专利名称：一种用于生物分子多重靶标检测的通用标签、探针及检测方法
技术领域：
本发明属于生物分子检测技术领域，具体地，本发明涉及一种用于生物分子多重 靶标检测的通用标签、探针及检测方法。
背景技术：
随着人类基因组计划(Human genome project, HGP)的完成，大量的动植物、微 生物基因组序列得以测定，基因数据以前所未有的速度增加。面对如此众多的基因，如何 能够同时大规模研究基因的生物学信息并解析其在生命活动过程中所担负的功能，就成 了科研工作者研究的热点课题。在这一背景下，以基因芯片技术为主体的生物芯片诞生 了，它被誉为20世纪90年代中期以来影响最为深远的重大科技进展之一 [1-4]。基因芯 片(gene chip)，又称 DNA 芯片(DNA chip)、DNA 微阵列(DNAmicroarray)、寡核苷酸阵列 (oligonucleotide array)，是指用原位合成(in situsynthesis)或微量点样技术，将数以 百计或数以千计的DNA探针固定于固相支持物表面，从而产生二维的DNA探针微阵列，然 后依据核酸杂交的原理与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号从而实现对生物样品快 速、平行、高效的检测与分析。目前，基因芯片技术已广泛应用于分子生物学和医学研究等 各个方面，在基因表达、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)、基因组 研究、疾病诊断和药物筛选等领域显示出良好的应用前景。虽然基因芯片在多重、快速、平行检测样品分子中显示出了无比的优越性，但仍有 一些瓶颈因素限制了基因芯片的实际应用和推广，其中一个重要因素就是在进行杂交前 需要对待测样品进行标记，而标记样品的步骤较为繁琐，需要专业人员操作，标记过程要用 到反转录酶、聚合酶等，标记效率较低，且这个过程不能在检测现场进行，这些都增加了检 测成本和操作步骤，不利于芯片技术的推广和实际应用。本发明的目的就是克服现有标记 方法的不足，寻求一种简便、快速的生物分子多重靶标通用标记检测方法。我们知道，稳定核酸双螺旋的主要因素有两个一个是互补碱基对之间形成的氢 键，它主要维系核酸双螺旋的横向稳定；另一个是同一核酸链上相邻碱基之间的碱基堆积 作用，它是维系核酸双螺旋纵向稳定的主要因素。这两个因素协同作用，共同维护核酸双螺 旋的稳定，氢键的形成有利于碱基的堆积作用，而碱基堆积又有利于氢键的形成。20世纪 90年代中期以来，俄罗斯国家科学院院士 MirZabek0V(已故)领导的研究小组系统研究并 阐述了碱基堆积杂交(Base stackinghybri dization,BSH)的理论[5-9]。碱基堆积杂交 也被称为邻近堆积杂交(Contiguous stacking hybridization, CSH)，它是指当一条短的 寡核苷酸单链与互补的DNA/RNA长链杂交时，形成的双链结构往往是不稳定的；但如果有 另一条与之邻近的寡核苷酸单链也与互补的DNA/RNA长链杂交，那么这种双链结构的稳定 性会极大的提高(图1)。基于以上这些科学研究成果，本发明提出了用于生物分子多重靶 标检测的通用标记方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于生物分子多重靶标检测的通用标签。本发明的再一目的是提供一种生物分子多重靶标检测的探针。本发明的另一目的是提供一种生物分子多重靶标检测方法。根据本发明的用于生物分子多重靶标检测的通用标签，可以是一段DNA、RNA、 PNA (肽核酸)、LNA (Locked nucleic acids)等；其长度变动范围为3_20mer ；设计时其碱 基序列应进行比对，尽量避免与待检样品具有同源性。根据本发明的用于生物分子多重靶标检测的探针，所述探针由3’端至5’端依次 包括与靶分子或靶分子的一部分反向互补的核苷酸序列、以及与通用标签反向互补的核 苷酸序列，也可以在3’端增加一段寡聚T或寡聚A以减少固相载体的界面影响；或者，所述 探针由3’端至5’端依次包括与通用标签反向互补的核苷酸序列、与靶分子或靶分子的一 部分反向互补的核苷酸序列，也可以在5’端增加一段寡聚T或寡聚A以减少固相载体的界 面影响。根据本发明的探针，其中，所述端基为氨基、巯基、羧基或生物素等。