专利名称：一种植物基因组快速提取试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，通过对传统碱裂解制备基因组
的方法进行优化而开发了一种适于PCR扩增的快速提取多种植物基 因组的方法，以及适用于该方法的试剂盒。
背景技术：
自1994年首批转基因作物如延熟西红柿和抗除草剂棉花获准商 业化生产以来，国内外已经报道的商业化的转基因作物共有16类70 多种[James:Brief No.21-2000:Global status of commercialized transgenic crops.2000]。转基因作物和转基因食品因其在抗逆性或营养 学价值和食物风味的改善等方面具有传统食品无可比拟的优势，而迅 速占领了巿场，大大满足了人们生活的需要。然而，与此同时，转基 因产品的安全性也是人们 一直关注的话题。包括中国在内的很多国家 要求企业在产品包装中标明其中的转基因成分，以便消费者自主选 择。这就要求国家和企业加强对转基因食品的检测。
基于PCR反应的分子检测具有速度快、灵敏度高、对模板要求 较低等特点，是目前应用最为广泛的转基因食品检测方法。传统的基 因组模板制备方法如CTAB法、SDS法，多是釆用表面活性物质裂 解样品细胞，从而使基因组释放出来，再经过一系列的抽提、分离， 将样品中的杂质一一除去，最终得到纯净完整的DNA分子。这些方 法的优点是得到的基因组纯度高、完整性好，在分子生物学研究上具 有广泛的应用，但是其缺点也是十分明显的——即使经过改进，仍存 在反复离心、沉淀的步骤，消耗大量的人力和时间[GeorgeS.:ASimple
Bacterial DNA .[J]Plant Molecular Biology. 2004,22: 71-81],药品中Tris-饱和酚、异戊醇等存在一定毒性，整个基因组提取过程需要约2h,
这显然不能满足快速检测的需要。
目前国内外开发了多种商品化的DNA提取纯化试剂盒，其分离 原理有的利用核酸的分子量差异，有的利用特异性膜与DNA结合达 到分离、回收的目的，如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同 的材料来源设计了不同的提取方法，操作简单、高效，DNA质量较 高，但价格昂贵且提取量少。
碱裂解法[Klimyuk V.I.:Alkai treatment for rapid preparation plant material for reliable PCR analssis.[J〗Plant.l993，3:493-494]和高温水煮 法 [Henry R丄Practical Applications of Plant Molecular Biology.Chapman&Ha11,1997〗作为常见的快速简便的提取基因组的 方法，利用碱性、高温等条件对植物组织进行处理，使其细胞膜溶解、 蛋白变性，基因组游离出来，得到的基因组不需经过复杂的才纯化过 程，即可直接用于PCR反应。有资料介绍，利用碱裂解法提取基因 组，每人每天可以提取超过5000个样品。但是，在目前的文献中， 这些方法多被应用于幼嫩的根、叶等少数DNA含量丰富的植物组织， 对于样品要求较为苛刻。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适于PCR扩增的快速提取植物基因 组的试剂盒以及相应的提取方法，以满足植物原材料包括植物尤其是 转基因作物分子检测的需要。
碱裂解法提取植物基因组DNA主要包括裂解液裂解、中和液中 和以及沉淀液沉淀等步骤，本发明针对这三个关键步骤进行了优化， 对裂解液、中和液以及沉淀液作了调整，使其能够最大限度地保留基 因组并取出杂质。
基于此，本发明提供一种适于PCR扩增的植物基因组快速提取 试剂盒，其包括如下组成
