专利名称：：流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法
技术领域：
：本发明涉及一种rRT-PCR检测技术，尤其涉及一种流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法。
背景技术：
：流感病毒基因组由8条负链RNA节段构成。根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为A型、B型、C型。A型流感病毒根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为16个HA亚型和9个NA亚型；B型和C型流感病毒不分亚型。A型常引起世界性大流行；B型、C型则以局部暴发和散发流行为特征。2009年3月，墨西哥和美国先后发现了甲型H1N1流感病毒感染病例，至2009年5月21日，全球己经有42个国家出现甲型H1N1流感确诊病例，确诊病例超过l万，感染人数呈不断上升趋势。目前的数据显示，该病毒已经具备了人际传播的能力，人群对该病毒的免疫低下，因此病毒在人际之间的传播能力较普通流感病毒强。甲型H1N1流感潜伏期一般1至7天，早期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。部分患者病情来势凶猛、突然高热、体温超过39'C，甚至继发严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、休克及Reye综合征、呼吸衰竭及多器官损伤，最后导致死亡。甲型流感H1N1亚型病毒的基因核酸序列与季节性流感病毒H1N1接近，病原的诊断需要采用较为复杂和繁琐的基因序列测定，难以在普通实验室进行。现有技术中，采用的流感病毒检测方法为鸡胚病毒分离培养方法，灵敏度高。上述现有技术至少存在以下缺点操作费时、需3周时间，而且对实验室的要求也比较高。
发明内容本发明的目的是提供一种操作简单、应用方便的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的本发明的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，包括以下一种或多种引物和探针甲型流感病毒特异性引物和探针、两组新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针、新甲型流感病毒特异性弓I物和探针；所述甲型流感病毒特异性引物和探针针对甲型流感病毒M基因相对保守区；所述两组新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针针对新甲型H1N1流感病毒HA基因相对保守区；所述新甲型流感病毒特异性引物和探针针对新甲型流感病毒NP基因相对保守区。本发明的应用上述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，包括步骤首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA;然后，利用一步法rRT-PCR试剂盒加入所述引物和探针进行核酸扩增；之后，根据Ct值判断rRT-PCR检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法，由于包括针对甲型流感病毒M基因、新甲型H1N1流感病毒HA基因、新甲型流感病毒NP基因相对保守区引物和探针，可以通过rRT-PCR法检测流感病毒，操作简单、应用方便。具体实施例方式本发明的流感病毒rRT-PCR(real-timeRT-PCR)检测引物和探针，其较佳的具体实施方式是，包括以下一种或多种引物和探针甲型流感病毒特异性引物和探针、两组新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针、新甲型流感病毒特异性引物和探针；所述甲型流感病毒特异性引物和探针针对甲型流感病毒M基因相对保守区；所述两组新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针针对新甲型H1N1流感病毒HA基因相对保守区；所述新甲型流感病毒特异性引物和探针针对新甲型流感病毒NP基因相对保守区。所述引物和探针可以包括长度为1928bp的寡核苷酸片段；其中，针对M基因和HA基因的探针与目的基因负链的碱基序列一致，针对NP基因的探针与目的基因正链的碱基序列一致。所述甲型流感病毒特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列引物序列5，-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3，；5，-GGGCATTYTGGACMAKCGTCTACG-3，；探针序列5，FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-TAMARA3，；第一组所述新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列引物序列5，-ACATTCGAAGCAACTGGAAA-3，；5，-GTRTTRCAATCGTGGACTGG-3，；探针序列5，FAM-TCCATTGCGAAKGCATATCTCGG-BHQ1-3';第二组所述新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列引物序列5，-GGGTAAARCTGGAATCRACAA-3，；5，-CCAGGGAGACTAMCAGTACCA-3，；探针序列5，FAM-TTGGCGATCTAYTCAACTGYCGCC--朋Ql-3，；一所述新甲型流感病毒特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列引物序列5，-TCMGACATGCGAACRGAAGTT-3，；5，-GGGYTCGTTGCCTTTTCGT-3，；探针序列5，HEX-CCAGAAGATTTGTCCTTCCA--BHQ1-3，。上述探针序列两端的标记FAM、TAMARA、BHQ1、HEX为荧光素标记。