根据本发明的生物分子多重靶标检测方法包括以下步骤1)制备上述通用标签，通用标签可标记指示剂如荧光染料、量子点、纳米金、同位 素、生物素等从而适用荧光显微镜、芯片扫描仪、银染显色法、酶反应显色法等手段检测；2)制备上述探针，首先依据待检靶标设计探针，探针除了具有与靶分子或靶分子 的一部分反向互补的一段核酸序列外，还额外增加了一段核酸序列与上述的通用标签反向 互补，探针的端部修饰以便于与固相载体连接；3)将探针连接到经过修饰的固相载体上；4)将通用标签、处理后的待测样品溶于杂交液中，与探针阵列杂交；或者分两步 进行，即首先将待测样品与探针杂交，经漂洗后再将通用标签与探针阵列杂交；4)漂洗除去多余的样品及通用标签；5)检测并分析杂交信号。根据本发明的方法，其中，检测对象不仅包括DNA、RNA，还包括蛋白质、糖分子等。根据本发明的方法，其中，所述固相载体为玻璃片、塑料基片、硅片、微珠或聚合物膜等。根据本发明的方法，其中，所述固相载体经多聚赖氨酸、醛基、羧基或巯基等修饰。使用本发明的通用标签、探针进行检测，在获取样品后，不用标记即可直接进行检 测，大幅度的降低了成本，有利于现场检测，简化了实验步骤，操作简单，非专业人员也可操 作，便于推广。而且使用本发明的标签探针可以实现生物分子多重靶标检测。
图1碱基堆积杂交示意图。图2通用标记方法用于临床多种病源菌的检测示意图。图3通用标记方法用于miRNA图谱分析示意图。图4通用标记方法用于蛋白靶标多重检测示意图。
具体实施例方式实施例1本发明的方法用于临床多种病源菌的检测以肺炎呼吸道中五种病源菌为例加以说明(如图2所示)肺炎克雷伯菌 (K. pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E. cloacae)、绿月农杆菌(P. aeruginosa)、金黄色葡萄球菌 (S. aureus)、肠球菌(Enterococcus)。所用到的探针及通用标签如表1所示。表1.检测肺炎呼吸道标本五种病源菌所用到的探针、通用标签名称及序列 1、选择五种病源菌的16SRNA作为检测的靶标，分别合成五种探针，探针的5’端是 poly(T) 12、中间一段序列与靶分子的一部分互补、3’端一段序列与通用标签互补，探针的 5’端进行氨基修饰；2、合成通用标签，并在5’端修饰荧光素；3、用传统的化学修饰法处理玻片，制备醛基化基片；4、将探针溶解于点样缓冲液中，点样制备寡核苷酸阵列；5、将病人呼吸道分泌物加热裂解，或者经细菌培养后将菌液加热裂解，然后与通 用标签溶解于杂交液中，与探针阵列杂交；6、漂洗除去多余的样品及通用标签；7、荧光显微镜或芯片扫描仪检测并进行分析。由于碱基堆积杂交的作用，只有当完全互补的靶分子与探针结合后，通用标签才 可以稳定地结合到探针上；而当错配的靶分子与探针结合后，不能稳定通用标签与探针的 结合。五种探针分别与五种病源菌的16SRNA杂交，因而可以判断出感染病源菌的种类和含 量，以指导临床用药。实施例2本发明的方法用于miRNA图谱分析以肝组织中四种miRNA为例加以说明(如图3所示)has-mir-194、has-mir-122、 has-mir-148、has-mir_192。所用到的探针及通用标签如表2所示。表2.检测肝组织中四种miRNA所用到的探针、通用标签名称及序列
1、依据miRNA文库制备上述四种miRNA的相应探针，探针的5’端是poly (A) 10、中 间一段序列与miRNA互补、3’端一段序列与通用标签互补，探针的5’端进行氨基修饰；2、合成通用标签，并在5’端修饰纳米金；3、用传统的化学修饰法处理玻片，制备醛基化基片；
4、将探针溶解于点样缓冲液中，点样制备寡核苷酸阵列；5、将样品裂解或是抽提总RNA并分离富集小RNA(sRNA)后，再与通用标签溶解于 杂交液中，与探针杂交；6、漂洗除去多余的样品及通用标签；7、加入银增效剂增强信号；8、采用平板扫描仪对信号检测并进行分析，判断miRNA的表达谱。实施例3本发明的方法用于蛋白靶标多重检测以人血清中甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、总前列腺特异性抗原(TPSA)为例加 以说明(如图4所示)，所用到的探针、生物条形码、通用标签如表3所示。表3.