专利名称：：一种检测猪初生重和断奶重性状的方法及其专用试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测猪初生重和断奶重性状的方法及其专用试剂盒。
背景技术：
：猪的养殖是养殖业的重要组成部分，目前我国已是世界上最大的养猪生产国。猪的皮、骨、肉、脂可供食用或用作工业原料，猪的器官(心脏、肝脏、皮肤等)正被研究用于人体器官移植，猪的排泄物可做肥料。所以，不管是对于满足人类的需要来说，还是增加经济效益来说，猪的养殖都是非常重要的。我国的养猪生产水平在近几十年得到了较大的提高，但仍落后于欧美一些国家。生产效率不高削弱着养猪业的经济效益，而生产效益则可以通过提高母猪繁殖力和肉猪出栏率得到提高。衡量母猪生产性能的主要指标是母猪能否生产出较重的初生重和断奶重的子猪。子猪的初生重和断奶重成为猪养殖业中影响经济效益的两个重要指标。平均初生重大，变异系数小，说明窝整齐度好，对提高仔猪成活率非常有好处，平均初生重大也可以剌激母猪多产奶。大量调查数据证明，仔猪初生重1500-1600克的猪场经济效益要比出生重1200-1300克的猪场好的多。在2006年国际猪兽医学会(IPVS)会议上，明尼苏达州大学JohnDeen运用预测统计模型论述了子猪初生重对断奶重和断奶前死亡率的影响初生重小断奶重就小，初生重每增加1克，平均断奶重增加2.34克；初生重每增加100克，断奶前死亡率可能会降低10%。断奶重小，断奶过渡就难，保育期死亡率增加、育肥期增重速度慢、饲料效率变差，出栏时间就会延长。断奶重偏小是国内猪场普遍存在的问题，大多数猪场28天断奶重6.5-7.5千克，管理好的猪场28天断奶重可达到8-9.3千克以上。
发明内容本发明的目的是提供一种检测猪初生重和断奶重性状的方法及其专用试剂盒。本发明提供的辅助检测猪初生重和/或断奶重性状的方法，是检测待测猪的基因型为ID基因型还是DD基因型；所述DD基因型为基因组DNA中缺失序列1所示DNA片段的纯合体；所述ID基因型为基因组DNA中缺失序列1所示DNA片段的杂合体；DD基因型的猪的初生重和断奶重高于ID基因型的猪。II基因型为基因组DNA中具有序列l所示DNA片段的纯合体。所述DD基因型可为基因组DNA中的序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第211-255位核苷酸的纯合体；所述ID基因型可为基因组DNA中的序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第211-255位核苷酸的杂合体。n基因型为基因组DNA中具有序列4所示DNA片段的纯合体。所述方法具体包括如下步骤1)将待测猪的基因组DNA作为模板，用特异性引物对进行PCR扩增；所述特异性引物对为序列表的序列2所示的DNA片段和序列表的序列3所示的DNA片段；2)检测PCR扩增产物。如果PCR产物只有一种，且含有序列表的序列1所示的DNA片段，待测猪为II基因型；如果PCR产物只有一种，且不含有序列表的序列1所示的DNA片段，待测猪为DD基因型；如果PCR产物有两种，一半含有序列表的序列1所示的DNA片段的，另一半不含有序列表的序列1所示的DNA片段的，待测猪为ID基因型。DD基因型的猪的初生重和断奶重高于ID基因型。所述待测猪具体可为长白猪。本发明还保护核苷酸序列为序列表的序列1所示的DNA片段。含有序列表的序列1所示的DNA片段的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。本发明还提供了辅助检测猪初生重和/或断奶重性状的特异性引物对，是序列表的序列2所示的DNA片段和序列表的序列3所示的DNA片段所述引物对可应用于辅助检测猪初生重和/或断奶重性状。所述引物对还可应用于制备辅助检测猪初生重和/或断奶重性状的试剂盒。本发明还保护一种辅助检测猪初生重和/或断奶重性状的试剂盒，所述试剂盒含有所述特异性引物对。所述方法、所述DNA片段、所述引特异性引物对、所述试剂盒均可应用于猪的育种。本发明提供的DNA片段在猪群中具有缺失多态。基因型为DD的待测猪的初生重与基因型为ID的待测猪的初生重存在显著性差异(P〈0.05);基因型为DD的待测猪的断奶重与基因型为ID的待测猪的断奶重存在极显著性差异(P<0.01);DD基因型的猪的初生重和断奶重高于ID基因型。本发明的DNA片段可用于检测猪的初生重和断奶重等生长性状，从而为猪的分育种提供了一个新的遗传标记。本发明的DNA片段、引物对、试剂盒和方法将在猪的育种中发挥重要作用。图1为三种基因型的样本的电泳结果。M:DNA分子量标准(100-1500bpladder)。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1、特异性DNA片段的发现和不同猪群的基因频率统计一、特异性DNA片段的发现试验样本的信息见表l。