经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞，其制法、应用、试剂盒及包括其的疫苗的制作方法

专利名称：：经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞，其制法、应用、试剂盒及包括其的疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及树突状细胞及其制备方法、该树突状细胞在制备抗肿瘤药物中的应用、制备该树突状细胞的试剂盒，以及包括该树突状细胞的疫苗。特别地，本发明涉及经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞及其制备方法、该经耐受性筛选的肺瘤干细胞抗原负载的树突状细胞在制备抗肿瘤药物中的应用、制备该经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的试剂盒，以及包括该经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的疫苗。
背景技术：
：目前肿瘤的治疗方法包括手术治疗、放射治疗和化疗。但现有的肿瘤治疗方法不能根治肿瘤。主要原因是构成肿瘤的细胞中含肿瘤干细胞，其具有干细胞的生物学特性，即自我更新、多潜能分化、高耐受性(例如对化疗药物的高耐药性及对放射治疗的高耐辐射性)及极少数的肺瘤千细胞还驱动肿瘤的形成。因此肿瘤干细胞是肿瘤发生和发展(肿瘤的生长、肿瘤产生耐受性、肿瘤复发和肿瘤转移等)的真正元凶。现有技术已尝试使用树突状细胞免疫治疗方法来治疗癌症，即从患者肿瘤中将肿瘤干细胞分离出来，通过裂解该肿瘤干细胞得到抗原，并将该抗原负载到患者的树突状细胞上。如此得到的靶向肿瘤干细胞的树突状细胞，可以用于治疗癌症。例如WO2008/039874中公开了从脑肿瘤中分离出干细胞样胂瘤细胞(stem-likecell),然后将由其制备得到的抗原负载到树突状细胞上，并用所得树突状细胞治疗癌症的方法。现有技术仅公开了如何得到相关胂瘤千细胞，但并未教导对获取的肿瘤干细胞进行处理。并且，现有技术的上述方法虽然以肿瘤干细胞为靶标，但是该方法仍然存在肿瘤在放疗和化疗后耐药性、复发率和转移率高的问题
发明内容为了克服现有以普通胂瘤千细胞为靶标的癌症免疫治疗方法仍然存在肿瘤在放疗和化疗后耐药、复发和转移的问题，本发明的目的是提供一种经耐受性筛选的胂瘤干细胞抗原负载的树突状细胞及其制备方法、该经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞在制备抗肿瘤药物中的应用、制备该经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的试剂盒，以及包括该经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的疫苗。现有技术认为经射线照射和/或与大剂量化疗药物接触后，肿瘤干细胞会被全部杀死，但是本发明的发明人意外地发现，在一定范围内经射线照射和/或与大剂量化疗药物接触后，肿瘤干细胞不但不会被完全杀死，而且还会产生具有很强耐受性的肿瘤干细胞。一般剂量的射线照射和/或化疗药物很难杀灭所述经耐受性筛选的肿瘤干细胞。本发明提供了一种经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的制备方法，该方法包括通过裂解经耐受性筛选的肺瘤千细胞得到肿瘤干细胞抗原组合物，将树突状细胞与经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原组合物接触得到负载肿瘤抗原的抗癌树突状细胞，其中，所述经耐受性筛选的肿瘤干细胞通过以下方法制备，该方法包^r:对肿瘤干细胞进行射线照射和/或化疗药物筛选的步骤，所述射线照射筛选通过将肿瘤干细胞暴露于射线的照射源下完成，所述射线选自由X射线、P射线、a射线和Y射线所组成的组中，所述化疗药物筛选通过使胂瘤千细胞与化疗药物接触完成，所述化疗药物选自由烷化剂化疗药物、亚硝脲化疗药物、抗代谢化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌药物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、植物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、曱基千肼、氮烯咪胺、顺铂、卡铂、草酸铂、丙亚胺和羟基脲所组成的組中。本发明还提供了由上述的方法得到的经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞。本发明还提供了一种经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞为本发明所述的经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞。本发明还提供了本发明的经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了一种制备本发明的经耐受性筛选的肿瘤千细胞抗原负载的树突状细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括1)肿瘤干细胞基础培养基；2)放射治疗同位素源和/或化疗药物；3)消化细胞的酶；4)B27、N2、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素的至少一种；5)树突状细胞基础培养基；6)巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子；7)白介素-4、千扰素a和肿瘤坏死因子a的至少一种；以及6)使用"i兌明书；其中，所述》文射治疗同位素源选自由X射线、p射线、a射线和Y射线所组成的组中，所述化疗药物选自由烷化剂化疗药物、亚硝脲化疗药物、抗代谢化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌药物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、植物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、曱基节肼、氮烯咪胺、顺铂、卡铂、草酸铂、丙亚胺和羟基脲所组成的组中；所述使用说明书包括本发明所述的树突状细胞的制备方法。由于本发明的肿瘤干细胞经过了射线照射和/或化疗药物的筛选，由此得到的肿瘤干细胞产生了与肿瘤干细胞不同的变化(比如特异表达了许多不同于肿瘤干细胞的蛋白)，更接近接受过放疗和/或化疗的肿瘤内的肿瘤千细胞，因此，由本发明提供的经耐受性筛选的肿瘤干细胞以及由该经耐受性筛选的肿瘤干细胞得到的抗原组合物制备的药物，能够在体内和体外杀死引起肿瘤复发的肺瘤干细胞，从而为胂瘤的根治提供了可能。图1为制备例1的脑胶质瘤干细胞经Y射线辐射筛选后的存活率曲线；图2为制备例5的肺癌干细胞经Y射线辐射筛选后的存活率曲线；图3为重复制备例1的脑胶质瘤干细胞经9Gy的Y射线辐射筛选后的存活率曲线；图4显示脑胶质瘤千细胞经射线照射和化疗药物筛选后耐受性蛋白表达western印迹照片；图5显示了制备例1脑胶质瘤千细胞、制备例3的乳腺癌干细胞和制备例6的肝癌干细胞经射线照射和化疗药物筛选后耐受性蛋白RT-PCR后表达电泳照片；图6:经耐受性筛选的乳腺癌干细胞抗原负载树突状细胞，流式细胞仪检测负载DC表型变化情况。图7显示了由表8所示经射线照射和化疗药物筛选后的制备例1、经总剂量为9Gy、剂量率为200cGy/min和距离为50cm的射线照射筛选的制备例5以及表4所示经化疗药物筛选后的制备例6所得抗原组合物负载树突状细胞，得到细胞毒性T淋巴细胞(CTL),由该CTL细胞产生的对相应肺瘤干细胞的应答结果；图8显示了由表8所示经射线照射和化疗药物筛选后的制备例2和未经筛选的制备例2所得两种抗原组合物分别负载树突状细胞，得到两种细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，由该两种CTL细胞分别对经射线照射和化疗药物筛选的以及未经射线照射和化疗药物筛选的乳腺癌干细胞产生的应答结果对比图。具体实施例方式本发明提供了一种经耐受性筛选的肿瘤干细胞的制备方法，其中，该方法包括对肿瘤干细胞进行射线照射和/或化疗药物筛选的步骤，所述射线照射筛选通过将肿瘤千细胞暴露于射线的照射源下完成，所述射线选自由X射线、P射线、a射线和Y射线所组成的组中，所述化疗药物筛选通过使肿瘤干细胞与化疗药物接触完成，所述化疗药物选自由烷化剂化疗药物、亚硝脲化疗药物、抗代谢化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌药物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、植物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、曱基节肼、氮烯咪胺、顺铂、卡柏、草酸柏、丙亚胺和羟基脲所组成的组中。其中，Gy为射线照射的总剂量单位，1Gy-100md，cGY为组织吸收放射线的剂量单位，lcGy=lrad,即lGy=100rad=100cGy。所述剂量率是指射线照射的速度，cGy/min为剂量率的单位。