本发明应用上述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，其较佳的具体实施方式是，包括步骤首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA;然后，利用一步法rRT-PCR试剂盒加入所述引物和探针进行核酸扩增；所述流感病毒可以包括以下一种或多种病毒甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、新甲型流感病毒。本发明中的引物和探针序列(5'—3')及其检测的靶片段如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>具体实施例包括了寡核苷酸引物的设计、待检样本的处理、检测和分析。为进一步说明流感病毒rRT-PCR检测引物及应用方法，参照下列实施例进行说明实施例一甲型流感病毒H1N1rRT-PCR寡核苷酸引物的设计与合成GenBank数据库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/ge画es/FUJ/FLU.html)中禾口中国国家流感中心病毒序列数据库中下载猪源流感病毒H1N1和甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1等亚型M基因、NP基因和HA基因全序列，软件比对分析所有甲型流感病毒M基因序列的一致性，选择相对保守区设计引物和探针；将猪源H1N1、新甲型H1N1和季节性甲型流感病毒H1N1所有NP基因和HA基因序列放在一起比对，选择相对保守区设计引物和探针。引物和探针设计中允许同一变异位点允许2个及2个以下简并碱基。将所提取的备选引物满足以下要求进行筛选①探针长度L在1928bp之间；②Tm值在4259'C之间；③GCM在2575%之间；④polyN《4bp;⑤Hairpin《4bp;覆盖率>90%;⑦进行BLAST筛选，特异性分数〉LX0.4。最佳Tm值设定在47'C，最佳探针长度为20-25bp。实施例二本发明检测未知病毒的应用举例1.病毒RNA的提取取病毒采样液200uL，加入500uL裂解液，按RNeasyMiniKit(Qiagen公司，catalogtt74104)说明书提取病毒RNA50uL。2.rRT-PCR反应1)体系配置使用QIAGENQuantiTectTMProberRT-PCRKit(catalog#20443)反应液组分体(Hi)积2xQuantiTectProbeRT-PCRMasterMix上游引物(40uM)下游引物(40uM)Probe(10pM)QuantiTectRTMix病毒核酸/RNARNaseFreeH2012.50.50.50.50.255.0Upto252)rRT-PCR:将加好上述反应体系的反应管放于PCR仪进行rRT-PCR，反应程序如下6(TC作用5分钟；5(TC作用30分钟；95。C作用15分钟；9fC变性15秒；50。C退火30秒；72。C延伸30秒；回到第5步，45个循环。3.结果判断阴阳对照结果成立的情况下判断结果，及阴性参照没有Ct值，而阳性参照有Ct值。一般情况的下Ct小于38的可以判断为阳性。本发明提供了4套用于甄别甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、新甲型流感病毒的特异性寡核苷酸引物及探针序列；并提供了rRT-PCR的检测体系及其在流感病毒快速检测中的应用。检测评价特异性评价共选取国内近三年流行季节性流感病毒H1N1亚型20株进行检测，qFluA均能检出，而qSW-m-1、qSW-Hl-2和qS丽P均不能检出；选取10株猪流感病毒H1N1亚型、2株新甲型流感病毒H1N1亚型进行检测，四对引物和探针均能检出；选取甲型流感病毒H3N2进行检测，除qFluA检测为阳性外，其余三对检测均为阴性；选取B型流感病毒进行检测，四对引物检测均为阴性。灵敏性评价用来自美国血凝单位为32HA/50WL的H1N1毒株(A/California/09/2009)200uL提取RNA50uL，10倍梯度稀释显示灵敏性达到10—5-10—7稀释度。本发明可以将rRT-PCR技术应用于新甲型H1N1流感病毒(猪流感)的甄别、检测体系中。为新甲型H1N1流感病毒的实验室诊断提供了有效的检测技术，为新甲型H1N1流感病毒的早发现、早预防和早治疗以及公共卫生策略的制定提供技术手段和检测依据。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。〈110〉中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所<120〉流感病毒RT-PCR检测引物及检测流感病毒的方法〈160〉12〈210〉1<211〉22<212>DNA〈213>人工序列〈220〉<223〉甲型流感病毒特异性引物〈400〉1gaccratcctgtcacctctgac〈210>2〈211〉25〈212〉■〈213>人工序列〈220〉〈223〉甲型流感病毒特异性引物〈400〉2gggcattytggacaaakcgtctacg<210〉3〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220>〈223〉甲型流感病毒特异性探针〈400〉3tgcagtcctcgctcactgggcacg〈210〉4〈211〉20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物<400>4acattcgaagcaactggaaa〈210〉5<211>20〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223>新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物〈400〉5gtrttrcaatcgtggactgg〈210〉6〈211〉23<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特异性探针<400〉6tccattgcgaakgcata/tctcgg<210>7<211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物〈400>7gggt333rctgg33tCr3C33<210>8<211〉21〈212〉腿〈213〉人工序列〈220><223〉新