专利名称：添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及添加二甲基亚砜(DMSO)的药用植物芽诱导培养基，特别涉及添加二 甲基亚砜(DMSO)的长鞭红景天芽诱导培养基及其制备方法和用途。
背景技术：
红景天有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射、延缓机体衰老，防止老年疾病等功 效。它又是适应原样药物，在军事医学、航天医学、运动医学和保健医学等方面也有十分 重要的意义。长鞭红景天(Rhodiola fastigiata)为景天科(Crassulaceae)红景天属 (Rhodiola L.)多年生草本植物，在世界上主要分布于中国、尼泊尔、锡金、不丹及克什米尔 地区，在我国主要分布于西藏、云南和四川。长鞭红景天是国家第二批确定的二级保护植 物，同时由于对该植物资源的过度开发和对其生长环境的破坏，目前已列入了物种红色名 录，处于近危状态。红景天生长的海拔高，所处的环境恶劣，生长缓慢，种子萌发率很低。随着红景天 的药物、保健食品、化妆品等的开发热潮，通过组织培养来进行快速繁殖红景天是一种有效 的解决资源短缺、实现资源的可持续性发展利用的方法。长鞭红景天的快繁主要包括芽的 诱导、生根等步骤。长鞭红景天诱导的芽生根比较容易，因此芽诱导步骤成为长鞭红景天组 织快繁的关键步骤。胡挺松等人在《植物生理学通讯》，2004，40 (3) :335_335的“长鞭红景天的组织培 养和快速繁殖” 一文中介绍了以幼叶和嫩茎作为外植体，以WPM基本培养基添加激素6-苄 基腺嘌呤(BAP)和吲哚-3-丁酸(IBA)，培养温度为(25士2) °C，光照时间每天10小时， 实现了长鞭红景天的芽诱导。晏婴才等人在《植物生理学通讯》，2005，41(3) :341-341的 “云南野生红景天的组织培养与快速繁殖” 一文中介绍了以叶柄、茎尖为外植体，以MS基本 培养基添加激素BAP和吲哚-3-乙酸(IAA)，以花芽为外植体，以MS基本培养基添加激素 KT,以幼茎为外植体，以MS基本培养基添加激素激动素(KT)和IAA，变温(11 22°C )培 养，光照时间每天12小时，实现了长鞭红景天的丛生芽诱导。HAI-JUN LIU等人(Hai-Jun Liu, Yan Xu, Yu-Jun Liu, Chun-Zhao Liu. Plant regeneration from leaf explants of Rhodiola fastigiata. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant,2006, 42(4) 345-347)的技术方案是以叶片为外植体，以MS基本培养基添加激素BAP和萘乙酸 (NAA)，光照时间每天12小时，实现了长鞭红景天的芽诱导。目前长鞭红景天的芽诱导效率还比较低，没有实现长鞭红景天的工厂化大规模生产。为了实现长鞭红景天的工厂化大规模生产，需要改进现有的培养基和培养方法，提高 快繁过程中的芽诱导的效率，减低成本。长鞭红景天的芽诱导培养基是基本培养基加上细 胞分裂素和生长素。我们在实验中发现，在芽诱导培养基中添加合适浓度的二甲基亚砜 (DMSO)，按照合适的芽诱导方法，可以大大提高长鞭红景天芽诱导的效率。DMSO是一种既溶 于水又溶于有机溶剂的非质子极性溶剂。作为一种渗透性保护剂，DMSO在动植物细胞的低 温保存中广泛应用。DMSO在诱导动物和人的细胞分化方面也有报道。在植物的快繁中，特别是芽诱导过程中，没有应用DMSO来促进芽诱导的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于解决传统长鞭红景天芽诱导中的出芽效率低等问题，提供添加 二甲基亚砜(DMSO)的长鞭红景天芽诱导培养基。本发明的再一目的是提供一种添加二甲基亚砜(DMSO)的长鞭红景天芽诱导培养 基的制备方法。本发明的还一目的是提供添加二甲基亚砜(DMSO)的长鞭红景天芽诱导培养基的 用途，利用本发明提供的添加二甲基亚砜(DMSO)的长鞭红景天芽诱导培养基进行芽诱导 的生长，在不影响诱导出芽的质量前提下，提高芽诱导的出芽数和出芽率，降低成本，为工 厂化大规模生产打下坚实的基础。