射线照射的时间=总剂量/剂量率。优选地，所述射线照射的照射源与肿瘤干细胞的直线距离为10cm-5m，所述射线照射的总剂量为2Gy-10Gy，所述射线照射的剂量率为0.4-1200cGy/min。更优选所述射线照射的照射源与肿瘤干细胞的直线距离为20cm-2m,所述射线照射的总剂量为3Gy-9Gy，所述射线照射的剂量率为2-600cGy/min。优选地，本发明所述射线可以为X射线和/或Y射线。所述射线可以由各种常用的放射治疗同位素金属提供，例如Co60、Irl92、Cs-137、Am-241及Se75能够放出Y射线等。优选地，所述化疗药物在肿瘤干细胞培养基中的终浓度范围可以为0.1-100mg/mL,所述化疗药物与肿瘤干细胞接触的时间为lh-72h。更优选所述化疗药物在肿瘤干细胞培养基中的终浓度范围为0.5-50mg/mL，所述化疗药物与肿瘤干细胞接触的时间为12h-36h。接触时间过长或化疗药物剂量过大，会杀死所有肿瘤干细胞，从而得不到具有经耐受性筛选的的肿瘤千细胞；反之，起不到筛选肿瘤干细胞的作用。本发明可以使用现有的任何化疗药物完成对肿瘤干细胞的筛选。优选所述烷化剂化疗药物选自由氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、氮曱、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥和漆替派所组成的组中；所述亚硝脲类化疗药物选自由卡氮芥、环已亚硝脲、曱环亚硝脲、嘧啶亚硝脲、白消安和雌二醇氮芥所组成的组中；所述抗代谢药化疗药物选自由曱氨喋呤、氟尿嘧啶、喃氟啶、优福啶、卡莫氟、脱氧氟尿苷、氟尿脱氧核苷、环胞苷、阿糖胞苷和双氟胞苷所组成的组中；所述抗生素化疗药物选自由放线菌素D、丝裂霉素、博来霉素、平阳霉素、阿霉9素、吡喃阿霉素、表-阿毒素、去甲氧柔红霉素和米托蒽醌所组成的组中；所述植物化疗药物选自由长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞宾、鬼臼乙叉戒、鬼臼噻吩甙、羟基喜树碱、伊立替康、托泊替康、紫杉醇、泰素帝、三尖杉酯碱和羟基紫杉醇所组成的组中；所述激素及内分泌药物化疗药物选自由泼尼松、地塞米松、丙酸睾丸素、乙烯雌酚、氟硝丁酰胺、孕酮、曱地孕酮、他莫昔芬、雌激素受体拮抗剂、托瑞米芬、氨鲁米特、福美司坦、来曲唑和促性腺激素释放激素拮抗剂所组成的组中；所述抗体阻断剂化疗药物选自由表皮生长因子抑制剂吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔单抗和尼妥珠单抗所组成的组中。最优选，所述化疗药物选自由4-羟-环磷酰胺、吉非替尼、厄洛替尼、五氟尿嘧啶、阿霉素、紫杉醇和顺铂所组成的组中。本发明提供的经耐受性筛选的肿瘤干细胞的制备方法可以仅包括对肿瘤干细胞进行射线照射筛选的步骤，而不包括化疗药物筛选的步骤。在此情况下，所述射线照射的照射源与肿瘤干细胞的直线距离优选为20cm-2m，所述射线照射的总剂量优选为3Gy-9Gy，所述射线照射的剂量率优选为2-600cGy/min;进一步优选所述射线照射的照射源与肿瘤干细胞的直线距离为50cm-lm，所述射线照射的总剂量为6Gy-9Gy，所述射线照射的剂量率为2-200cGy/min。本发明提供的经耐受性筛选的肿瘤干细胞的制备方法可以仅包括对肿瘤干细胞进行化疗药物筛选的步骤，而不包括射线照射筛选的步骤。在此情况下，优选所述化疗药物在肿瘤干细胞培养基中的终浓度范围为0.5-50mg/mL，所述化疗药物与肿瘤干细胞接触的时间为12-36h;进一步优选所述化疗药物在肿瘤干细胞培养基中的终浓度范围为0.5-20mg/mL，所述化疗药物与肿瘤干细胞接触的时间为12-24h。更优选地，本发明提供的经耐受性筛选的肿瘤干细胞的制备方法包括对肿瘤干细胞进行射线照射和化疗药物筛选的步骤，在此情况下，所述射线照射的照射源与肿瘤干细胞的直线距离为20cm-2m,所述射线照射的总剂量为3Gy-9Gy，所述射线照射的剂量率为2-600cGy/min，所述化疗药物在肿瘤干细胞培养基中的终浓度范围为0.5-50mg/mL,所述化疗药物与肿瘤干细胞接触的时间为12-36h;进一步优选所述射线照射的照射源与肿瘤干细胞的直线距离为50cm-lm，所述射线照射的总剂量为6Gy-9Gy，所述射线照射的剂量率为2-200cGy/min,所述化疗药物在肿瘤干细胞培养基中的终浓度范围为0.5-20mg/mL，所述化疗药物与肿瘤干细胞接触的时间为12-24h。此外，进一步优选所述射线照射的照射源及所述化疗药物与患者接受的射线照射和/或化疗药物相同。本发明适用于所有能够从中分离出肿瘤干细胞的各种肿瘤。例如，所述肿瘤可以选自由乳腺癌、胶质瘤、肺癌、脑癌、鼻咽癌、肝细胞癌、胃癌、结肠癌、黑素瘤、骨肉瘤、肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、急性骨髓白血病、多发性骨髓瘤胰腺癌和转移瘤性癌所组成的组中。其中，所述转移瘤性癌可以选自脑部转移瘤、肺部转移瘤、肝部转移瘤和颈部转移瘤所组成的组中。所述方法还包括从离体肿瘤组织和/或肿瘤细胞系中分离肺瘤干细胞。手术从患者体内取出的肿瘤组织，属于废弃的离体肿瘤组织。本发明可以适用常规的方法得到肺瘤细胞，并从中分离出肿瘤干细胞(参见WO2008/039874)。此外，由现有商业上能够买到的细胞系培养物也能从中分离出相应的肿瘤干细胞。例如，下表1列出的就是可以从美国典型物保藏中心(ATCC)买到、并且能够从中分离出相应的肿瘤肝细胞的细胞抹系。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本发明还提供了由上述的方法得到的肿瘤干细胞。肿瘤干细胞在经过本发明的筛选后，所述肿瘤干细胞的所表达的蛋白发生了变化。例如，所述肿瘤干细胞特异表达选自由表皮生长因子受体、p-糖蛋白、多药耐药相关蛋白、共济失调毛细血管扩张症突变基因编码的蛋白、共济失调毛细血管扩张症Rad3相关蛋白和低氧诱导因子所组成的组中的蛋白。反过来，通过检测这些蛋白的在筛选前后的变化，可以检测出所述筛选过程是否成功。子标志，如白血病干细胞的表面标志为CD34+/CD38-,乳腺癌干细胞的标志为CD44+/CD24-,神经胶质瘤干细胞和黑素瘤的标志为CD133+。本发明的方法可以采用现有的侧群(Sidepopulation,SP)方法富集肿瘤细胞系中肿瘤干细胞样的细胞。SP细胞是细胞群体中极少的一部分，它们可将进入细胞核的荧光染料排出胞外，在荧光显微镜下观察或流式细胞检测时表现为不着色，故称为SP细胞。SP细胞表达肿瘤干细胞相关的分子标志，如nestin、CD90、CD44、Musashi-1(Msi-1)、母体胚胎亮氨酸拉链激酶(maternalembryomicleucinezipperkinase，MELK)、神经月交质细月包瘤相关抗原-1(glioma-associatedantigen-l，Gli-1)基质细胞衍生因子、B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1(B-cell-specificMoloneyleukemiavirusinsertionsite-1，Bmi-1)、斑紋基因同源物PTCH、磷酸丝氨酸磷酸化酶(phosphoserinephosphatase,PSP)、乳腺癌抗药蛋白1(Breastcancer-resistantprotein1，BCRP1)、06-甲基鸟嘌呤掘A曱基转移酶(06-methylguanine-DNAmethyltransferase，MGMT)，基质细胞衍生因子受体(CXCR4)、整联蛋白(integrin)、表皮生长因子受体(EGFR)、存活素(survivin)、核干细胞因子(nucleostemin，NS)等。月中瘤千细胞通常借用正常干细胞标志和/或胂瘤细胞标志进行检测。例如NS可确定细胞分化程度，是干细胞标志的重要核蛋白。此外，肿瘤干细胞常表现出基因组不稳定性，经放射治疗和/或化疗药物后，尽管可消灭绝大多数肿瘤细胞，使瘤体变小甚至消失，但是残留的极少数肿瘤细胞可能已被赋予干细胞样的生物学特性，易发生恶性突变，产生药物抵抗和放射抵抗。本发明还4是供了一种肿瘤干细胞抗原組合物的制备方法，该方法包括用生理盐水洗涤并重悬肿瘤干细胞，然后裂解肿瘤干细胞的步骤，其中，所述肿瘤千细胞本发明的肿瘤干细胞。所述生理盐水的洗涤次数可以通过测定洗出液中残留的培养基组分来决定。将本发明的肿瘤干细胞抗原组合物在注射给患者时残留的培养基组分以及可能残留的化疗药物不会引起患者不适即可。裂解本发明的肿瘤干细胞可以使用本领域常规的各种裂解方法实现。出于不在裂解肿瘤干细胞后增加新的物质的考虑，优选所述裂解肿瘤干细胞的步骤包括热休克和/或反复冻融；所述热休克裂解的条件包括在3745'C下保持lh-6h，优选包括在3843。C下保持2h-4h;所述反复冻融的次数为3-5次，每两次的间隔时间是10min-2h,优选为30min-lh，所述冷冻的温度范围是零下120。C-零下196。C(可以使用液氮、干冰等来实现)，优选零下15(TC-零下196°C，所述融化的温度范围是10°C-37°C,优选为2(TC-37°C。由于经热休克后，本发明的肿瘤干细胞会产生热休克蛋白，裂解后仍然存在所述热休克蛋白。热休克蛋白的存在有助于负载后的树突状细胞免疫应答。因此，更优选所述裂解肿瘤干细胞的步骤包括热休克和反复冻融；所述热休克裂解的条件包括在37-45。