5裂解液0.3-1.0 mol/LNaOH， 5-20 mmol/LEDTA, 10-30 mmol/L Tris-HCl， 30-60 mmol/L KC1 ， 0.03-0.08% Tween20 ， 0.05-0.15% TritonX-100, 0.05-0.20% PVP， 0.05-0.15%牛血清白蛋白，0.05-0,15% DEPC;或其浓缩液
中和液2誦5 mol/L NaAc, 20-70 mmol/L NaCl, 20-40mmol/L MgCl2， 20-40 mmol/LMnCl2， pH=5.2;或其浓缩液
沉淀液0.05-0.20 % mol/L NaAc和0.05-0.20%mol/L NH4Ac的异 丙醇溶液；或其浓缩液。
优选裂解液0.5mol/L NaOH, lOmmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-HCl， 5O腿ol/LKC1， 0.05% Tween20， 0.1% TritonX-100， 0.1% PVP, 0.1%牛血清白蛋白，0.1%DEPC;或其浓缩液
优选中和液3mol/LNaAc, 50mmol/LNaCl， 25mmol/L MgCl2, 25 mmol/LMnCl2,pH=5.2;或其浓缩液
优选沉淀液0.1 mol/L NaAc和0.1 mol/L NH4Ac的异丙醇溶液； 或其浓缩液。
上述浓缩液可以是工作液浓度的5~20倍，将工作液浓缩后可以 提高试剂盒的使用次数。在使用时，将浓缩液按照浓缩倍数稀释到工 作液状态，稀释液为各试液的溶剂，对于裂解液和中和液而言，稀释 液为水，沉淀液的稀释液为异丙醇。
本发明提供的提取植物基因组的方法，其包括如下步骤
1) 取研磨成粉末状的植物组织样品，按重量体积比l: 5 20加 入上述试剂盒中裂解液；
2) 轻微搅动混匀后，沸水洛50 70S;
3) 加入上述试剂盒中的中和液调节pH至5.2-6.0，轻轻颠倒混
勾；
4) 离心取上清，加入上清液等体积预冷的上述沉淀液，混勾后 离心弃上清；5)用适量乙醇溶液洗涤沉淀并吹干，
在实际使用时，试剂盒一般釆用各试剂的浓缩液形式，这时需要 将它们稀释至工作浓度使用。
其中上述步骤l)优选按照样品与裂解液重量体积比1: 10加入 裂解液；
其中步骤2)沸水洛时间以lmin为宜；
其中步骤3)优选按照裂解液与中和液体积比2: 3加入中和液 中和；
其中步骤4)离心转速一般为12000rpm,离心10 12min,预冷
沉淀液通常以零度以下为佳；
其中步骤5)通常使用70%的乙醇洗涤。
更具体地，可以采用如下步骤进行提取
1)选择植物组织适合部位研磨成粉末后，备用；
2 )称取0.05g 0.lg样品(不同样品不同用量)于2ml Eppendorf
离心管中，加入500 1000jil裂解液；
3) 用枪头小心搅拌使其充分混勻，沸水洛加热lmin;
4) 取出后加入333 666ixl中和液中和，轻轻颠倒混匀；
5) 12000rpm离心10~12min后将尽可能多的上清转移到另一个 新的2ml Eppendorf离心管中；
6) 加入与上清等体积的沉淀液，混匀后12000rpm离心10~12min 后弃去上清，如果加入中和液离心后上清太多，可将上清分两部分沉 淀，最后合并沉淀。
7) 向沉淀中加入适量70%乙醇洗涤并吹干。
在使用时，向离心管中加入适量双蒸水(30^1)溶解，用于PCR 反应并进行琼脂糖凝胶电泳。
本发明所述的样本为植物组织，包含多种植物中可以食用的组织 或器官，以及食品领域内转基因产品。淀液也可以分成两部分加入，例如依次加入0.05倍体积的助沉 液(2mol/LNaAc, 2mol/LNH4Ac)和0.95倍体积的异丙醇，最终
使其比例为沉淀液上清液=1: 1。
本发明所述的沉淀液使用前可以在-20。C冰箱内孕育15-30分钟， 以达到与冷的目的。
本发明中和剂中3mol/LNaAc (pH=5.2)的作用是 一方面，调 节裂解后溶液的pH，经过裂解步骤，在高pH的条件下，富含淀粉 的植物组织因淀粉糊化而呈现粘稠状态，即使长时间高速离心也无法 得到上清液，严重影响植物基因组的提取，加入中和液后，破坏淀粉 糊化状态。另一方面，中性盐溶液(如NaAc、 NaCl等)具有沉淀多 糖、蛋白质的作用，可以有效的去除杂质，净化基因组。
