专利名称：一种桔青霉菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物及其应用领域，特别是涉及一种新的桔青霉菌株，以及其在生 产纤维素降解酶方面的应用。
背景技术：
纤维质燃料乙醇是第二代燃料乙醇，是一种可再生的清洁能源。而能够产生活性 高、稳定性好的天然纤维素酶的纤维素分解菌是获得纤维质燃料乙醇的关键因素之一。近年研究表明，青霉属(Penicillium)真菌中的一些种类不仅能分泌组成齐全、 酶活较高的木质纤维素降解酶系，还具有易培养和生长快的优势(Herming J0rgensen, etc.2006. Production of cellulases by Penicillium brasilianum IBT 20888-Effect of substrate onhydrolytic performance. Enzyme and Microbial Technology,38 381-390)。桔青霉是一种空气传播的丝状真菌，可产生许多种胞外水解酶，如纤维素酶、淀粉 酶、脂酶和酯酶等，可以降解纤维素、有机磷、芳香烃类石油碳水化合物、淀粉、果胶等物质。关于桔青霉纤维素酶的报道较少。文献(J. Kevin Polman, etc. 1994. Bioconversion of coal, lignin, and dimethoxybenzyl alcohol by Penicillium citrinum. Journal of Industrial Microbiology,13 292~299 ；Tanmay Dutta,etc. 2008. Novel cellulases from an extremophilic filamentous fungiPeniciIlium citrinum production and characterization. J Ind Microbiol Biotechnol. 35 275~282)认为 桔青霉在纤维素分解领域将有着重要的研究应用价值和前景。J. Kevin等1994年报道 了具有煤炭、木质素等降解能力的一株桔青霉菌株(Strain 26)，并研究了其作用特性。 TanmayDutta等2008年报道了产纤维素酶的桔青霉菌株MTCC6489，能够产生耐碱且热稳定 性的纤维素酶，初步结果认为其可能具有大小分别为90KDa和38KDa的两个内切葡聚糖酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种培养周期短，易于扩大培养的纤维素降解酶生产菌；本 发明的直接目的是提供一种新的桔青霉菌株。本发明的另一个目的是提供一种方法，利用该新的桔青霉菌株生产纤维素降解 酶。本发明提供的新菌株是桔青霉(Penicillium citrinum) CR-2，该菌株已于2009 年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3024。本发明所述的桔青霉CR-2的特征为菌株的菌落在PDA平板上起初菌落白色，后变为灰绿色，茸毯状，菌落背面微黄 色。菌丝无色，0.8 1.4iim宽。分生孢子梗短，柱状，有分支，一般长5 15iim，宽 1. 0 1. 5 y m ；分生孢子梗下部不分支，瓶梗多3 5个生于分生孢子梗顶端，密集，3. 1 7. 1 X 1. 6 2. 8 ii m，烧瓶状，近基部最宽，顶部宽0. 5 1. 2 y m ；分生孢子近圆形，分散。见 图1 图4。提取此菌的DNA，以ITS5-ITS4为引物，扩增rDNA的ITS区域(核糖体-DNAITS)。 核糖体-DNAITS序列如SEQ ID NO 1所示。将该序列进行Blast比较，与桔青霉(Penicillium citrinum)仅在ITS1区有仅 3个碱基的差异，相似性大于99%。该菌属青霉属真菌，生长繁殖速度快，可以在短时间内培养出大量、均一的纤维素 降解酶产生菌培养液。该菌还可在短期内(2-3天)形成大量分生孢子。极大地节约了生 产用时间和能源消耗。利用该菌生产纤维素降解酶可以极大地降低生产成本。本发明所述的利用桔青霉CR-2生产纤维素降解酶的方法，是将桔青霉CR-2接种 到液体产酶培养基中培养，得到内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。所述液体产酶培养基包括碳源、氮源、无机盐和水。其中，所述碳源选自下述化合物中一种或几种玉米秸秆、小麦秸秆、甘蔗渣、高粱 秸秆、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、可溶性淀粉、蔗糖；所述氮源选自下述化合物中一种或几种尿素、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、酪蛋白、 牛肉膏；所述无机盐选自KH2P04、MgS04、CaC03,所述KH2P04的终浓度为3. Og/L ；所述MgS04 的终浓度为0. 05g/L ；所述CaC03的终浓度为0. 6g/L ；蒸馏水1000mL。所述水可为蒸馏水、自来水或井水等无污染的清洁水。所述碳源的终浓度优选为23g/L。优选碳源为玉米秸秆粉；所述氮源的终浓度优选为2. 5g/L。优选氮源为硫酸铵。所述无机盐中，MgS04的终浓度优选为0. 05g/L ；K H2P04的终浓度优选为3. 0g/L ； CaC03的终浓度优选为0. 6g/L。所述桔青霉(Penicillium citrinum) CR-2的接种量无特别限制，一般为104 106
