L
维生素c50 100吗/mL
霍乱毒素0.1 1 nmol/L
L-丝氨酸I 3xl0'2mol/L
L-肉毒碱1 5xl(T5 mol/L
软脂酸15 35 pmol/L
亚油酸5 25 (_imol/L
花生四烯酸5 10 jimoI/L
牛脑垂体提取物10 50 (ag/mL
牛血清白蛋白2 7xl(T5 mol/L
青霉素100U/mL
链霉素100 mg/mL
两性霉素B1 4 mg/mL
(3)琼脂 10 25g/LPH值调整为7.2 7.4。
2、配制方法和应用
(1) 将购买的商用DMEM和F12粉剂分别按照说明书的要求配制成溶液；
(2) 取步骤(1)配制的DMEM培养液、F12培养液和胎牛血清混合，三者体积份数和为100%，其中三者的体积百分比分别可在60 70%、 20 25%和5 20%范围内自由选择,制成基础培养液；
(3)将氢化可的松、表皮细胞生长因子、异丙基肾上腺素、胰岛素、维生素C、转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸、腺嘌呤、霍乱毒素、L-丝氨酸、L-肉毒碱、软脂酸、亚油酸、花生四烯酸、牛脑垂体提取物、牛血清白蛋白、青霉素、链霉素、两性霉素B按照所述用量添加到基础培养液中，调节PH值7.2 7.4;并将得到的溶液用0.2 滤器过滤除菌；
7(4) 琼脂以50 100g/L浓度加热搅拌溶于双蒸水中，高压灭菌，作为储存品；
(5) 将步骤(3)得到的培养液无菌放入水浴锅45 55'C加热；
(6) 将步骤(4)得到的琼脂储存品无菌放入水浴锅95'C加热，直至完全熔化；
(7) 取步骤(6)得到的液态琼脂加入步骤(5)的培养液中，使琼脂的终浓度达到10 25 g/L，搅拌并充分混合，趁热分装到细胞培养孔板中，待冷却后即将构建好的组织工程皮肤等放置其上后密闭即可。用此保存的组织工程皮肤可长时间保存和运输。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
8
权利要求
1. 一种用于组织工程皮肤运输的培养基，其特征在于其组分及各组分的用量为(1)基础培养液由以下体积百分比的物质混配而成DMEM培养液 60～70％F12培养液20～25％胎牛血清 5～20％(2)营养物质氢化可的松 0.4～0.5μg/mL表皮细胞生长因子 5～15ng/mL异丙基肾上腺素 1～3×10-6mol/L胰岛素 5～15μg/mL转铁蛋白 5～10μg/mL三碘甲状腺氨酸 2～6×10-9mol/L腺嘌呤 1～3×10-4mol/L维生素C 50～100μg/mL霍乱毒素 0.1～1nmol/LL-丝氨酸 1～3×10-2mol/LL-肉毒碱 1～5×10-5mol/L软脂酸 15～35μmol/L亚油酸 5～25μmol/L花生四烯酸 5～10μmol/L牛脑垂体提取物 10～50μg/mL牛血清白蛋白 2～7×10-5mol/L青霉素 100U/mL链霉素 100mg/mL两性霉素B1～4mg/mL(3)琼脂 10～25g/LPH值调整为7. 2～7.4。
2.根据权利要求1所述的用于组织工程皮肤运输的培养基，其特征在于其配制方法包括以下步骤(1) 将购买的商用DMEM和F12粉剂分别按照说明书的要求配制成溶液；(2) 取步骤(1)配制的DMEM培养液、F12培养液和胎牛血清混合使其体积浓度分别占到 总体积的60 70%、 20 25%和5 20%，充分混合，三者体积份数和为100%,制成基 础培养液；(3) 将氢化可的松、表皮细胞生长因子、异丙基肾上腺素、胰岛素、 维生素C、转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸、腺嘌呤、霍乱毒素、L-丝氨酸、 L-肉毒碱、软脂酸、亚油酸、花生四烯酸、牛脑垂体提取物、牛血清白蛋白、青霉素、 链霉素、两性霉素B按照所述用量添加到基础培养液中，调节PH值7.2 7.4;并将得 到的溶液用0.2 pm滤器过滤除菌；(4) 琼脂以50 100g/L浓度加热搅拌溶于双蒸水中，高压灭菌，作为储存品；(5) 将步骤(3)得到的培养液无菌放入水浴锅45 55'C加热；(6) 将步骤(4)得到的琼脂储存品无菌放入水浴锅95'C加热，直至完全熔化；(7) 取步骤(6)得到的液态琼脂加入步骤(5)的培养液中，使琼脂的终浓度达到10 25 g/L， 搅拌并充分混合，分装冷却后即得本发明的组织工程皮肤运输培养基。
3.权利要求1或2所述的培养基在组织工程皮肤运输中的应用。
全文摘要
一种用于组织工程皮肤运输的培养基，其在基础培养液中添加氢化可的松、表皮细胞生长因子、异丙基肾上腺素、胰岛素、转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸、腺嘌呤、维生素C、霍乱毒素、L-丝氨酸、L-肉毒碱、软脂酸、亚油酸、花生四烯酸、牛脑垂体提取物、牛血清白蛋白、青霉素、链霉素、两性霉素B，得到的培养基，稳定性强，保质期长达12个月左右，完全满足组织工程皮肤产品跨大范围地域的运输，能有效维持运输过程中组织工程皮肤的结构和功能，冷却后为固态，便于运输途中挪动。
文档编号C12N5/071GK101486995SQ20091007830
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月24日 优先权日2009年2月24日
发明者王军兵, 艳 程, 董益阳, 邹运动 申请人:中国检验检疫科学研究院