本发明的添加二甲基亚砜(DMSO)的长鞭红景天芽导培养诱基是在每升MS基本培 养基中含有细胞分裂素6-苄基腺嘌呤(BAP)的浓度为1 μ Mol化―1 20 μ Mol化―1 (1 μ M 20 μ Μ)，生长素萘乙酸(NAA)的浓度为 0. 1 μ Mol · L-1 5 μ Mol · L-1 (0. 1 μ M 5 μ Μ)，二 甲基亚砜(DMSO)的浓度为0. OOlml · Γ1 20ml · Γ1。所述的长鞭红景天芽诱导培养基中可进一步添加琼脂，琼脂的添加量为每升长鞭 红景天芽诱导培养基中添加琼脂4 7克。本发明的添加二甲基亚砜(DMSO)的长鞭红景天芽诱导培养基的制备方法向配 制MS基本培养基的溶液中加入细胞分裂素BAP溶液和生长素NAA溶液，混合均勻，用无 机酸或无机碱调节混合液的ρΗ为5. 6 5. 8，高温湿热灭菌后加入经过滤除菌的二甲基 亚砜，混合均勻，得到每升MS基本培养基中含有细胞分裂素BAP的浓度为1 μ Mol 20 μ Mol (1 μ M 20 μ Μ)，生长素 NAA 的浓度为 0. 1 μ Mol Γ1 5 μ Mol Γ1 (0· 1 μ M 5 μ Μ)，二甲基亚砜的浓度为OOOlml · Γ1 20ml · Γ1。在高温湿热灭菌前可进一步添加琼脂，琼脂的添加量为每升长鞭红景天芽诱导培 养基中添加琼脂4 7克。所述的无机酸为盐酸、硫酸或硝酸等。所述的无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾等。所述的高温湿热灭菌为本领域内对培养基灭菌的常规方法，如在121°C下灭菌18 分钟。本发明的添加二甲基亚砜(DMSO)的长鞭红景天芽诱导培养基可作为长鞭红景天 芽诱导生长的培养基使用。在作为长鞭红景天芽诱导生长的培养基使用时的操作步骤如下1).将添加二甲基亚砜(DMSO)的长鞭红景天芽诱导培养基倒入高压湿热灭菌的 培养皿或培养瓶中，待用；2).将无菌的或表面经消毒的长鞭红景天芽诱导外植体切成0. 3 2cm长的小段 或块接种到步骤1)的芽诱导培养基上；控制培养温度在24 26°C，前3天进行黑暗培养， 3天后在光照强度为2000 3000LUX的条件下每天进行光照6 16小时，直至得到2cm以 上的芽。所述的高温湿热灭菌为本领域内对培养基灭菌的常规方法，如在121°C下灭菌18分钟。所述的长鞭红景天芽诱导外植体表面消毒是先用乙醇漂洗，再用质量浓度为 0. 1 % 1. 0%的有效氯消毒液浸泡，每5 20分钟更换1次消毒液，更换1 3次，浸泡总 时长为10分钟 40分钟，然后用无菌水冲洗2 5次。所述的乙醇漂洗是用体积浓度为70%的乙醇漂洗5 30秒。所述的长鞭红景天芽诱导外植体选自野生的长鞭红景天的叶片、野生的长鞭红景 天的嫩茎、移栽的长鞭红景天的叶片、移栽的长鞭红景天的嫩茎、长鞭红景天的实生种子苗 的子叶、长鞭红景天的实生种子苗的下胚轴中的一种。所述的长鞭红景天的实生种子苗的子叶是长鞭红景天的实生无菌种子苗的子叶。所述的长鞭红景天的实生种子苗的下胚轴是长鞭红景天的实生无菌种子苗的下 胚轴。所述的MS基本培养基为公知产品，如可参见张志良、瞿伟菁主编的《植物生理学 实验指导》(第三版)。北京高等教育出版社，2003.附录326-327。由于在本发明的添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基中加入了低浓度的 二甲基亚砜，所以诱导出的芽形态正常，生长良好，可以正常生根和在大田生长。使用本发 明的添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基，与不加二甲基亚砜的芽诱导培养基进行 长鞭红景天芽诱导相比，芽诱导率和芽诱导数都有较大的提高，大大降低了生产成本，为大 规模工厂化生产打下了良好的基础。
具体实施例方式实施例1.向配制MS基本培养基的溶液中加入细胞分裂素BAP溶液和生长素NAA溶液，混合 均勻，用盐酸或氢氧化钾调节混合液的PH为5. 8，加入琼脂7克· L—1。采用本领域内对培 养基灭菌的常规高温湿热灭菌方法进行高温湿热灭菌后加入经过滤除菌的二甲基亚砜，混 合均勻，得到每升MS基本培养基中含有细胞分裂素BAP的浓度为1 μ Μ,生长素NAA的浓度 为0. 1 μ Μ，二甲基亚砜的浓度为0. OOlml · L-1及琼脂7克。在作为长鞭红景天芽诱导生长的培养基使用时的操作步骤如下1).