C下保持lh-6h;所述反复冻融的次数为3-5次两次的间隔时间是10min-2h,所述冷冻的温度范围是零下120。C-零下196°C，所述融化的温度范围是20。C-37。C。裂解完成后，通常通过离心和过滤的步骤除去裂解液中过大的细胞碎片，例如，通过600rpm离心lmin除去，然后上清用0.45pm滤膜过滤。所述组合物的基本成分包括生理盐水。裂解得到的本发明的抗原组合物可以在-80'C中保存。本发明还提供了本发明的经耐受性筛选的肿瘤千细胞以及本发明的肿瘤干细胞抗原组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了一种制备本发明的经耐受性筛选的肿瘤干细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括1)肿瘤干细胞基础培养基；2)放射治疗同位素源和/或化疗药物；3)消化细胞的酶；4)细月包因子以及；5)使用说明书；其中，所述》文射治疗同位素源选自由X射线、p射线、a射线和Y射线所组成的组中，所述化疗药物选自由烷化剂化疗药物、亚硝脲化疗药物、抗代谢化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌药物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、植物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、曱基苄肼、氮烯咪胺、顺铂、卡铂、草酸铂、丙亚胺和羟基脲所组成的组中；所述使用说明书包括制备本发明的经耐受性筛选的肿瘤干细胞方法。其中，所述肿瘤干细胞基础培养基可以是本领域任何能够用于培养肿瘤干细胞的培养基，例如DMEM/F12等。所述肿瘤干细胞培养体系包括肿瘤干细胞和3mL-50mL的肿瘤干细胞基础培养基，在37。C、5%(:02培养箱中培养。所述放射治疗同位素源可以实现与肿瘤干细胞的直线距离为1Ocm-5m、射线照射的总剂量为2Gy-10Gy以及所述射线照射的剂量率为0.4-1200cGy/min。所述化疗药物能够提供上述本发明的方法所限定的有关化疗药物条件，例如以终浓度0.5-20mg/mL处理12-24h等。所述消化细胞的酶可以为本领域常规的消化细胞的酶，优选为胰酶和/或阿尤替酶。其中，在肿瘤干细胞基础培养基达3mL-50mL的时，所述胰酶和/或阿尤替酶(Accutase)优选作为肿瘤组织分离肿瘤千细胞所4吏用试剂，可以使用本领域常规的用量，例如一般用量为1倍浓度的0.5mL-lOmL来消化细胞，即动物血清与消化细胞的酶液的体积比为1:l至l:5。所述细胞因子选自由B27、N2、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素所组成的组中。其中，所述B27在培养肿瘤干细胞时，向肿瘤千细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为2ng/mL-50ng/mL。所述N2在培养肿瘤干细胞时，向肿瘤干细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为2ng/mL-50ng/mL。其中所述B27和N2是商业上可供的细月包培养添加剂(即细月包因子)，例如，美国biotech^^司、美国Gibco^A司生产的B27和N2。所述表皮细胞生长因子在培养肿瘤干细胞时，向肿瘤千细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为5ng/mL-100ng/mL。所述碱性成纤维细胞生长因子在培养肿瘤干细胞时，向肿瘤干细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为5ng/mL-100ng/mL。所述胰岛素在培养肿瘤干细胞时，向肿瘤千细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为lmg/mL画50mg/mL。所述试剂盒还可以包括非必要的动物血清。所述动物血清可以是人血清。所述血清可以作为消化酶的终止剂，其用量为现有技术中作为消化酶终止剂的常规用量，例如，与消化细胞的酶液相当O.lmL-lOmL,即动物血清与消化细胞的酶液的体积比为1:l至l:5。本发明还提供了一种制备本发明所述的肿瘤干细胞抗原组合物的试剂盒，其中，所述试剂盒包括1)肿瘤干细胞基础培养基；2)力文射治疗同位素源和/或化疗药物；3)消化细胞的酶；4)细月包因子；以及5)使用说明书；其中，所述放射治疗同位素源选自由X射线、(3射线、a射线和Y射线所组成的组中，所述化疗药物选自由烷化剂化疗药物、亚硝脲化疗药物、抗代谢化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌药物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、植物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、曱基苄肼、氮烯咪胺、顺铂、卡铂、草酸铂、丙亚胺和羟基脲所组成的组中；所述使用说明书包括制备本发明所述的肿瘤干细胞抗原组合物所述的方法。其中，所述肿瘤干细胞基础培养基可以是本领域任何能够用于培养肿瘤干细胞的培养基，例如DMEM/F12等。所述肺瘤干细胞培养体系包括肿瘤干细胞和3mL-50mL的肿瘤干细胞基础培养基，在37。C、5%(:02培养箱中培养。所述放射治疗同位素源可以实现与肿瘤干细胞的直线距离为10cm-5m、射线照射的总剂量为2Gy-10Gy以及所述射线照射的剂量率为0.4-1200cGy/min。所述化疗药物能够提供上述本发明的方法所限定的有关化疗药物条件，例如以终浓14度0.5-20mg/mL处理12-24h等。所述消化细胞的酶可以为本领域常规的消化细胞的酶，优选为胰酶和/或阿尤替酶。其中，在肿瘤干细胞基础培养基达3mL-50mL的时，所述胰酶和/或阿尤替酶(Accutase)优选作为肿瘤组织分离肺瘤干细胞所〗吏用试剂，可以使用本领域常规的用量，例如一般用量为1倍浓度的0.5mL-lOmL来消化细胞。所述细胞因子选自由B27、N2、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素所组成的组中。其中，所述B27在培养肿瘤干细胞时，向肿瘤干细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为2ng/mL-50ng/mL。所述N2在培养肿瘤干细胞时，向肿瘤干细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为2ng/mL-50ng/mL。所述表皮细胞生长因子在培养肿瘤干细胞时，向肿瘤干细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为5ng/mL-1OOng/mL。所述碱性成纤维细胞生长因子在培养胂瘤干细胞时，向肿瘤干细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为5ng/mL-lOOng/mL。所述胰岛素在培养肿瘤干细胞时，向肿瘤干细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为lmg/mL画50mg/mL。所述试剂盒还可以包括非必要的动物血清。所述动物血清可以是人血清和/或牛血清。所述血清可以作为消化酶的终止剂，其用量为现有技术中作为消化酶终止剂的常规用量，例如，与消化细胞的酶液相当O.lmL-lOmL，即动物血清与消化细胞的酶液的体积比为1:1至1:5。所述组合物来自细胞浓度为lxl()S到lxl()S细胞/mL、优选为lxl(^到5xl07细胞/mL的本发明的肿瘤干细胞。细胞浓度过大可能会引起患者过度的免疫应答反应，反之细胞浓度过小，则不足以引起患者的免疫应答反应。所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基准，所述人血白蛋白的含量为1-5重量体积％，优选为2-3重量体积％。本发明还提供了一种抗癌树突状细胞的制备方法，该方法包括将正常树突状细胞与肿瘤干细胞抗原组合物接触，得到负载肿瘤干细胞抗原的树突状细胞，其中，所述肿瘤干细胞抗原组合物为本发明所述的肿瘤千细胞抗原组合物。优选所述正常树突状细胞与制备胂瘤干细胞抗原组合物的肿瘤干细胞来自同一个体。这样可以最大限度地避免由于免疫排斥反应而引起的副作用。其中在裂解肿瘤干细胞制备被负载的所述抗原组合物前，所述肿瘤干细胞经用于培养树突状细胞的培养基洗涤三次。所述树突状细胞负载肿瘤干细胞抗原时，正常树突状细胞与肿瘤干细胞抗原组合物接触的时间可以是本领域常规使用的任意的接触时间，优选是l-24h,更优选是2-12小时。本发明还提供了由上述的方法得到的抗癌树突状细胞。本发明还提供了一种树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，其中，所述树突状细胞为本发明的抗癌树突状细胞。在制备树突状细胞疫苗之前，用生理盐水洗涤并重悬所述抗癌树突状细胞。所述生理盐水的洗涤次数可以通过测定洗出液中残留的培养基组分来决S的化疗药物不会引起患者不适即可:所i组合物包括lxl^到5xl07;/mL本发明的抗癌树突状细胞；优选为5xl()S到lxlO卩个/mL。