经过中和的基因组由于含有大量盐离子，离子强度较大，且基因 组浓度较小，直接用于PCR反应可能导致结果呈现假阴性。因此引 入含有NH4Ac等盐类助沉剂的醇类沉淀液的沉淀步骤，可以对基因 组进行洗涤，进一步去除醇溶性杂质，降低离子强度，同时也起到浓 缩作用，增加了方法的灵敏度。
此外，本发明在每一步反应中，均进行了试剂优化。例如在裂解 液中加入抑制核酶活性的成分，中和液中加入稳定DNA结构的二价 离子和核酶抑制成分，在沉淀液中加入盐类助沉剂等等。这些都使本 发明用于提取植物基因组时有更大的优势。
本发明优化了裂解液的组成，可以更好的保持基因组的完整性。 优化了中和液的组成与用量，通过调整中和后体系的pH值，增加核 酶抑制成分，来最大程度的保留基因组并去除杂质。同时增加了含有 NH4Ac等盐类助沉剂的醇类沉淀液的沉淀步骤，通过优化沉淀液的 配方来最大限度的获得基因组模板，去除其他杂质并对基因组进行浓 缩以提高检测的灵敏度。本发明仅21min就可以提取出植物的DNA， 直接作为PCR的模板，用于分子生物学尤其是转基因作物的分子检
8测操作。
本发明与其他碱裂解法相比，明显扩大适用样品的范围，即使用
这种方法提取多糖、蛋白质、脂肪含量丰富的样品，仍可以得到令人 满意的实验结果。PCR反应发现,本发明提取的基因组虽然存在降解，
仍适用于600bp以下目的基因的有效扩增，且对植物的内源基因和外
源基因的扩增均有良好效果。而且反应灵敏度高，可用于在复杂的食 物体系中发现含量在1%以上的样品。本发明使用的试剂均为分子生 物学实验室的常见试剂，试剂成本低，毒性小，安全性好，对条件要 求宽松，且方法简便，尤其适用于新鲜样品及转基因作物的快速检测。
图1显示的是本发明方法的技术路线流程图。
图2显示的是使用本发明的方法对多种植物基因组进行提取的 结果，其中l.玉米，2.花生，3.大豆，4.芹菜，5.茼蒿，6.油菜，7.西 红柿，8.胡萝卜，9.西兰花，M为marker。
图3显示的是以IVR226为引物进行PCR扩增，所得产物的电泳 结果。图中各样品依次为l.玉米，2.花生，3.大豆，4.芹菜，5.茼蒿， 6.油菜，7.西红柿，8.胡萝卜，9.西兰花，M为marker, 0为空白对 照。
图4显示的是使用本发明的方法扩增不同片段大小的目的基因 结果，其中l-3为以BT176-570为引物进行PCR扩增，所得产物的 电泳结果，1以本发明的方法提取基因组为模板，2以CTAB法提取 基因组为模板，3为阴性对照。4~6为以CAMV35S-195bp为引物进 行PCR扩增，所得产物的电泳结果，4以本发明的方法提取基因组为 模板，5以CTAB法提取基因组为模板，6为阴性对照。7~9为以 BT176-100bp为引物进行PCR扩增，所得产物的电泳结果，7以本发 明的方法提取基因组为模板，8以CTAB法提取基因组为模板，9为 阴性对照。
9图5显示的是本发明方法的灵敏度的检测结果，其中1~4为玉米 含量50、 10%、 1%、 0.1%的玉米大豆混合样品，5为纯大豆样品，0 为空白对照。
具体实施例方式
以下结合附图和实施例进一步说明本发明，但不应理解为对本发 明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。
本发明中涉及到的百分号"％"，若未特别说明，是指质量百分 比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若 干克；液体之间的百分比，是指在2(TC时容量的比例。
实施例l使用本发明的方法对多种植物基因组进行提取
作为一种用于分子检测的植物基因组快速制备方法，我们希望这 种方法具有广泛的适用性，可以广泛的应用于食品领域内转基因产品 的分子检测。植物中可以食用的组织或器官大体可以分为如下几类 根、茎、叶、花、果实、种子，为了检验方法的普适性，我们在选择 样品的时候不仅要涵盖植物可以食用的组织部分，还要尽量选择不同 科属的植物作为研究对象，因此，在样品选择时，本例选择(l)谷 物类玉米、大豆、花生；(2)茎类；茼蒿、芹菜；(3)叶类油菜、；(4) 根类胡萝卜;(5)花类西兰花；(6)果实类番茄。