个孢子/mL培养基。所述培养温度是25 32°C，优选28 30°C。所述培养方式是可以150 200rpm的转速振荡培养2 7天，也可静置培养3 15天。本申请给出了多种不同条件下，利用桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2生产纤 维素降解酶的实例，详见实施例2 5。由桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2发酵上述培养基得到的发酵制品也属于 本产品的保护范围。所述发酵制品可为发酵产品本身、经稀释过的发酵产品或经纯化的发酵产品；所 述发酵制品可采用颗粒、粉末、片剂等固体外形或是液体、糊状、胶状等流体外形。本发明的桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2的优点如下1、生长繁殖迅速；2、较高的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的生产能力；3、发酵工艺简单、稳定；4、产酶快(摇床培养4天即可达到产酶高峰)、酶活性高分别达到49. 91IU/mL和26. 9IU/ml，较Tanmay等2008报道的同种菌株纤维素酶活高出约20倍。5、成本低廉。因此，桔青霉((Penicillium citrinum))CR-2菌株是理想的研究、改造应用的出 发材料菌株。在纤维素降解酶的生产领域中具有实现其工业化生产的极大可能，并具有广 阔的工农业应用和市场前景。
图 1 为桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2 菌落形态图；图2、图3为桔青霉(Penicillium citrinum) CR-2分生孢子梗形态图；图4为桔青霉(Penicillium citrinum) CR-2菌株刚果红染色NaCl脱色5、图6表示桔青霉(Penicillium citrinum) CR-2菌株产酶进程，图中横座标为 培养天数，纵座标分别为酶活。生物材料保藏信息名称桔青霉(Penicilliumcitrinum)CR-2保藏编号CGMCCNo. 3024保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏时间2009年4月16日。
具体实施例方式以下实施例仅用于举例说明本发明的方法，并不限制本发明的范围。实施例1桔 青霉(Penicillium citrinum)CR-2 的分离筛选培养基PDA综合培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g, KH2P04 3g，Mg S04 1. 5g， VB1 10mg，琼脂20g，水1000ml，pH自然(不控制pH值)。新鲜马铃薯去皮后切成边长0. 5cm 的小方块，加水1000ml，煮沸后再加热10分钟，然后，用四层纱布过滤，得土豆营养液，添加 除VB1外的其他成分，补足水至1000ml，121°C灭菌20min，VB1单独配成溶液用0. 22 y m的 微孔滤膜过滤除菌后加入，使其终浓度为10mg/L，混勻后铺平板或制作斜面培养基。富集培养基:CMCNa 1 % ；K2HP04 0. 1 % ；Na2C 030 . 5 % ；MgS04 7H20 0. 01 % ； FeS04 ‘7H20 0. 015% ；Mn S045X 10-5% ；蛋白胨 1. 0% ；酵母膏 1. 0%，121°C灭菌 20min。灭 菌后铺平板。复筛培养基CMCNa1 % ； (NH4) 2S04 0 . 4% ；K2HP04 0.2% ；MgS04 ‘ 7H20 0. 01 % ； 蛋白胨0. ；酵母膏1.0% ；琼脂粉1.5%，121°C灭菌20min。灭菌后铺平板。桔青霉 (Penicillium citrinum)CR-2 的分离筛选步骤一、分离纯化1、桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2的分离样品取自我国云南某土壤样品，对 采集到的土壤样品采用初筛分离法和复筛分离法相结合的方法进行分离纯化。将采集到 的样品先置于无菌三角瓶中，加入10倍体积无菌水打散均勻后，取5ml悬液加入盛有50ml 富集培养基的三角瓶，在28°C和150r/min下，振荡培养后3 5d，移取5ml培养液至另一 盛有新鲜培养基的三角瓶中继续培养。