表1试验样本信息品种组合样本数类型购买途径五指山猪Wuzhishan36近交系小型猪中国农业科学院畜牧研究所巴马香猪Bamaxiangpig45近交系小型猪广西大学巴马香猪近交繁育中心长白猪Landracepig329长白纯种广东温氏集团提取每个样本的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR。PCR的引物对如下PLInDell:5，-TGATGTGACCAACAAGGACT-3'(如序列表SEQIDNO:2);PRInDell:5，-GGATCGAACCTGCATCTC-3'(如序列表SEQIDNO:3)。PCR体系(20pL):猪基因组DNA约100ng，含IXbuffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP终浓度为150ixmol/L，引物终浓度为0.2umol/L，2U7邻DNA聚合酶(PromegeO。PCR扩增程序94。C5min，循环30次(94°C、30s，61°C、30s，72°C、30s)，最后72'C延伸5min。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照，样本共显示3种带型。将PCR产物分别进行测序，测序结果表明33个样本的PCR产物只有一种，PCR产物为序列表的序列4所示的DNA片段(341bp)，将其命名为II基因型；262个样本的PCR产物只有一种，PCR产物为序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第211-255位核苷酸的DNA片段(297bp)，将其命名为DD基因型；115个样本的PCR产物为两种DNA片段的混合物，将其命名为ID基因型。应用以上PCR引物对对样本的基因组DNA进行PCR扩增，若得到单一341bp片段，则其基因型为II纯合体；若得到单一297bp片段，则其基因型为DD纯合体;若得到341bp和297bp两个片段，其基因型为ID杂合体。II、DD、ID三个基因型样本的带型见图1。二、不同猪群的基因型和基因频率统计在分析的3个猪群中，基因型及等位基因频率统计结果如表2所示。_表2特异性DNA片段在3个猪群中的分布_突变位点InDell(45bp)一品种数量等位基因频率不同基因型个体的数量IDIIIDDD450.83330.166730150360.34720.6528319143290.12310.8769081248结果表明在所检测的3个猪品种中，中国地方猪群(巴马香猪和五指山猪)都是II、ID基因型占优势，而国外猪群(长白猪)是DD基因型占优势。巴马香猪B咖axiang五指山Wuzhishan长白猪Landrace实施例2、特异性DNA片段与猪初生重和断奶重性状的关联分析用于性状关联分析的材料为实施例1中的329头长白猪。一、模型的建立首先建立如下的分析模型以消除性别、组合及屠宰批次对表型值的影响Yijk=n+BATCHYSEXj+COMBINATIONk+(BS)ij+(BC)ik+(SC)jk+Sijk，其中，Yijk是性状观察值，p为总体均数，BATCHi为批次效应，SEXj为性别效应，COMBINATIONk为组合效应，(BS);j为批次和性别的互作效应，(BC)jk为批次和组合的互作效应，(SC)jk为性别和组合的互作效应，Sijk为随机误差，假定服从N(0，a2)分布。应用该模型对每个性状进行分析并获得一个新的性状值，即标准化的残差值，然后将所获得残差值作为新的性状值，再建立如下的分析模型Yi产u+GEN0TYPEi+e!」Yij是新的性状值，u是新的性状值的总体均值，GENOTYPEi为基因型效应，e;j为随机误差，假定服从N(0,o2)分布。至此该模型已经消除了性别、组合及屠宰批次的系统误差。应用该模型就可以直接分析基因型的效应，同时进行基因型间的两两比较。二、关联分析试验猪群基因型与经济性状关联分析是应用SPSS软件中的一般线性模型程序来完成的。利用实施例l获得的基因型检测结果，对每头猪进行基因型与生长性状以及免疫性状间的关联分析。在消除了品种、屠宰批次以及性别之间的差异后，基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表3。结果发现，248个基因型为DD的个体与81个基因型为ID的个体在初生重存在显著性差异(P<0.05)，在断奶重存在极显著差异(P<0.01)。表3基因型与猪初生重和断奶重性状的关联分析<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注肩注*表述P〈0.05;肩注**表述P〈0.01。