所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基准，所述人血白蛋白的含量为1-5重量体积％，优选为2-3重量体积％。本发明还提供了本发明的抗癌树突状细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了一种制备本发明所述的抗癌树突状细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括1)肿瘤干细胞基础培养基；2)放射治疗同位素源和/或化疗药物；3)消化细胞的酶；4)B27、N2、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素的至少一种；5)树突状细胞基础培养基；6)巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子；7)白介素-4、千扰素a和肿瘤坏死因子a的至少一种；以及6)使用说明书；其中，所述放射治疗同位素源选自由X射线、P射线、a射线和Y射线所组成的组中，所述化疗药物选自由烷化剂化疗药物、亚硝脲化疗药物、抗代谢化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌药物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、植物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、曱基千肼、氮烯咪胺、顺铂、卡铂、草酸铂、丙亚胺和羟基脲所组成的组中；所述使用说明书包括本发明制备所述抗癌树突状细胞的方法。其中，所述肿瘤干细胞基础培养基可以是本领域任何能够用于培养肿瘤干细胞的培养基，例如DMEM/F12等。所述肿瘤干细胞培养体系包括肿瘤干细胞和3mL-50mL的肿瘤干细胞基础培养基，在37。C、5%(302培养箱中培养。所述放射治疗同位素源可以实现与肿瘤干细胞的直线距离为1Ocm-5m、射线照射的总剂量为2Gy-10Gy以及所述射线照射的剂量率为0.4-1200cGy/min。所述化疗药物能够提供上述本发明的方法所限定的有关化疗药物条件，例如以终浓度0.5-20mg/mL处理12-24h等。所述消化细胞的酶可以为本领域常规的消化细胞的酶，优选为胰酶和/或阿尤替酶。其中，在肿瘤千细胞基础培养基达3mL-50mL的时，所述胰酶和/或阿尤替酶(Accutase)优选作为钟瘤组织分离肿瘤干细胞所使用试剂，可以使用本领域常规的用量，例如一般用量为1倍浓度的0.5mL-10mL来消化细胞，即动物血清与消化细胞的酶液的体积比为1:l至l:5。其中，所述B27在培养肺瘤干细胞时，向肿瘤干细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为2ng/mL-50ng/mL。所述N2在培养肿瘤干细胞时，向肿瘤干细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为2ng/mL-50ng/mL。所述表皮细胞生长因子在培养肿瘤干细胞时，向肿瘤干细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为5ng/mL-100ng/mL。所述碱性成纤维细胞生长因子在培养肿瘤干细胞时，向胂瘤干细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为5ng/mL-100ng/mL。所述胰岛素在培养肿瘤干细胞时，向肿瘤干细胞基础培养基(例如DMEM/F12)中添加，达终浓度为lmg/mL誦50mg/mL。所述试剂盒还可以包括非必要的动物血清。所述动物血清可以是人血清。所述血清可以作为消化酶的终止剂，其用量为现有技术中作为消化酶终止剂的常规用量，例如，与消化细胞的酶液相当0.1mL-1OmL，即动物血清与消化细胞的酶液的体积比为1:l至l:5。所述肿瘤干细胞抗原组合物来自细胞浓度为lxl()S到lxl()S细胞/mL，优选为lxl()S到5xl(^细胞/mL的本发明的肿瘤干细胞。所述细胞浓度过大造成浪费，反之细胞浓度过小，则不足以使树突状细胞负载上足够的抗原。所述树突状细胞基础培养基可以是本领域任何能够用于培养树突状细胞的培养基，例如RPMI/1640等。所述树突状细胞培养体系包括肿瘤干细胞和lmL-100mL、优选30-80mL的树突状细胞基础培养基，在37。C、5%(:02培养箱中培养。其中，所述巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在肿瘤千细胞抗原负载树突状细胞时添加到树突状细胞基础培养基中，终浓度100IU/mL-2500IU/mL。所述白介素-4在肿瘤干细胞抗原负载树突状细胞时添加到树突状细胞基础培养基中，终浓度100IU/mL-1500IU/mL。所述干扰素a在胂瘤干细胞抗原负载树突状细胞时添加到树突状细胞基础培养基中，终浓度100IU/mL-2000IU/mL。所述肿瘤坏死因子a在肿瘤干细胞抗原负载树突状细胞时添加到树突状细胞基础培养基中，终浓度0.5ng/mL-100ng/mL。所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基准，所述人血白蛋白的含量为1-5重量体积％，优选为2-3重量体积％。本发明还提供了一种治疗癌症的方法，其包括给患者施用选自由本发明的肿瘤干细胞、本发明的肿瘤干细胞抗原组合物、本发明的抗癌树突状细胞以及本发明的树突状细胞疫苗所组成的组中的药物。17优选所述施用的方式为注射。具体地，施用肿瘤干细胞抗原组合物的方式选自由胂瘤组织内注射、静脉注射、皮下注射和皮内注射中的一种或几种；施用所述树突状细胞疫苗的方式为在淋巴结部位皮下或皮内注射。优选施用所述树突状细胞疫苗的方式为在腹部沟或腋下进行皮下或皮内注射。所述肿瘤干细胞抗原组合物优选来自细胞浓度为lxl()S到lxl()S细胞/mL的本发明的肿瘤干细胞，其有效量为0.1mL-5mL/个体；所述树突状细胞疫苗优选包括1><105到5xl(^个/mL本发明的抗癌树突状细胞，其有效量为0.1mL-2mL/个体。更优选所述肿瘤干细胞抗原组合物优选来自细力包浓度为"105到lxl()S细胞/mL的本发明的肿瘤干细胞，其有效量为0.2mL-2mL/个体；所述树突状细胞疫苗优选包括1x105到5x107个/mL本发明的抗癌树突状细胞，其有效量为0.5mL-2mL/个体。以上所述肺瘤干细胞抗原组合物和所述树突状细胞疫苗都是一次注射的剂量，一个疗程四次注射，间隔一周。两种组合物一般在注射完第一针后的第三天到第七天起效。所述有效的标准是起免疫促进的细胞因子如白介素2、白介素12、干扰素Y和肿瘤坏死因子a等的升高；起免疫抑制的细胞因子如白介素6、白介素IO、转化生长因子卩和表皮细胞生长因子等的降低；以及T淋巴细胞亚群变化，即CD3、CD4、CD8的阳性率的升高或改善，CD16/56阳性率的升高，以及CD4CD25FoxP3三阳性率的降低。一个疗程结束后，可以间隔三个月后继续给药，可以治疗两个或四个疗程；如有必要，间隔时间为六个月或1年还可继续再治疗，只要患者一直存活在。其中，所述有效标准还可以分为以下三个等级1.患者血液细胞因子检测起免疫促进的细胞因子如白介素2、白介素12、干扰素Y和肿瘤坏死因子a等的升高；起免疫抑制的细胞因子如白介素6、白介素IO、转化生长因子卩和表皮细胞生长因子等的降低；以及T淋巴细胞亚群变化，即CD3、CD4、CD8的阳性率的升高或改善，CD16/56阳性率的升高，以及CD4CD25FoxP3三阳性率的降低等。2.患者肿瘤标志物;险测，如曱胎蛋白、癌胚抗原、糖蛋白等肿瘤特异抗原的表达的降低，主要是通过酶免和化学发光检测等。3.影像学检测，如CT、核磁共振和B超检测，能检测到治疗前后肿瘤细月包缩小。。优选所述肺瘤干细胞和/或所述树突状细胞来自于同一患者，这样可以最大限度地避免免疫排斥反应造成的副作用。此外，本发明提及的细胞可以是商业上可供的细胞系。并且现有长期冷冻保藏细胞的技术已经非常成熟，比如在液氮(零下196°C)下冻存细胞，例如脐带血细胞保藏。本领域技术人员完全可以利用上述技术保藏本发明涉及的肿瘤组织、肿瘤细胞系和树突状细胞，树突状细胞可以来源外周血、骨髓和脐带血等。以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。制备例1:脑胶质瘤组织中的肿瘤干细胞的分离和培养脑胶质瘤组织来自50岁男性患者，该患者经病理4企查确诊为星形脑胶质瘤。与该患者签署了知情同意书，在进行手术时采集其肿瘤组织。用眼科剪将脑胶质瘤组织剪碎成为约lmn^的小块。所得剪碎的组织小块用0.25%胰酶溶液以l克0.5mL的重量体积比消化5分钟后，加入是胰酶溶液体积五分之一的小牛血清(美国Hyclone公司)终止，以1000rpm离心收集消化好的组织小块，倾去胰酶溶液上清，然后用含0.1%dispase(分散酶，美国西格玛)(lIU/mg)和0.01。/。DNAse(DNA酶，上海生工)的HBSS(汉斯緩沖液，上海生工)以1克lmL的重量体积比洗涤三次，所得离心沉淀用Accutase(阿尤替斯酶，美国西格玛)以l克lmL的体积比在37。C下混匀接触IO分钟，然后在1000rpm下离心5min收集细胞，用以1克lmL的重量体积比用杜尔贝可改良伊格尔-F12培养基重悬。所得重悬液用40-mm分子筛(美国BD公司)过滤。