取富集后的培养液做一系列的稀释梯度100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，分别涂布筛选平板，倒置恒温28°C培养，分离能够旺盛生长菌株。2、将得到的纯菌种转移接种到斜面培养基(PDA综合培养基)上，4°C保存。二、纤维素降解酶产生能力的筛选1、采用刚果红平板脱色法，根据菌株在培养过程中纤维素降解酶类的产生情况， 从中筛选出产酶快，酶活高的菌种。刚果红平板脱色法将培养适当时间的平板，用0. 的刚果红水溶液浸染一段 时间后，再用lmol/L的NaCl水溶液脱色，刚果红将未被降解CMCNa染成红色，而对已被降 解的小分子低聚糖类无作用，因此在产CMCase的菌落周围留下了清晰地透明圈。在刚果红 染色、NaCl脱色后可以观察到菌落周围有明显透明水解圈的菌株为纤维素分解菌。CR-2在培养1天后即产生了明显的脱色圈；培养2天后，CR-2产生了直径约为 3. 0cm的明显脱色圈。生长和脱色情况如图4所示。显然，CR-2不仅生长速度迅速，而且具有迅速强力的纤维素分解能力，说明该菌种 具有快速产生较高活力的纤维素酶力，是纤维素降解酶生产的理想菌种。三、菌种分类地位的鉴定对筛选出的CR-2菌株的表型特征和核酸特征进行系统地鉴定，结果如下培养特征和形态特征为菌落在PDA平板上起初菌落白色，后变为灰绿色，茸毯 状，生长缓慢，一般30°C培养10d直径不超过2cm，菌落背面微黄色。菌丝无色，0. 8 1.4iim宽。分生孢子梗短，柱状，有分支，一般长5 15 iim，宽1.0 1.5 iim;分生孢子梗 下部不分支，瓶梗多3 5个生于分生孢子梗顶端，密集，3. 1 7. 1 X 1. 6 2. 8 y m，烧瓶 状，近基部最宽，顶部宽0. 5 1. m ；分生孢子近圆形，分散。分生孢子形态如图2所示。 提取此菌的DNA，以ITS5-ITS4为引物，扩增rDNA的ITS区域(核糖体-DNA ITS)。序列进 行Blast比较，与Penicillium citrinum相似性大于99%。序列如SEQ ID NO :1所示。实施例2桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2的发酵培养利用桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2生产纤维素酶，包括以下步骤1、桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2 的孢子培养产孢培养基酵母浸粉10g，葡萄糖20g，水1000ml，pH自然，121°C灭菌20min。用接种铲从斜面挖取一块边长为0. 5cm左右的菌丝块接种于产孢培养基平板中， 30°C培养3 4天，即可产生大量绿色孢子。2、发酵生产纤维素降解酶产酶培养基(/L)玉米秸秆粉2. 3%, (NH4)2S04 0. 25%,KH2P04 0. 3%,MgS04.7H20 0. 05%, CaC03 0 . 06%，121°C灭菌 20min，自然 pH 值。内切葡聚糖酶活性(羧甲基纤维素酶活(CMCase))的测定方法DNS法——参 照 Hardin M T, Mitchell D A, Howes T. 2006. Approach to designing rotating drum bioreactors forsolid-state fermentation on the basis of dimensionless design factors[J], Biotechnol, Bioeng. 67(3) :274_282 禾口 Ghose T K, 1987. Measurement of celluloseactivities[J]. Pure and Apple. Chem. 59(2) :257_268.在容积为25ml的试管中，加入1ml适当稀释的酶液于50°C恒温水浴中预热2min。 加入3ml pH4. 8的0. 5% CMCNa溶液。50°C恒温水浴准确反应30min。加入1ml浓度为 Imol/LNaOH溶液，摇勻，终止反应。加入3ml DNS试剂，同时于沸水浴中准确反应5min。用流动的冷水终止反应。离子水定容至25ml，于540nm处测定光吸收值。对照标准曲线后测算酶活力。在上述条件下，酶活力按国际单位规定定义每分 钟催化纤维素水解生成lumol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位IU(IU/ml)。以上酶活力均 扣除发酵液中的糖含量，以葡萄糖作标准溶液，以每分钟生成1 P g葡萄糖作为一个酶活单 位。外切葡聚糖酶活性(滤纸酶活(FPA))测定方法DNS法——参照Taillisz P， etc. 1989. Enhanced cellulose fermentation by an asprogenous and ethanol~to1erant mutant ofClostridium ermocellum[J]. Appl, Environ. Microbiol. 