将添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基倒入高压湿热灭菌的培养皿 中，待用；2)选取移栽的长鞭红景天的叶片为外植体，先用体积浓度为70%的乙醇漂洗10 秒，再用质量浓度为0. 1 %有效氯消毒液浸泡，每10分钟更换1次消毒液，更换消毒液2次， 浸泡总时长为30分钟，然后用无菌水冲洗2次，外植体的消毒结果理想。将经上述表面消 毒的外植体切成Icm长的小块，接种到上述芽诱导培养基上。控制培养温度在24 26°C 之间，前3天进行黑暗培养，3天后每天光照时间12h，光照强度为3000LUX。外植体在培养 20天左右开始出芽，在40天左右诱导出大量的芽，所得到的芽形态正常。与不加二甲基亚 砜的芽诱导培养基进行长鞭红景天芽诱导相比，出芽率提高30%左右，每个出芽的外植体 出芽数提高7个左右。把2cm以上的芽接种到生根培养基中可以正常生根，生根的苗可以 在大田正常生长。实施例2.
向配制MS基本培养基的溶液中加入细胞分裂素BAP溶液和生长素NAA溶液，混合均勻，用硝酸或氢氧化钠调节混合液的PH为5.7。在121°C下灭菌18分钟后加入经过 滤除菌的二甲基亚砜，混合均勻，得到每升MS基本培养基中含有细胞分裂素BAP的浓度为 20 μ Μ,生长素NAA的浓度为5 μ Μ，二甲基亚砜的浓度为2ml · Γ1。在作为长鞭红景天芽诱导生长的培养基使用时的操作步骤如下1).将添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基倒入经121°C下灭菌18分钟后 的培养瓶中，待用；2)选取野生的的长鞭红景天叶片为外植体，先用体积浓度为70%的乙醇漂洗30 秒，再用质量浓度为0. 有效氯消毒液浸泡，每5分钟更换1次消毒液，更换消毒液3次， 浸泡总时长为20分钟，然后用无菌水冲洗4次，外植体的消毒结果理想。把经上述表面消 毒的外植体切成0. 3cm长的小块，接种到上述芽诱导培养基上。控制培养温度在24 26°C 之间，前3天进行黑暗培养，3天后每天光照时间6h，光照强度为2500LUX。培养瓶上摇床 培养，外植体在培养20天左右开始出芽，在40天左右诱导出大量的芽，所得到的芽形态正 常。与不加二甲基亚砜的芽诱导培养基进行长鞭红景天芽诱导相比，出芽率提高15%左右， 每个出芽的外植体出芽数提高3个左右。把2cm以上的芽接种到生根培养基中可以正常生 根，生根的苗可以在大田正常生长。实施例3.向配制MS基本培养基的溶液中加入细胞分裂素BAP溶液和生长素NAA溶液，混 合均勻，用盐酸或碳酸氢钠调节混合液的PH为5. 6。在121°C下灭菌18分钟后加入经过 滤除菌的二甲基亚砜，混合均勻，得到每升MS基本培养基中含有细胞分裂素BAP的浓度为 20 μ Μ,生长素NAA的浓度为2 μ Μ，二甲基亚砜的浓度为20ml · Γ1。在作为长鞭红景天芽诱导生长的培养基使用时的操作步骤如下1).将添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基倒入经121°C下灭菌18分钟后 的培养瓶中，待用；2)选取实生的长鞭红景天无菌种子苗的下胚轴为外植体，外植体切成0.5cm长的 小段，接种到上述芽诱导培养基上。控制培养温度在24 26°C之间，前3天进行黑暗培养， 3天后每天光照时间16h，光照强度为2000LUX。培养瓶上摇床培养，外植体在培养20天左 右开始出芽，在40天左右诱导出大量的芽，所得到的芽形态正常。与不加二甲基亚砜的芽 诱导培养基进行长鞭红景天芽诱导相比，出芽率提高20%左右，每个出芽的外植体出芽数 提高5个左右。把2cm以上的芽接种到生根培养基中可以正常生根，生根的苗可以在大田 正常生长。实施例4.向配制MS基本培养基的溶液中加入细胞分裂素BAP溶液和生长素NAA溶液，混合 均勻，用硝酸或氢氧化钠调节混合液的PH为5. 8，加入琼脂6克· L—1。在121°C下灭菌18 分钟后加入经过滤除菌的二甲基亚砜，混合均勻，得到每升MS基本培养基中含有细胞分裂 素BAP的浓度为10 μ Μ,生长素NAA的浓度为1 μ Μ，二甲基亚砜的浓度为0. 02ml · Γ1及琼 脂6克。在作为长鞭红景天芽诱导生长的培养基使用时的操作步骤如下1).将添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基倒入经121°C下灭菌18分钟后的培养皿中，待用；2)选取实生的长鞭红景天种子苗的下胚轴为外植体，先用体积浓度为70%的乙 醇漂洗30秒，再用质量浓度为0. 