具体操作如下
a、 粮谷类BT176转基因玉米、大豆为实验室储备，花生购自 中国农业大学家属区菜巿场，用粉碎机粉碎后过60目筛子备用；
b、 茎类茼蒿、芹菜取茎部分，液氣研磨后备用 e、叶类油菜，取新鲜叶子加液氣研磨后备用d、 根类胡萝卜，去皮后取式适量样品，加液氮研磨后备用
e、 花类西兰花，去除茎部，仅保留花，加液氮研磨后备用
f、 果实类番茄，去除果蒂，取可食部分加液氮研磨后备用 b f样品均购自中国农业大学家属区菜巿场。
样品a f均按本发明的方法提取基因组
1. 称取0.05g样品于1.5ml Eppendorf离心管中，加入500pl裂解 液(裂解液配方为0.5mol/L NaOH， 10mmol/L EDTA， 25mmol/L Tris隱HCl， 5Ommol/LKC1， 0.05% Tween20， 0.1% TritonX-lOO， 0.1% PVP, 0.1%牛血清白蛋白(BSA)， 0.1%DEPC。)；
2. 用枪头小心搅拌使其充分混匀，沸水洛加热lmin;
3. 取出后加入333|il中和液(中和液配方为3mol/L NaAc, 50mmol/L NaCl ， 25mmol/L MgCl2， 25腿ol/L MnCl2, pH=5.2。) 中和，轻轻颠倒混匀；
4.12000rpm离心10min后将尽可能多的上清转移到另 一个新的 1.5ml Eppendorf离心管中；
5. 加入经过-20。C冰箱内孕育15分钟与上清等体积的沉淀液(沉 淀液配方为异丙醇，0.1 mol/L NaAc, 0.1 mol/L NH4Ac。)，混匀后 12000rpm离心10min后弃去上清；
6. 向沉淀中加入适量70%无水乙醇洗涤并吹干；
7. 向离心管中加30^1水溶解，上清即为模板DNA,进行PCR 电泳检测。
选用叶绿体(Chloroplast) rRNA-180为引物作为PCR检测引物， 反应扩增的目的片段约为180bp:引物Chloroplast rRNA-180的碱基
序列为
F5,國CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG -3' R5，-TTC CAT TGA GCT TCT GCA CCT-3'
反应在30|il体系中进行，体系组成包括10 x PCR buffer 3^1(10xPCR Buffer: 100腿ol / L Tris國HCl ， 500 mmol / L KC1， 15 mmol /LMgCl2), 2.5mmol/LdNTP 2.4^il ( Sigma，USA),上、下游引物各 1.5(il (由上海生工合成)，TaqDNA聚合酶0.4jxl ( Sigma，USA ), 提 取的DNA lpil ,用水补足至30^1 。
PCR反应条件为94X:预变性5min; 94°。变性30s， 68。C退火30s， 72°〇延伸30s，共35个循环；最后72。C延伸10min。
基因组用1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物用1.5%琼脂糖凝 胶电泳检测。电泳缓冲液为lxTAE, GOLDVIEW染色，凝胶成像仪 拍照并记录结果。
结果表明经过琼脂糖电泳时后发现，以本发明的方法提取上述 样品得到的基因组并不令人满意。大部分样品点样空中有蛋白残留， 部分样品残留量较多。所有样品的基因组普遍存在严重降解，但不同 组织基因组降解情况不同，如玉米基因组条带主要集中在，500bp以 下，部分组织甚至没有得到电泳可见的基因组(如芽菜、胡萝卜)。 (图2)
尽管如此，对提取的基因组以ChloroplastrRNA-180为引物进行 PCR扩增后，所有样品均得到电泳可见的目的基因条带，且扩增片段 的亮度差异不大(图3)。可见，对于淀粉含量较多的样品(如玉米)， 脂肪含量较多的样品(如花生)，蛋白含量较多的样品(如大豆)，以 及各种新鲜的植物组织，以本发明的方法提取得到的基因组均可用于 PCR扩增。