用所述孔径的分子筛过滤，截留的是大片细胞碎片和未被消化的细胞团，滤出的是细胞悬液。取1份50pL(2xl(^个)上述得到细胞悬液分别添加到有20pLFITC-CD44和20pLPE-CD24(BD公司)的离心管中。置于4。C冰箱染色30分钟，然后用lmL的lx磷酸盐緩沖液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的lxPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。结果显示，CD133+且Nestin+的脑胶质瘤干细胞占所得洗涤后的细胞的2.1%。收集剩余的所述细胞悬液后，向其中含有5ng/mLB27、40ng/mL人表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)、40ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bEGF)和30mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12(Dulbecco，smodifiedEagle'smedium-F12)(DMEM/F12)培养基(美国Hyclone公司)使细胞悬液浓度被稀释为2xl05细胞/mL。然后将每5mL所得稀释的细胞悬液转移至25cm2灭菌塑料培养瓶中在37°C、5%0)2培养箱中培养24h。培养所得细胞呈神经球状贴壁生长，倾去培养基，然后用5mLHBSS洗涤一次，倾去洗涤液。所述洗涤过程去掉了悬浮的细胞碎片和未贴壁生长的细胞。并添加新鲜的含有8ng/mLB27、30ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12(DMEM/F12)培养基。当细胞生长达到培养瓶底面的90%汇合时，用Accutase19消化后，用含有8ng/mLB27、30ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12(DMEM/F12)培养基进行传代培养(1瓶传几个瓶，每瓶起始培养的细胞密度为2xl05细胞/mL)。按照上述传代条件再传4代，得到神经球状的细胞。取1瓶培养到5代的肿瘤干细胞，经accutase消化，离心后细胞沉淀用lmLlxPBS重悬，计数。取l份50pL(2xl()S个)上述的传代得到细胞悬液分别添加到有20^LFITC-CD44(BD公司)和20pLPE-CD24(BD公司)的离心管中。置于4。C水箱染色30分钟，然后用lmL的lx磷酸盐緩冲液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的lxPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。结果显示，CD133+且Nestin+的脑胶质瘤干细胞占所得洗涤后的细胞的71.1%。制备例2-3按照制备例1的方法分别制备结肠癌、前列腺癌、脑胶质瘤的肿瘤千细胞。其中，不同点如下结肠癌组织来自40岁男性患者，该患者经病理检查确诊为中分化结肠腺癌。与该患者签署了知情同意书，在进行手术时釆集其肿瘤组织。乳腺癌组织来自39岁女性患者，该患者经病理检查确诊为乳腺癌。与该患者签署了知情同意书，在进行手术时采集其肿瘤组织。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>制备例4:从乳腺癌细胞系MCF-7中分离乳腺癌干细胞将购自美国ATCC的肿瘤细胞系的乳腺癌MCF-7细胞，取1份50pL(2xl06个)细胞悬液分别添加到有20^LFITC-CD44(BD公司)和20jaLPE-CD24(BD公司)的离心管中。置于4。C水箱染色30分钟，然后用lmL的lx磷酸盐緩沖液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的lxPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。结果未检出CD44+且CD24-的乳腺癌干细胞。将上述购自美国ATCC的胂瘤细胞系的乳腺癌MCF-7细胞，用添加了5ng/mLN2、25ng/mL人表皮生长因子、40ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和30mg/mL胰島素的DMEM/F12培养基在37°C、5%(302培养箱中培养3天。培养所得细胞呈神经球状贴壁生长，倾去培养基，然后用5mLHBSS洗涤一次，倾去洗涤液。所述洗涤过程去掉了悬浮的细胞碎片和未贴壁生长的细胞。并添加新鲜的含有15ng/mLN2、30ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12(DMEM/F12)培养基。当细胞生长达到培养瓶底面的90%汇合时，用Accutase消化后，用含有15ng/mLN2、30ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12(DMEM/F12)培养基进行传代培养。按照上述传代条件再传4代，得到神经球状的细胞。取1瓶培养到5代的肺瘤干细胞，经accutase消化，离心后细胞沉淀用lmLlxPBS重悬，计数。取l份50(iL(2xl(^个)上述的传代得到细胞悬液分别添加到有20|iLFITC-CD44(BD公司)和20^LPE-CD24(BD公司)的离心管中。置于4。C冰箱染色30分钟，然后用lmL的lx磷酸盐緩沖液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的lxPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。结果显示，CD44+且CD24-的乳腺癌干细胞占所得洗涤后的细胞的50%。制备例5-6按照制备例5的方法分别制备肺癌和肝癌的肿瘤干细胞。其中，不同点如表3所示表3肿瘤细胞系(ATCC)肿瘤干细胞标志物分离后原代培养前细胞流式仪检测结果(干细胞占所得的细胞％)传代完成后细胞流式仪检测结果(千细胞占所得的细胞％)肺癌NCI-H460CD34+/Sca-1+3.1148.61肝癌HepG2CD133+1.2755.73实施例1:经耐放射筛选的胂瘤干细胞的制备取8瓶25cm2塑料培养瓶，其中，每4瓶分别培养有制备例1和制备例5的肿瘤干细胞。所述培养瓶中的细胞已生长到直径大于IOO微米细胞球程度。以照射总剂量分别为OGy、3Gy、5Gy和9Gy、照射源与胂瘤干细胞照射距离在50cm、射线照射的剂量率为200cGy/min的y射线照射所述培养并瓦中的细胞。照射后更换为含5ng/mLB27、40ng/mLEGF、40ng/mLbEGF和30mg/mL胰岛素的新鲜DMEM/F12培养基，在37。C、5%(:02培养箱培养20天，每3天更换一次所述培养基。培养结束后，经accutase消化，离心得到的细胞沉淀用lmLDMEM/F12重悬，计数。采用集落形成法测定细胞存活率，即用新鲜DMEM/F12培养基加入0.6重量体积％的琼脂糖(熔点为40。C)，制得培养基琼脂糖溶液，置40。C保温。每瓶取经上述筛选且消化重悬的0.5mL细胞悬液(4xl()S细胞/mL)与0.5mL所述培养基琼脂糖溶液混合均匀，立即倒入6孔细胞培养板的孔中，固化后，置37。C、5。/。c02的培养箱中培养1周。在显孩H竟下计数Mmm的集落数目，计算集落形成存活率=(0Gy集落数-3Gy、5Gy或9Gy的集落数)/0Gy集落数，从而检测肿瘤干细胞在不同放射剂量照射下的细胞存活率。以细胞存活率为纵坐标、以照射后的天数为横坐标绘制肿瘤千细胞经y射线辐射筛选后的存活率曲线。如图1-2所示，肿瘤干细胞在经3Gy、5Gy或9Gy的Y射线照射筛选后，都有部分死亡，但培养一段时间后又能生长很好。其中在总剂量9Gy照射后，肿瘤干细胞在照射后第15天存活率很低(小于20%),但继续培养，肿瘤干细胞的存活率重新恢复，甚至存活率与未经照射的肿瘤干细胞相当。并且，恢复后的肿瘤干细胞的增殖速率远高于未经照射的肿瘤干细胞。例如，经9Gy照射后15天的乳腺癌干细胞增值速率为16°/。/天，而未经照射的乳腺癌干细胞增值速率一直维持在1%/天。此外，取3瓶培养有制备例1的脑胶质瘤干细胞。所述培养瓶中的细胞已生长到直径大于100微米细胞球程度。重复上述9Gy的y射线照射筛选，所得存活率结果见图3与上述图1的结果类似。此外，取16瓶25cm2塑料培养瓶，其中，每4瓶分别培养有制备例2-4和制备例6的肿瘤干细胞。重复上述实验过程，得到类似的结果，即经3Gy、5Gy或9Gy照射后，肿瘤干细胞在照射后第15天存活率很低(小于20%),但继续培养，肿瘤干细胞的存活率重新恢复，甚至存活率与未经照射的肿瘤干细胞相当。实施例2:经高浓度间歇诱导法化疗药物筛选的肿瘤干细胞的制备取1瓶25cm2塑料培养瓶的培养有制备例3的乳腺癌干细胞，经accutase消化，离心后细胞沉淀用lmLDMEM/F12培养基重悬计数，得到2xl()S细胞/mL的细胞悬液。1)将所述乳腺癌干细胞接种10mL于75ci^培养瓶中，生长至瓶底80%汇合时，加用DMEM/F12培养基溶解的4-羟-环磷酰胺，直至终浓度5mg/mL，在37。C、5。/。C02条件下培养12h。倾去含4-羟-环磷酰胺的培养液，"PBS洗2次，加含5ng/mLN2、40ng/mLEGF、40ng/mLbEGF和30mg/mL胰岛素的DMEM/F12培养基，在37。