5%有效氯消毒液浸泡，每10分钟更换1次消毒液，更换 消毒液2次，浸泡总时长为30分钟，然后用无菌水冲洗3次。把经上述表面消毒的外植体 切成1. Ocm长的小段，接种到上述芽诱导培养基上。控制培养温度在24 26°C之间，前3 天进行黑暗培养，3天后每天光照时间12h，光照强度为2500LUX。外植体的消毒结果理想。 外植体在培养20天左右开始出芽，在40天左右诱导出大量的芽，所得到的芽形态正常。与 不加二甲基亚砜的芽诱导培养基进行长鞭红景天芽诱导相比，出芽率提高15%左右，每个 出芽的外植体出芽数提高3个左右。把2cm以上的芽接种到生根培养基中可以正 常生根， 生根的苗可以在大田正常生长。实施例5.向配制MS基本培养基的溶液中加入细胞分裂素BAP溶液和生长素NAA溶液，混合 均勻，用硫酸或氢氧化钠调节混合液的PH为5. 7，加入琼脂6克· L—1。在121°C下灭菌18 分钟后加入经过滤除菌的二甲基亚砜，混合均勻，得到每升MS基本培养基中含有细胞分裂 素BAP的浓度为10 μ Μ,生长素NAA的浓度为5 μ Μ, 二甲基亚砜的浓度为Iml · L—1及琼脂6克。在作为长鞭红景天芽诱导生长的培养基使用时的操作步骤如下1).将添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基倒入经121°C下灭菌18分钟后 的培养皿中，待用；2)选取野生的长鞭红景天的嫩茎为外植体，先用体积浓度为70%的乙醇漂洗30 秒，再用质量浓度为0. 5%有效氯消毒液浸泡，每10分钟更换1次消毒液，更换消毒液3次， 浸泡总时长为40分钟，然后用无菌水冲洗3次，外植体的消毒结果理想。把经上述表面消 毒的外植体切成0. 5cm长的小段，接种到上述芽诱导培养基上。控制培养温度在24 26°C 之间，前3天进行黑暗培养，3天后每天光照时间12h，光照强度为2500LUX。外植体在培养 20天左右开始出芽，在40天左右诱导出大量的芽，所得到的芽形态正常。与不加二甲基亚 砜的芽诱导培养基进行长鞭红景天芽诱导相比，出芽率提高15%左右，每个出芽的外植体 出芽数提高3个左右。把2cm以上的芽接种到生根培养基中可以正常生根，生根的苗可以 在大田正常生长。实施例6.向配制MS基本培养基的溶液中加入细胞分裂素BAP溶液和生长素NAA溶液，混合 均勻，用盐酸或氢氧化钠调节混合液的PH为5. 8，加入琼脂6克· L—1。在121°C下灭菌18 分钟后加入经过滤除菌的二甲基亚砜，混合均勻，得到每升MS基本培养基中含有细胞分裂 素BAP的浓度为15 μ Μ,生长素NAA的浓度为1 μ Μ，二甲基亚砜的浓度为0. 2ml化―1及琼脂 6克。在作为长鞭红景天芽诱导生长的培养基使用时的操作步骤如下1).将添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基倒入经121°C下灭菌18分钟后 的培养皿中，待用；2)选取实生的长鞭红景天种子苗的子叶为外植体，先用体积浓度为70%的乙醇 漂洗20秒，再用质量浓度为1. 0%有效氯消毒液浸泡，每10分钟更换1次消毒液，更换消毒液1次，浸泡总时长为20分钟，然后用无菌水冲洗3次，外植体的消毒结果理想。把经上述表面消毒的外植体切成0. 3cm长的小块，接种到上述芽诱导培养基上。控制培养温度在 24 26°C之间，前3天进行黑暗培养，3天后每天光照时间12h，光照强度为2500Lux。外植 体在培养20天左右开始出芽，在40天左右诱导出大量的芽，所得到的芽形态正常。与不加 二甲基亚砜的芽诱导培养基进行长鞭红景天芽诱导相比，出芽率提高20%左右，每个出芽 的外植体出芽数提高5个左右。把2cm以上的芽接种到生根培养基中可以正常生根，生根 的苗可以在大田正常生长。
权利要求
一种添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基，其特征是在每升MS基本培养基中含有细胞分裂素6-苄基腺嘌呤的浓度为1μMol·L-1～20μMol·L-1，生长素萘乙酸的浓度为0.1μMol·L-1～5μMol·L-1，二甲基亚砜的浓度为0001ml·L-1～20ml·L-1。
2.根据权利要求1所述的添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基，其特征是所 述的长鞭红景天芽诱导培养基中添加有琼脂，琼脂的添加量为每升长鞭红景天芽诱导培养 基中添加琼脂4 7克。