序列表<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所<120>—种检测猪初生重和断奶重性状的方法及其专用试剂盒〈130>CGGNARY92079〈160>4〈210>1〈211〉45〈212〉DNA〈213>猪属猪(Sus)〈400〉1taaatcaaaactcataatggccattaaatcaaaactcataatggc45<210>2<211>20〈212>賺〈213>人工序列<220>〈223><400>2tgatgtgaccaacaaggact20<210>3<211〉18<212>DNA<213〉人工序列〈220>〈223〉<400>3ggatcgaacctgcatctc18<210〉4<211〉341〈212〉腿<213>猪属猪(Sus)〈400>4tgatgtgax:c肌c肪ggacttaMccctg8肪tataca肌tagcttatacagctc肪taa60caaaaaaccaaac肌cccaattg3aacatgggcag2iag2icctaiaeitaaac3ttttggcaa120agacgatatacagatggccaataggcacatgaa犯aBtgctcaccattgctaattattag180agaatgcaaatcaaaactcataatggccattaaatc肌aactcataatggcwttaaatc240aaaactcataatggccattaaaaagtctataagaggagttcccactgtggccacaatggg300gtcatcagtgtcttgggagcactgagatgcaggttcgatcc34权利要求1、辅助检测猪初生重和/或断奶重性状的方法，是检测待测猪的基因型为ID基因型还是DD基因型；所述DD基因型为基因组DNA中缺失序列1所示DNA片段的纯合体；所述ID基因型为基因组DNA中缺失序列1所示DNA片段的杂合体；DD基因型的猪的初生重和断奶重高于ID基因型的猪。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于所述DD基因型为基因组DNA中的序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第211-255位核苷酸的纯合体；所述ID基因型为基因组DNA中的序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第21卜255位核苷酸的杂合体。3、如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤1)将待测猪的基因组DNA作为模板，用特异性引物对进行PC財广增；所述特异性引物对为序列表的序列2所示的DNA片段和序列表的序列3所示的DNA片段；2)检测PCR扩增产物。4、核苷酸序列为序列表的序列1所示的DNA片段。5、含有权利要求4所述DNA片段的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。6、辅助检测猪初生重和/或断奶重性状的特异性引物对，是序列表的序列2所示的DNA片段和序列表的序列3所示的DNA片段。7、权利要求6所述特异性引物对在辅助检测猪初生重和/或断奶重性状中的应用。8、权利要求6所述特异性引物对在制备辅助检测猪初生重和/或断奶重性状的试剂盒中的应用。9、一种辅助检测猪初生重和/或断奶重性状的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有权利要求6所述特异性引物对。10、权利要求1至3中任一所述方法、权利要求4所述DNA片段、权利要求6所述特异性引物对、权利要求9所述试剂盒在猪的育种中的应用。全文摘要本发明公开了一种辅助检测猪初生重和/或断奶重性状的方法，是检测待测猪的基因型为ID基因型还是DD基因型；所述DD基因型为基因组DNA中缺失序列1所示DNA片段的纯合体；所述ID基因型为基因组DNA中缺失序列1所示DNA片段的杂合体；DD基因型的猪的初生重和断奶重高于ID基因型。本发明还提供了辅助检测猪初生重和/或断奶重性状的特异性引物对，是序列表的序列2和序列3所示的DNA片段。本发明还提供了与猪初生重和/或断奶重性状相关的DNA片段，如序列1所示。本发明的DNA片段可用于检测猪的初生重和断奶重等生长性状，从而为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记。本发明的DNA片段、引物对、试剂盒和方法将在猪的育种中发挥重要作用。文档编号C12N15/12GK101603087SQ20091008969公开日2009年12月16日申请日期2009年7月24日优先权日2009年7月24日发明者何文波,唐中林,彭克美,勇李,奎李,杨述林,牟玉莲,王志伟申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所