实施例2使用本发明的方法扩增不同片段大小的目的基因
由本发明的方法所得植物基因组因降解而呈现弥散状态，基因组 电泳条带主要集中1000bp 200bp,而以上实施例中所扩增的基因均 为200bp左右的植物内标基因，因此有较好的扩增效果。为了比较该 方法对不同片段大小的基因的扩增效果，本例选择BT176玉米中的 三段基因作为扩增对象，具体操作如下BT176转基因玉米用粉碎机粉碎后过60目筛子。 按照实施例1的本发明的方法和CTAB法(CTAB法参见许芳, 李鑫,罗欣,刘志国.玉米中转基因成分的定性PCR检测[J].武汉工业学 院学报，2008，27(1):5-7，27.)提取基因组。分别以上述两种方法提取的 DNA为模板，进行PCR电泳检测。
相应选用引物分别为BT176-570,反应扩增的目的片段约为 570bp; BT176-100，反应扩增的目的片段约为100bp; CAMV35S-195， 反应扩增的目的片段约为195bp。引物的碱基序列为
引物名称上下游ji物序列片段大小 /bp
BT176隨570F5，-AAG CAC GGT CAACTT CCG TAC-3' R5 ，-TCG ACT TTA TAG GAA GGG AGA GG-3,570
F5，-GTG TCA CCA GCA GCA AAC CA(3-3' R5、ACT CCA CTT TOT GCA GAA CAG ATC T腸3，
CAMV35S-I95F5，-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3， R5 ，-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3 ，195
其PCR反应体系、10xPCRbuffer、 PCR反应条件及检测条件等 均与实施例1 一致。
结果表明本发明的方法提取的基因组尽管已经片断化，但是不 影响600bp左右片断大小目的基因片段的扩增效果，且扩增效果比 CTAB法提取的基因组作为模板的扩增效果要好一点，这可能因为基 因组片断化后减少了染色体空间折叠造成的位阻，使得引物与目的片 断更容易结合。同样对于195bp和100bp大小的BT176品系和 CAMV35s基因特异性片断也获得了良好的扩增效果(图4)，也就是说 对于本发明的方法提取的基因组对于600bp以下的目的片断扩增效 果比较理想，甚至比CTAB法提取的基因组的扩增效果更好。由此可 以看出，本发明的方法比其他快速提取法能够提取出更高质量的基因 组，并且基因组中因为成分大大减少也减轻了碱裂法对于PCR反应 的抑制效果。由于目前转基因成分定性检测的目的扩增片断基本都小 于600bp,所以本发明的方法完全可以满足转基因产品快速检测的需
13要。
实施例3本发明的灵敏度的检测结果
将BT176转基因玉米粉与大豆粉按质量比50%、 10%、 1%、 0.1% 混合后，按照实施例1的本发明的方法提取基因组，以提取的DNA 为模板，进行PCR电泳检测。选用玉米内标基因IVR226为引物作为 PCR检测的引物，反应扩增的目的片段约为226bp:引物IVR226的 碱基序列为
F5,隱CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TCA C画3' R5'-GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C-3' 其PCR反应体系、10xPCRbuffer、 PCR反应条件及检测条件等
均与实施例1 一致。
结果表明发现当玉米粉的含量小于等于1%时，PCR扩增后可
以得到肉眼可辩的目的基因条带，继续增加大豆粉的含量，则超过该
方法的分辨范围，不易得到目标条带，本发明的方法可以分辨含量大
于1%的样品。(图5)
实施例4试剂盒的组成
配置一 (5倍浓缩液)