C、5%c02条件下培养乳腺癌干细胞生长至80%汇合。2)再加入用DMEM/F12培养基溶解的4-羟-环磷酰胺直至终浓度5mg/mL,在37。C、c02条件下培养24h，倾去含4-羟-环磷酰胺的培养液，lxPBS洗2次。3)再重复上述步骤2)培养4次，由此获得经耐药性筛选的乳腺癌干细胞。按照上述乳腺癌干细胞的耐化疗药筛选制备例3、5、7的肿瘤干细胞，不同之处如表4所示表4<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>实施例3:经药物浓度递增法化疗药物筛选的肺瘤千细胞的制备取1瓶25cm2塑料培养瓶的培养有制备例1的脑胶质瘤干细胞，经accutase消化，离心后细胞沉淀用lmLDMEM/F12培养基重悬计数，得到2xl()S细胞/mL的细胞悬液。1)将所述脑胶质瘤干细胞接种10mL于75cn^培养瓶中，生长至瓶底80%汇合时，加用DMEM/F12培养基溶解的厄洛替尼，直至终浓度lmg/mL，在37°C、5%C02条件下培养24h。倾去含厄洛替尼的培养液，lxPBS洗2次，加含5ng/mLN2、40ng/mLEGF、40ng/mLbEGF和30mg/mL胰岛素的DMEM/F12培养基，在37。C、5%032条件下培养脑胶质瘤干细胞生长至80%汇合。2)重复步骤1)的操作4次，不同的是厄洛替尼的终浓度分别为2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和10mg/mL。3)加用DMEM/F12培养基溶解的厄洛替尼，直至终浓度10mg/mL,在37°C、5%C02条件下培养24h。倾去含厄洛替尼的培养液，lxPBS洗2次，加含5ng/mLN2、40ng/mLEGF、40ng/mLbEGF和30mg/mL胰岛素的DMEM/F12培养基，在37。C、5%002条件下培养脑胶质瘤干细胞生长至80%汇合。4)重复上述步骤3)培养1次。5)加用DMEM/F12培养基溶解的厄洛替尼，直至终浓度10mg/mL，在37°C、5。/。C02条件下培养24h。由此获得在终浓度10mg/mL厄洛替尼中稳定生长的经耐药性筛选的脑月交质瘤干细胞。按照上述脑胶质瘤干细胞的耐化疗药筛选下面的肿瘤干细胞，不同之处如表5所示表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>此外，取1瓶培养制备例2的前列腺癌干细胞。重复上述终浓度lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和10mg/mL乙烯雌酚筛选，所得结果见表7。实施例4:MTT检测经耐药筛选的肿瘤干细胞的药物敏感性将实施例2和实施例3所得的肿瘤干细胞以1x104/mL细胞浓度分别接种于96孔培养板，所述培养的培养基为含5ng/mLN2、40ng/mLEGF、40ng/mLbEGF和30mg/mL胰岛素的DMEM/F12，在37。C、5%(302的条件下，培养24h后倾去培养液，分别按照下表6分别加入相应的化疗药物，所述药物以溶解在培养基中的形式加入表6<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表6中每种细胞在每个梯度下重复3个孔，以每种未经化疗药物筛选的肿瘤干细胞作为相应细胞的空白对照。继续培养48h，每孔加入终浓度5mg/mL的MTT的lxPBS溶液20^L,4h后加入二曱基亚砜(DMSO)lOO^L,振荡混匀15min,用酶标仪(K=570nm)测定每孔吸光度值(A值)，其中吸光度值与活细胞数成正比)，取3个孔的平均值，计算药物对肿瘤干细胞的抑制率。肿瘤干细胞的抑制率=(l-药物A值/对照A值)xl00%。采用对数计量作图法计算各种药物对细胞达50%抑制率时的药物浓度(IC50),并计算相对耐药度(RF)。相对耐药度=IC50经耐药筛选的肿瘤干细胞/IC50未经化疗药物筛选的肿瘤干细胞。测试结果如表7所示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>2.83±1.517.75±2.122.73±1.62肝癌TSC经耐药筛选的肝癌TSCIC50(吗/mL)IC50(吗/mL)RF15.31±2.1641.61±4.222.72±3.31制备5的乳腺癌TSC经耐药筛选的制备5的乳腺癌TSCIC50(mg/mL)IC50(mg/mL)RF2.11±0.336.42±0.623.04±0.55实施例5:射线照射和化疗药物耐受筛选的肿瘤干细胞的制备使用制备例的肿瘤干细胞根据实施例1-3的描述，按照下表8将两种筛选过程并用:表8制备例照射射线照射参数化疗药物化疗药物用量用法制备例1Y射线照射总剂量为9Gy、照射源与肿瘤干细胞照射距离在50cm、剂量率为200cGy/min厄洛替尼实施例3制备例2Y射线照射总剂量为9Gy、照射源与肿瘤千细胞照射距离在lm、剂量率为350cGy/min阿霉素实施例2制备例3y射线照射总剂量为7Gy、照射源与肿瘤干细胞照射距离在40cm、剂量率为300cGy/min4-羟-环磷酰胺实施例2制备例4Y射线照射总剂量为6Gy、照射源与肿瘤干细胞照射距离在80cm、剂量率为200cGy/min4-羟-环磷酰胺实施例2制备例5x射线照射总剂量为9Gy、照射源与肿瘤干细胞照射距离在50cm、剂量率为200cGy/min紫杉醇实施例3制备例6Y射线照射总剂量为10Gy、照射源与肿瘤干细胞照射距离在lm、剂量率为200cGy/min5氟尿嘧啶实施例3图4显示了制备例1脑胶质瘤干细胞经射线照射和化疗药物筛选后耐受性蛋白表达western印迹照片，其中，卩-肌动蛋白(卩-actin)为检测内标，为细胞增殖时常表达蛋白；表皮生长因子受体(EGFR)为促进肿瘤增殖、新生血管发生、抑制肿瘤经胞凋亡的特异性表达蛋白，并且促进HIF-la表达，提高细胞对低氧的耐受。从图5可以看出，在厄洛替尼作用的前提下，随着y射线照射剂量增加(例如由5Gy增加到9Gy)，EGFR表达量也随着增加。图5显示了制备例1脑胶质瘤干细胞、制备例4的乳腺癌干细胞和制备例6的肝癌干细胞经射线照射和化疗药物篩选后耐受性蛋白RT-PCR后表达电泳25照片，其中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为检测内标，为细胞能量代谢常表达物。CD133和nestin是肿瘤干细胞特异性表达的蛋白质。如图5所示，制备例1脑胶质瘤干细胞、制备例4的乳腺癌干细胞和制备例5的肝癌干细胞经射线照射和化疗药物筛选后能特异表达CD133和nestin。Glioma表示经射线照射和化疗药物筛选后的脑胶质瘤干细胞。制备例3乳腺癌干细胞、制备例2的结肠癌干细胞、制备例5的肺癌干细胞经射线照射和化疗药物筛选后能分别特异表达干细胞标志物，与图5类似，表达产物高于未经射线照射和化疗药物筛选相应的肿瘤干细胞。实施例6:经耐受筛选的胂瘤干细胞的抗原组合物的制备取上述制备例1-6的未经筛选的肿瘤干细胞以及实施例1-3和5所得经筛选的肿瘤干细胞，在液氮中和室温(25°C)下反复冻融5次，通过倒置显微镜检测到所述细胞完全裂解。所得裂解液在600rpm下离心lmin，收集上清用0.45pm滤膜过滤，收集滤液。所述裂解液即肿瘤干细胞的抗原组合物，储存在-8(TC中备用。此外，另取实施例1-3和5所得经筛选的肿瘤千细胞在42"C水浴下热休克2小时后，再重复上述反复冻融步骤。用western印迹^r测发现如此所得的肿瘤干细胞抗原组合物中热休克蛋白的表达。实施例7:树突状细胞获取取100mL外周血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，得到单个核细胞。夕卜周血单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，并加入6孔寿反中贴壁。在37。C、5。/oC02培养箱中孵育90min后，未贴壁细胞洗涤收集下来，用于诱导CIK细胞。贴壁细胞加入完全培养基RPMI1640诱导培养，含有5%的自体血清、2000IU/mL重组人粒细胞巨噬集落刺激因子和1500IU/mLIL-4。在培养到第三天时细胞更换新鲜培养基(含2000IU/mLGM-CSF和1500IU/mLIL-4)。培养到第五天收获未成熟树突状细胞(DCs),成熟DCs采用完全RPMI1640培养基在诱导到第七天得到，含0.1pg/mL脂多糖和20ng/mL肿瘤坏死因子a。在第五天时添加特殊抗原(如肿瘤干细胞抗原)，负载DCs。实施例8:经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载DCs培养5天后，3xl(^个未成熟DCs用实施例6所述的未经或经筛选的肿瘤干细胞裂解抗原组合物(得自lxlO^中瘤干细胞)在37°C、5%(302培养箱中负载4小时。抗原负载的DCs通过离心(10min，1000rpm)收获得到。所得DCs经生理盐水洗涤3次，后重悬到生理盐水中，至浓度为3xl()S成熟DC/mL，并添加终浓度为质量体积比2%的人血白蛋白，从而制备成肿瘤干细胞裂解抗原组合物负载的DC疫苗。经耐受性筛选的乳腺癌干细胞抗原负载树突状细胞通过CD86-FITC、26CD80-FITC、CD83-PE和CDllc-Percp(BD公司)染色，流式细胞仪检测负栽后DC表型变化。从左到右，经耐受性筛选的乳腺癌干细胞抗原负载树突状细胞的比例为1:9、1:6和1:3，CDllc/CD83、CDllc/CD86和CDllc/CD80的双阳性率变化比较明显，双阳性率不断升高，促进了树状细胞的成熟度，如图6所示。