55 :207_211.在容积为25ml的试管中，加入lcmX 6cm的whatman NO. 1滤纸条和1ml的 0. 05MpH4. 8柠檬酸缓冲液；加入0. 5ml适当稀释的酶液，50°C恒温水浴反应lh ；加入 3mlDNS试剂，同时于沸水浴中准确反应5min ；用流动的冷水终止反应；用离子水定容至 25ml，于540nm处测定光吸收值。对照标准曲线后测算酶活力。在上述条件下，酶活力按国际单位规定定义每分 钟催化纤维素水解生成lumol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位IU(IU/ml)。以上酶活力均 扣除发酵液中的糖含量，以葡萄糖作标准溶液，以每分钟生成1 P g葡萄糖作为一个酶活单 位。按步骤1培养孢子，用无菌水将孢子洗下，用血球计数法计数后用无菌水调整孢 子浓度，使每毫升孢子悬液中含有约2. 5X107个孢子，然后接种0. 5mL孢子悬液入50mL产 酶培养基中(装在250mL三角瓶中)，使接种的孢子终浓度2. 5X 105个/mL培养基，30°C 静置培养7天。发酵结束后测定发酵液中CMCase的活性为36. 71IU/ml, FPA的的活性为 19.13IU/ml。实施例3 桔青霉(PeniciIlium citrinum)CR-2 的发酵生产(一)利用桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2生产纤维素内切葡聚糖酶，包括以下步 骤1、桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2 的孢子培养同实施例2。2、发酵生产纤维素降解酶产酶培养基配方和内切葡聚糖酶活性、外切葡聚糖酶活性的测定方法同实施例2。 按实施例2的方法和浓度接种孢子悬液入200mL产酶培养基中，30°C，200rpm培养5天，测 定发酵液中CMCase的最高活性为49. 91IU/ml, FPA的的最高活性为26. 9IU/ml (如下图所 示)°实施例4 桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2 的发酵生产(二 )利用桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2生产纤维素降解酶，包括以下步骤1、桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2 的孢子培养同实施例2。2、发酵生产纤维素降解酶产酶培养基(/L)小麦秸秆粉2.3%，(NH4)2S04 0. 25 %, K H2 P04 0.3 %, MgS04 7H20 0. 05%, CaC03 0 . 06%，121°C灭菌 20min，，自然 pH 值。内切葡聚糖酶活性和外切葡聚糖酶活性的测定方法同实施例2。按实施例2的方法和浓度接种孢子悬液入200mL产酶培养基中，30°C，200rpm培养5天，测定发酵液中 CMCase的最高活性为47. 93IU/ml, FPA的的最高活性为23. 73IU/ml (见图5、图6)。实施例5桔青霉(PeniciIlium citrinum) CR-2的发酵生产(三)利用桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2生产纤维素降解酶，包括以下步骤1、桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2 的孢子培养同实施例2。2、发酵生产纤维素降解酶产酶培养基(/L)高粱秸秆粉2.3%，(NH4)2S04 0. 25 %, K H2 P04 0.3 %, MgS04 7H20 0. 05%, CaC03 0 . 06%，121°C灭菌 20min，自然 pH 值。内切葡聚糖酶活性和外切葡聚糖酶活性的测定方法同实施例2。按实施例2的 方法和浓度接种孢子悬液入200mL产酶培养基中，30°C，200rpm培养5天，测定发酵液中 CMCase的最高活性为43. 92IU/ml, FPA的的最高活性为21. 71IU/ml。实施例6桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2的发酵生产(四)利用桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2生产纤维素降解酶，包括以下步骤1、桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2 的孢子培养同实施例2。2、发酵生产纤维素降解酶产酶培养基(/L)蔗渣2. 1 %, (NH4)2S04 0. 25 %, K H2 P04 0.3 %, MgS04 7H200. 05%, CaC03 0 . 06%，121°C灭菌 20min,自然 pH 值。内切葡聚糖酶活性和外切葡聚糖酶活性的测定方法同实施例2。按实施例2的 方法和浓度接种孢子悬液入200mL产酶培养基中，30°C，200rpm培养5天，测定发酵液中 CMCase的最高活性为45. 63IU/ml, FPA的的最高活性为22. 73IU/ml。SEQUENCE LISTING<110>中国农业科学院作物科学研究所<120> 一种桔青霉菌株及其应用<160>1<170>PatentIn version 3. 1 <210>1