浓缩裂解液2.5mol/L NaOH， 50mmol/L EDTA， 125mmol/L Tris誦HCl， 25Ommol/LKC1， 0.25% Tween20， 0.5% TritonX掘，0.5% PVP， 0.5%牛血清白蛋白，0.5%DEPC;
浓缩中和液15mol/L NaAc， 250mmol/L NaCl, 125mmol/L MgCl2， 125 mmol/LMnCl2;
浓缩沉淀液0.5 mol/LNaAc和0.5 mol/LNH4Ac的异丙醇溶液。
配置二
裂解液0.3 mol/L NaOH, 8 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris-HCl ， 30mmol/LKCl， 0.08% Tween20, 0,15% TritonX國100, 0.20% PVP， 0.15%牛血清白蛋白，0.15% DEPC;中和液2mol/LNaAc, 20 mmol/L NaCl， 20mmol/L MgCl2， 20 mmol/L MnCl2,;
沉淀液0.05 mol/L NaAc和0.20mol/L NH4Ac的异丙醇溶液。
配置三
裂解液1.0 mol/L NaOH, 5 mmol/L EDTA ， 30 mmol/L Tris画HCl ， 6Ommol/LKC1， 0.03% Tween20， 0.05% TritonX-100, 0.05% PVP， 0.15%牛血清白蛋白，0.05%DEPC;
中和液5mol/LNaAc， 70 mmol/L NaCl， 30mmol/L MgCl2, 30mmol/LMnCl2, pH=5.2;
沉淀液0.20 mol/L NaAc和0.05mol/L NH4Ac的异丙醇溶液。
配置四
裂解液0.5mol/L NaOH，20 mmol/L EDTA,20 mmol/L Tris-HCl， 40腿ol/L KC1, 0.05% Tween20, 0.1% TritonX國100， 0.05-0.20% PVP， 0.05-0.15%牛血清白蛋白，0.05-0.15% DEPC;或
其浓缩液
中和液3 mol/L NaAc， 50 mmol/L NaCl, 25mmol/L MgCl2, 25 mmol/LMnCl2, pH=5.2;
沉淀液0.1 mol/LNaAc和0.1mol/LNH4Ac的异丙醇溶液。 按照实施例2和3的方法使用本例配置二-四试剂分别提取玉米 基因组DNA并进行实验，结果表明，这三种配置的实验结果与实施 例2和3的实验结果基本相同，实施例2和3的效果更好。
15序列表
〈110> 中国农业大学
<120> —种植物基因组快速提取试剂盒及其应用
〈130> KHP09112453. 5
<160〉 8
<170> Patentln version 3. 5
〈210> <211> <212> <213> <400>
1
20 腿
人工序列 1
cgaaatcggt agacgctacg 20
<210> 2 <211> 21 <212> 腿 <213>人工序列 <400> 2
ttccattgag cttctgcacc t 21
<210> 3 <211> 21 <212> 腿 <213>人工序列 〈400> 3
aagcacggtc aacttccgta c 21
<210> 4 <211> 23 〈212〉 DNA <213>人工序列 <400> 4
tcgactttat aggaagggag agg 23
<210> 5
<211> 21〈212〉 丽 <213>人工序列 ■> 5
gtgtcaccag cagcaaacca g 21
<210> 6 <211> 25 <212> DNA 〈213〉人工序列 <400> 6
actccacttt gtgcagaaca gatct 25
〈210> 7 〈211> 19 〈212> DNA <213>人工序列 〈400> 7
gctcctacaa atgccatca 19
<210> 8 〈211〉 20 <212> 腿 <213>人工序列 <400〉 8