效果实施例1:经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载DC疫苗体外杀瘤试验在6孔板内，仍以含5%小牛血清的RPMI1640为培养基，按上述抗原负栽的成熟树突状细胞T细胞=1:20的比例混合上述抗原负栽的成熟树突状细胞和T细胞，同时加入GM-CSF(终浓度为800U/mL)和IL-4(终浓度为20ng/mL),共培养7天，期间每隔1天均半量换液(含5%小牛血清、终浓度为800U/mL的GM-CSF和终浓度为20ng/mL的IL-4的RPMI1640培养基)，得到CTL细胞。选择相应的肿瘤干细胞作为耙细胞，用"Cr标记，即靶细胞(2xl06/mL)通过与300pCi51Cr在RPMI1640培养基中37。C孵育2小时。标记好的耙细胞用lxPBS洗涤三次，并最终用RPMI1640(含10%小牛血清)重悬到2xl05的浓度。以每孔2xl04个标记的靶细胞(0.1mL)添加到％孔板的孔中。将上述产生的CTL细胞(效应细胞)分别以2.5:1、5:1、10:1、20:1和40:1的效靶比加入对应的孔中，在37。C孵育4小时。孵育后，取上清75pL组分用Y放射计数器计数。持异的"Cr释放的百分比根据下述的公式进行计算。(检测的每分脉冲数H自发释放的每分脉冲数)%特异裂解率=-x!oo%(最大释放的每分脉冲数卜(自发释放的每分脉沖数)其中，自发释放的每分脉冲数通过单独培养靶细胞(未加效应细胞)获得，最大释放的每分脉冲数是用终浓度2%NP-40(表面活性剂，上海生工)处理的单独培养靶细胞后获得的。检测的每分脉冲数通过添加效应细胞的耙细胞培养获得的。图7显示了由表8所示经射线照射和化疗药物筛选后的制备例1、经总剂量为9Gy、剂量率为200cGy/min和距离为50cm的射线照射篩选的制备例5以及表4所示经化疗药物筛选后的制备例6所得抗原组合物负载树突状细胞，得到细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，由该CTL细胞产生的对相应肺瘤干细胞的应答结果。如图7所示，随着效靶比不断提高，对肿瘤干细胞产生的CTL应答也特异升高。并且由表8所示经射线照射和化疗药物筛选后的制备例1效果最佳。图8显示了由表8所示经射线照射和化疗药物筛选后的制备例3和未经筛合物分别负载树突状细胞，得到两种细胞毒性T淋巴细胞(CTL),由该两种CTL细胞分别对经射线照射和化疗药物筛选的以及未经射线照射和化疗药物筛选的乳腺癌千细胞产生的应答结果对比图。其中，RBTSC-DC1表示经耐受性筛选的乳腺癌千细胞抗原负载的树突状细胞对经耐受性筛选的乳腺癌干细胞的毒性活性，BTSC-DC1表示未经耐受性筛选的乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞对经耐受性筛选的乳腺癌干细胞的毒性活性，RBTSC-DC2表示经耐受性筛选的乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞对未经耐受性筛选的乳腺癌干细胞的毒性活性，BTSC-DC2表示未经耐受性筛选的乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞对未经耐受性筛选的乳腺癌干细胞的毒性活性。如图8所示，经耐受性筛选的乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞(RBTSC-DC)对耐受性乳腺癌干细胞和乳腺干细胞的细胞毒性活性要分别高于乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞(BTSC-DC)对耐受性乳腺癌干细胞和乳腺干细胞的细胞毒性活性。所述耐受性乳腺癌干细胞按照实施例5表8制备。有关实施例1-3和5所得经筛选的肿瘤干细胞的细胞毒性活性，远远好于有关制备例l-6的未经筛选的肿瘤干细胞的细胞毒性活性。此外有关热休克结合反复冻融裂解实施例l-3和5所得经筛选的肿瘤干细胞的细胞毒性活性，远远好于有关单纯反复冻融裂解实施例1-3和5所得经筛选的肿瘤干细胞的细胞毒性活性。效果实施例2:经筛选的肿瘤干细胞在体内杀瘤实验中的作用以含5%小牛血清的RPMI1640为培养基，将3><106个的未成熟树突状细胞用上述实施例6所得的未经或经筛选的肿瘤干细胞裂解抗原组合物(得自lxlO"中瘤干细胞)在37。C、5。/oC02培养箱中负载4小时。抗原负载的成熟树突状细胞通过1000rpm离心10min得到。将所述抗原负载的成熟树突状细胞用生理盐水洗涤3次，然后重悬至lxl(^个/mL的浓度，4'C下保存备用。制备例l的乳腺癌干细胞建立荷乳腺癌瘤鼠模型(参见"人结肠癌细胞在免疫缺陷小鼠中能诱发肿瘤的生长，，，O'BrienCA等人，自然，第445巻，第106-110页，2008年2月3日；O'BrienCA，PollettA,GallingerS,etal.Ahumancoloncancercellcapableofinitiatingtumourgrowthinimmunodeficientmice.Nature,2007,445(7123):106-110.)，随机分为A、B和C3組，每组10只，A组为经耐受筛选的乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞治疗组，B组为未经耐受筛选的乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞为对比组(注射液制备方法与A组相同),C组为同体积生理盐水空白组。A和B两组在第0天荷瘤鼠才莫型皮下^T注0.5-2xl(^个/mL树突状细胞，各0.5mL，半个月后再同样剂量免疫l次。注射28后分别于7、14、21、28、35d计算鼠模型荷瘤大小，C组于相同时间点在皮下注射0.5mL生理盐水并计算鼠模型荷瘤大小。经耐受筛选的乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞疫苗对荷瘤鼠才莫型的抑制生长情况(mm3，5±s)见表9。表9々B2、1肿瘤大，J組力'J治疗后7d治疗后14d治疗后21d治疗后28d治疗后35d治疗組22.4±2.119.6±3.3*ff12.1±1.4*#7.6±3.4*ff6.2±2.7*ff对比组28.2±0.825.1±1.316.8±2.410.5±3.59.4±3空白组31.2±1.237.4±241.2±1.246.7±2.156.3±2.3〉主*玄白组与治疗组相比P远小于0.01;#对比组与治疗组相比P<0.01。此外，有关实施例l-3和5所得经筛选的肿瘤千细胞的体内杀瘤活性，远远好于有关制备例l-6的未经筛选的肿瘤干细胞的体内杀瘤活性。此外有关热休克结合反复冻融裂解实施例1-3和5所得经筛选的肿瘤干细胞的体内杀瘤活性，远远好于有关单纯反复冻融裂解实施例1-3和5所得经筛选的肿瘤干细胞的体内杀瘤活性。29权利要求1.一种经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的制备方法，该方法包括通过裂解肿瘤干细胞得到肿瘤干细胞抗原组合物，将正常树突状细胞与肿瘤干细胞抗原组合物接触得到负载肿瘤抗原的抗癌树突状细胞，其特征在于，所述肿瘤干细胞通过以下方法制备，该方法包括对肿瘤干细胞进行射线照射和/或化疗药物筛选的步骤，所述射线照射筛选通过将肿瘤干细胞暴露于射线的照射源下完成，所述射线选自由X射线、β射线、α射线和γ射线所组成的组中，所述化疗药物筛选通过使肿瘤干细胞与化疗药物接触完成，所述化疗药物选自由烷化剂化疗药物、亚硝脲化疗药物、抗代谢化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌药物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、植物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、氮烯咪胺、顺铂、卡铂、草酸铂、丙亚胺和羟基脲所组成的组中。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述射线照射的照射源与肿瘤干细胞的直线距离为10cm-5m,所述射线照射的总剂量为2Gy-10Gy，所述射线照射的剂量率为0.4-1200cGy/min。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述射线照射的照射源与肿瘤干细胞的直线距离为20cm-2m，所述射线照射的总剂量为3Gy-9Gy,所述射线照射的剂量率为2-600cGy/min。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述射线为X射线和/或Y射线。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化疗药物在肿瘤干细胞培养基中的终浓度范围为0.1-100mg/mL,所述化疗药物与肿瘤干细胞接触的时间为lh-72h。6.据权利要求5所述的方法，其中，所述化疗药物在肿瘤干细胞培养基中的终浓度范围为0.5-50mg/mL，所述化疗药物与肿瘤干细胞接触的时间为12h-36h。