3.一种根据权利要求1或2所述的添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基的制备 方法，其特征是向配制MS基本培养基的溶液中加入细胞分裂素6-苄基腺嘌呤溶液和生长 素萘乙酸溶液，混合均勻，用无机酸或无机碱调节混合液的pH为5. 6 58，高温湿热灭菌后 加入经过滤除菌的二甲基亚砜，混合均勻，得到每升MS基本培养基中含有细胞分裂素6-苄 基腺嘌呤的浓度为1 P Mol L—1 20 ii Mol L—1，生长素萘乙酸的浓度为0. 1 u Mol L—1 5uMol 二甲基亚砜的浓度为 0001ml I71 20ml I71。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是在高温湿热灭菌前添加琼脂，琼脂的添 加量为每升长鞭红景天芽诱导培养基中添加琼脂4 7克。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是所述的无机酸为盐酸、硫酸或硝酸；所述的无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾。
6.一种根据权利要求1或2所述的添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基作为长 鞭红景天芽诱导生长的培养基使用。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征是添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养 基作为长鞭红景天芽诱导生长的培养基使用时的操作步骤为1).将添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基倒入高压湿热灭菌的培养皿或培养 瓶中，待用；2).将无菌的或表面经消毒的长鞭红景天芽诱导外植体切成0.3 2cm长的小段或块 接种到步骤1)的芽诱导培养基上；控制培养温度在24 26°C，前3天进行黑暗培养，3天 后在光照强度为2000 3000LUX的条件下每天进行光照6 16小时，直至得到2cm以上 的芽。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征是所述的长鞭红景天芽诱导外植体表面消毒 是先用乙醇漂洗，再用质量浓度为0. 1. 0%的有效氯消毒液浸泡，每5 20分钟更 换1次消毒液，更换1 3次，浸泡总时长为10分钟 40分钟，然后用无菌水冲洗。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征是所述的长鞭红景天芽诱导外植体选自 野生的长鞭红景天的叶片、野生的长鞭红景天的嫩茎、移栽的长鞭红景天的叶片、移栽的长 鞭红景天的嫩茎、长鞭红景天的实生种子苗的子叶、长鞭红景天的实生种子苗的下胚轴中 的一种。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征是所述的长鞭红景天的实生种子苗的子叶是 长鞭红景天的实生无菌种子苗的子叶；所述的长鞭红景天的实生种子苗的下胚轴是长鞭红景天的实生无菌种子苗的下胚轴。
全文摘要
本发明涉及添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基及其制备方法和用途。向配制MS基本培养基的溶液中加入细胞分裂素BAP溶液和生长素NAA溶液，混合均匀，用无机酸或无机碱调节混合液的pH为5.6～5.8，高温湿热灭菌后加入经过滤除菌的二甲基亚砜，混合均匀，得到每升MS基本培养基中含有细胞分裂素BAP的浓度为1μMol·L-1～20μMol·L-1，生长素NAA的浓度为0.1μMol·L-1～5μMol·L-1，二甲基亚砜的浓度为0.001ml·L-1～20ml·L-1。本发明的芽诱导培养基能够作为长鞭红景天芽诱导生长的培养基使用，诱导出的芽形态正常，生长良好，可以正常生根和在大田生长。
文档编号C12N5/04GK101831398SQ20091007948
公开日2010年9月15日 申请日期2009年3月12日 优先权日2009年3月12日
发明者刘春朝, 田春龙 申请人:中国科学院过程工程研究所