<211>520<212>DNA<213> 桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2
<400>1
GGGCCCTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGTTGCCCGAACCTATGTTGCC TCGGCGGGCC60
CCGCGCCCGCCGACGGCCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGTTGCAGTCTGAG ACCTATAACG120
AMTTAGTTAMACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGA AGAACGCAGC180
GMATGCGATMCTAATGTGMTTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCT TTGMCGCAC240
ATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCT GCCCTCMGC300
CCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCCCGCCGGGGGGACGGGCCCGAA AGGCAGCGGC360
GGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTAGT AGGCCCGGCC420
GGCGCCAGCCGACCCCCAACCTTTAATTATCTCAGGTTGACCTCGGATCA GGTAGGGATA480
CCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAMCGG ATGAATACCG520
权利要求
桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2CGMCC 3024。
2.权利要求1所述的桔青霉，其特征在于其菌株的核糖体-DNAITS序列如SEQ IDNO 1所示。
3.用权利要求1或2所述的桔青霉生产纤维素降解酶的用途。
4.一种生产纤维素降解酶的方法，将桔青霉CR-2CGMCC 3024接种到液体产酶培养基 中培养，得到内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。
5.权利要求4所述的方法，所述液体产酶培养基包括碳源、氮源、无机盐和水。
6.权利要求5所述的方法，所述碳源选自玉米秸秆、小麦秸秆、甘蔗渣、高粱秸秆、微晶 纤维素、羧甲基纤维素钠、可溶性淀粉或蔗糖中一种或几种；所述氮源选自尿素、蛋白胨、酵 母粉、硫酸铵、酪蛋白或牛肉膏中一种或几种；所述无机盐选自KH2P04、MgSO4或&0)3。
7.权利要求5所述的方法，所述碳源选自玉米秸秆粉、小麦秸秆粉、甘蔗渣、高粱秸秆 粉中一种或几种，终浓度为23g/L ；所述氮源为硫酸铵，终浓度为2. 5g/L。
8.权利要求6所述的方法，所述MgSO4的终浓度为0.05g/L ；KH2PO4的终浓度为3. Og/ L ；CaCO3的终浓度为0. 6g/L。
9.权利要求4所述的方法，所述桔青霉的接种量为IO4 IO6个孢子/mL培养基，培养 温度是25°C 32°C，振荡培养2 7天或静置培养3 15天。
10.用权利要求1或2所述的桔青霉得到的发酵培养制品。
全文摘要
本发明涉及桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2CGMCC 3024及其应用。该菌为青霉属真菌，培养周期短，生长繁殖速度快，可以在短时间内培养出大量、均一的纤维素降解酶产生菌培养液。本发明还提供利用该菌株在液体产酶培养基中发酵培养生产内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的方法，可在短时间内生产较高活力的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，且其发酵工艺简单、稳定、成本低廉、产量高。
文档编号C12N1/14GK101864366SQ20091008221
公开日2010年10月20日 申请日期2009年4月20日 优先权日2009年4月20日
发明者张保明, 曲小爽, 李桂英, 路明, 顿宝庆 申请人:中国农业科学院作物科学研究所