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物<400〉8ccagggagactamcagtacca〈210>9<211>24<212〉丽A<213〉人工序列<220〉〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特异性探针〈400〉9ttggcgatctaytcaactgycgcc〈210〉10<211〉21〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉<223>新甲型流感病毒特异性引物〈400〉10tcmgacatgcgaacrgaagtt〈210〉11〈211〉19<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉新甲型流感病毒特异性引物<400>11gggytcgttgccttttcgt〈210〉12〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉新甲型流感病毒特异性探针<400〉12ccagaagatttgtccttcca09-05-22关闭窗权利要求1、一种流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，其特征在于，包括以下一种或多种引物和探针甲型流感病毒特异性引物和探针、两组新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针、新甲型流感病毒特异性引物和探针；所述甲型流感病毒特异性引物和探针针对甲型流感病毒M基因相对保守区；所述两组新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针针对新甲型H1N1流感病毒HA基因相对保守区；所述新甲型流感病毒特异性引物和探针针对新甲型流感病毒NP基因相对保守区。2、根据权利要求1所述的流感病毒RT-PCR检测引物，其特征在于，所述引物和探针包括长度为1928bp的寡核苷酸片段；其中，针对M基因和HA基因的探针与目的基因负链的碱基序列一致，针对NP基因的探针与目的基因正链的碱基序列一致。3、根据权利要求2所述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，其特征在于所述甲型流感病毒特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列引物序列5，-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3，；5，-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3，；探针序列5，FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-TAMARA3，；第一组所述新甲型HlNl流感病毒m特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列引物序列5，-ACATTCGAAGCAACTGGAAA-3，；5，-GTRTTRCAATCGTGGACTGG-3，；探针序列5，FAM-TCCATTGCGAAKGCATATCTCGG-BHQ1-3，；第二组所述新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列引物序列5，-GGGTAAARCTGGAATCRACAA-3，；5，-CCAGGGAGACTAMCAGTACCA-3，；探针序列5，FAM-TTGGCGATCTAYTCAACTGYCGCC—BHQ1-3，；所述新甲型流感病毒特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列引物序列5'-TCMGACATGCGAACRGAAGTT-3，；5，-GGGYTCGTTGCCTTTTCGT-3';探针序列5，HEX-CCAGAAGATTTGTCCTTCCA—BHQl-3，。4、根据权利要求3所述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，其特征在于，所述探针序列两端的标记FAM、TAMARA、BHQ1、HEX为荧光素标记。5、一种应用权利要求l至4任一项所述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，其特征在于，包括步骤首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA;然后，利用一步法rRT-PCR试剂盒加入所述引物和探针进行核酸扩增；之后，根据Ct值判断rRT-PCR检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。6、根据权利要求5所述的检测流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒包括以下一种或多种病毒甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、新甲型流感病毒。全文摘要本发明公开了一种流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法，包括甲型流感病毒特异性引物和探针、两组新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针、新甲型流感病毒特异性引物和探针等，4种共12条寡核苷酸引物和探针序列，同时公开了待检样本的处理、rRT-PCR反应体系及反应条件、结果分析。能快速有效的甄别甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、新甲型流感病毒。操作简单、应用方便，为临床诊断、检验检疫等领域的流感疫情早期预警机制提供了可行的技术支持。文档编号C12R1/93GK101560574SQ20091008547公开日2009年10月21日申请日期2009年5月22日优先权日2009年5月22日发明者李德新,李晓丹,温乐英,伟王,王大燕,舒跃龙,高荣保申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所