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述烷化剂化疗药物选自由氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、氮曱、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥和噻替派所组成的组中；所述亚硝脲类化疗药物选自由卡氮芥、环已亚硝脲、曱环亚硝脲、嘧啶亚硝脲、白消安和雌二醇氮芥所组成的组中；所述抗代谢药化疗药物选自由曱氨喋呤、氟尿嘧啶、喃氟啶、优福啶、卡莫氟、脱氧氟尿苷、氟尿脱氧核苷、环胞苷、阿糖胞苷和双氟胞苷所组成的组中；所述抗生素化疗药物选自由放线菌素D、丝裂霉素、博来霉素、平阳霉素、阿霉素、他喃阿霉素、表-阿毒素、去曱氧柔红霉素和米托蒽醌所组成的组中；所述植物化疗药物选自由长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞宾、鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩甙、羟基喜树碱、伊立替康、托泊替康、紫杉醇、泰素帝、三尖杉酯44和羟基紫杉醇所组成的组中；所述激素及内分泌药物化疗药物选自由泼尼松、地塞米松、丙酸睾丸素、乙烯雌酚、氟硝丁酰胺、孕酮、曱地孕酮、他莫昔芬、雌激素受体拮抗剂、托瑞米芬、氨鲁米特、福美司坦、来曲唑和促性腺激素释放激素拮抗剂所组成的组中；所述抗体阻断剂化疗药物选自由表皮生长因子抑制剂吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔单抗和尼妥^K单抗所组成的组中。8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化疗药物选自由4-羟-环磷酰胺、吉非替尼、厄洛替尼、五氟尿嘧啶、阿霉素、紫杉醇和顺铂所组成的组中。9.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括对肿瘤干细胞进行射线照射筛选的步骤，所述射线照射的照射源与肿瘤千细胞的直线距离为20cm-2m,所述射线照射的总剂量为3Gy-9Gy,所述射线照射的剂量率为2-600cGy/min。10.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括对肿瘤干细胞进行化疗药物筛选的步骤，所述化疗药物在肿瘤干细胞培养基中的终浓度范围为0.5-50mg/mL,所述化疗药物与肿瘤干细"包4矣触的时间为12-36h。11.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括对肿瘤千细胞进行射线照射和化疗药物筛选的步骤，所述射线照射的照射源与肿瘤千细胞的直线距离为20cm-2m,所述射线照射的总剂量为3Gy-9Gy,所述射线照射的剂量率为2-600cGy/min。所述化疗药物在肺瘤干细胞培养基中的终浓度范围为0.5-50mg/mL，所述化疗药物与肿瘤干细"包4妄触的时间为12-36h。12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤选自由乳腺癌、胶质瘤、肺癌、脑癌、鼻咽癌、肝细胞癌、胃癌、结肠癌、黑素瘤、骨肉瘤、肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、急性骨髓白血病、多发性骨髓瘤胰腺癌和转移瘤性癌所组成的组中。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述转移瘤性癌选自脑部转移瘤、肺部转移瘤、肝部转移瘤和颈部转移瘤所组成的组中。14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从离体肿瘤组织和/或肿瘤细胞系中分离肿瘤干细胞。15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤干细胞特异表达选自由表皮生长因子受体、P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白、共济失调毛细血管扩张症突变基因编码的蛋白、共济失调毛细血管扩张症Rad3相关蛋白和低氧诱导因子所组成的组中的蛋白。16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解肿瘤干细胞的步骤包括热休克和/或反复冻融；所述热休克裂解的条件包括在3745t:下保持lh-6h;所述反复冻融的次数为3-5次两次的间隔时间是10min-2h,所述冷冻的温度范围是零下120。C-零下196°C，所述融化的温度范围是10°C-37°C。17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述裂解肿瘤干细胞的步骤包括热休克和反复冻融；所述热休克裂解的条件包括在37-45'C下保持lh-6h;所述反复冻融的次数为3-5次两次的间隔时间是10min-2h,所述冷冻的温度范围是零下120。C-零下196°C,所述融化的温度范围是2(TC-37。C。18.权利要求l所述的方法，其特征在于，所述肿瘤干细胞抗原组合物裂解自细胞浓度为1x105到1x108细胞/mL的肿瘤干细胞。19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述正常树突状细胞与制备肿瘤干细胞抗原组合物的肺瘤干细胞来自同一个体，或肺瘤干细胞来自肿瘤细胞系培养获得的。20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述正常树突状细胞与肿瘤干细胞抗原组合物接触的时间是l-12h。21.由权利要求1-20中任意一项所述的方法得到的抗癌树突状细胞。22.—种树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞为权利要求24所述的抗癌树突状细胞。23.根据权利要求22所述的疫苗，其中，所述疫苗包括lxl()S到5xl07个/mL所述抗癌树突状细胞。24.根据权利要求22所述的疫苗，其特征在于，所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基准，所述人血白蛋白的含量为l-5重量体积%。25.权利要求21所述的抗癌树突状细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。26.—种制备权利要求21所述的抗癌树突状细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)肿瘤干细胞基础培养基；2)》文射治疗同位素源和/或化疗药物；3)消化细胞的酶；4)B27、N2、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素的至少一种；5)树突状细胞基础培养基；6)巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子；7)白介素-4、干扰素a和肿瘤坏死因子a的至少一种；以及6)使用说明书；其中，所述放射治疗同位素源选自由X射线、卩射线、a射线和Y射线所组成的组中，所述化疗药物选自由烷化剂化疗药物、亚硝脲化疗药物、抗代谢化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌药物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、植物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、曱基千肼、氮烯咪胺、顺铂、卡铀、草酸铂、丙亚胺和羟基脲所组成的组中；所述使用说明书包括权利要求1-23中任意一项所述的方法。27.根据权利要求26所述的试剂盒，其特征在于，所述消化细胞的酶为胰酶和/或阿尤替酶。28.根据权利要求26所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括动物血清。全文摘要本发明提供一种经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞及其制备方法、该经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞在制备抗肿瘤药物中的应用、制备该经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的试剂盒，以及包括该经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的疫苗。由本发明提供的经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞以及包括该经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的免疫组合物制备的药物，能够在体内和体外杀死引起肿瘤复发的肿瘤干细胞，从而为克服肿瘤耐受性、根治肿瘤的复发和转移提供了可能。文档编号C12Q1/02GK101560496SQ20091008308公开日2009年10月21日申请日期2009年4月30日优先权日2009年4月30日发明者丽沈,王亚军,郝丽敏,马艳玲,黄启明申请人:北京弘润天源生物技术有限公司