检测人血清中三种抗原所用到的探针、生物条形码、通用标签名称及序列 1、将三种待检抗原相对应的抗体连接到磁珠上，然后将连接有抗体的磁珠与样品 溶液反应，形成抗原抗体复合物；2、磁分离除去多余的样品，再将修饰有抗体与生物条形码(三种待检抗原对应三 种不同的条形码核酸序列)的纳米金与抗原抗体复合物进行反应，形成磁珠_抗原_纳米 金的复合物；3、磁分离除去多余的纳米金，再用DTT溶液将生物条形码从纳米金上释放出来；4、将释放出来的生物条形码与标记有FAM的通用标签溶于杂交液中与探针阵 列杂交(探针的3’端与通用标签互补，中间一部分与对应的生物条形码互补，5’端是 Poly(T) 10,5'端修饰有氨基以固定于醛基化玻片上)；5、经过漂洗除去多余的通用标签；6、荧光显微镜或芯片扫描仪检测并进行分析，以判断血清样品中这三种抗原的种 类和含量。参考文献[IjFodor SP,Read JL,Pirrung MC,Stryer L，Lu AT,Solas D. Light-direeted, spatiallyaddressable parallel ehemical synthesis. Science 199IFeb 15;
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权利要求
一种用于生物分子多重靶标检测的通用标签，其特征在于，所述通用标签为一段DNA、RNA、肽核酸或LNA；其长度为3 20mer。
2.根据权利要求1的通用标签，其特征在于，所述通用标签标记包括荧光染料、量子 点、纳米金、同位素、和/或生物素的指示剂。
3.一种用于生物分子多重靶标检测的探针，其特征在于，所述探针由3’端至5’端依次包括与靶分子或靶分子的一部分反向互补的核苷酸序 列、以及与通用标签反向互补的核苷酸序列；或者，所述探针由3’端至5’端依次包括与通用标签反向互补的核苷酸序列、与靶分 子或靶分子的一部分反向互补的核苷酸序列，其中，所述通用标签为一段DNA、RNA、肽核酸或LNA ；其长度为3-20mer。
4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述端基为氨基、巯基、羧基或生物素。
5.一种生物分子多重靶标检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)制备权利要求1所述的通用标签；2)制备权利要求2所述的探针；3)将探针连接到经过修饰的固相载体上；4)将通用标签、待测样品溶于杂交液中，与探针阵列杂交，或者先将待测样品与探针杂 交，经漂洗后再将通用标签与探针阵列杂交；5)漂洗除去多余的样品及通用标签；6)检测并分析杂交信号。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述固相载体为玻璃片、塑料基片、硅片、微珠 或聚合物膜。
7.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述固相载体经环氧基、氨基、多聚赖氨酸、醛 基、羧基或巯基修饰。
8.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述检测方法的检测对象为DNA、RNA、蛋白质 和/或糖分子。
全文摘要
本发明属于生物分子检测技术领域，具体地，本发明涉及一种用于生物分子多重靶标检测的通用标签、探针及检测方法。根据本发明的通用标签为一段DNA、RNA、肽核酸或LNA；其长度为3-20mer。根据本发明的探针由3′端至5′端依次包括与靶分子或靶分子的一部分反向互补的核苷酸序列、以及与通用标签反向互补的核苷酸序列；或者，所述探针由3′端至5′端依次包括与通用标签反向互补的核苷酸序列、与靶分子或靶分子的一部分反向互补的核苷酸序列。使用本发明的通用标签、探针进行检测，在获取样品后，不用标记即可直接进行检测，大幅度的降低了成本，有利于现场检测，简化了实验步骤，操作简单，非专业人员也可操作，便于推广。
文档编号C12Q1/68GK101892291SQ20091008356
公开日2010年11月24日 申请日期2009年5月8日 优先权日2009年5月8日
发明者曹榕, 李炯, 段德民, 郑克孝 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所