gatagtggga ttgtgcgtca 20
权利要求
1、一种植物基因组快速提取试剂盒，包括裂解液0.3-1.0mol/L NaOH，5-20mmol/L EDTA，10-30mmol/LTris-HCl，30-60mmol/L KCl，0.03-0.08％Tween20，0.05-0.15％TritonX-100，0.05-0.20％PVP，0.05-0.15％牛血清白蛋白，0.05-0.15％DEPC；或其浓缩液中和液2-5mol/L NaAc，20-70mmol/L NaCl，20-40mmol/LMgCl2，20-40mmol/L MnCl2，pH＝5.2；或其浓缩液沉淀液0.05-0.20mol/L NaAc和0.05-0.20mol/L NH4Ac的异丙醇溶液；或其浓缩液。
2、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液的配 置为0.5mol/L NaOH， 10mmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-HCl, 50mmol/LKCl, 0.05% Tween20， 0.1% TritonX-lOO, 0.1% PVP, 0.1% 牛血清白蛋白，0.1%DEPC;或其浓缩液。
3、 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述中和液的配 置为3mol/LNaAc， 50mmol/L NaCl， 25mmol/L MgCl2， 25 mmol/L MnCl2， pH=5.2;或其浓缩液。
4、 如权利要求1~3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述沉 淀液的配置为0.1 mol/L NaAc和0.1 mol/L NH4Ac的异丙醇溶液； 或其浓缩液。
5、 权利要求1 4任一项所述试剂盒在提取植物基因组中的应用。
6、 一种提取植物基因组的方法，其包括如下步骤1) 取研磨成粉末状的植物组织样品，按重量体积比l: 5~20加 入权利要求1 4任一项所述试剂盒中裂解液；2) 轻微搅动混匀后，沸水洛50 70S;3) 加入权利要求1~4任一项所述试剂盒中的中和液调节pH至 5.2-6.0，轻轻颠倒混勾；4) 离心取上清，加入上清液等体积预冷的权利要求1~4任一项 所述沉淀液，混勻后离心弃上清；5) 用适量乙醇溶液洗涤沉淀并吹干，若所述裂解液、中和液以及沉淀液为其浓缩液时，稀释至工作浓 度使用。
7、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中步骤1)按照 样品与裂解液重量体积比1: IO加入裂解液。
8、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中步骤2)沸水 浴lmin。
9、 如权利要求6 8任一项所述的方法，其特征在于，其中步骤3) 按照中和液与裂解液体积比2: 3加入中和液中和。
10、 如权利要求6 8任一项所述的方法，其特征在于，其中步骤4) 离心转速为12000rpm，离心10 12min。
全文摘要
本发明公开了一种适于PCR扩增的快速提取植物基因组的试剂盒，包括裂解液、中和液和沉淀液，本发明试剂盒针对传统碱裂解制备基因组的方法进行改进和优化，扩大了碱裂解法制备基因组的适用范围。本发明广泛适用于多种植物的基因组提取，并且可直接从植物种子中快速提取出用于PCR模板的基因组。对于600bp的目的基因的检测效果显著，对内源基因和外源基因均有良好的扩增效果，可以发现待测组分含量大于1％的样品。整个基因组提取时间控制在21min，大大缩短了基因组提取时间。
文档编号C12N15/10GK101575597SQ20091008535
公开日2009年11月11日 申请日期2009年5月21日 优先权日2009年5月21日
发明者南 张, 李筱婷, 罗云波, 许文涛, 黄昆仑 申请人:中国农业大学