专利名称：融合肝素酶及其编码基因与制备方法
技术领域：
本发明涉及酶工程和生物催化领域，特别涉及融合肝素酶及其编码基因与制备 方法。
背景技术：
肝素酶(h印arinase)是一类作用于肝素的多糖裂解酶，在许多种微生物中发 现，包括棒杆菌foi777^a"en'咖sp.(高宁国等，肝素酶产生菌的筛选及发酵条 件，微生物学报1999 Vol. 39:64-67)、鞘胺醇杆菌5^ jV^otecfen'柳sp.(高 宁国等，鞘胺醇杆菌肝素酶的产生，微生物学报2003 Vol. 43:813-816)、枯草芽 胞杆菌^3"77m s"力"'7is(王忠彦等，肝素酶产生菌的筛选及其粗酶性质的研究， 四川大学学报(自然科学版)2002 Vol. 39:777-779)、环状芽孢杆菌Asw77m c irci/7s/751 (Yasutaka Tahara et al. ， Purification and characterization of h 印arinase that degrades both heparin and heparin sulfate from 5acj'77iAs ci薦7馬BioSci. Biotechnol. Biochem. 2002 Vol. 66:1181-1184)、解肝素 拟杆菌尸i"erate2Js力e/ arz./70^ics (Kazuyuki Sugahara et al. ， Characteriz at ion of heparinase from an oral bacterium尸reKote2Z3 / e/ ar//2aZ/f_z'cs J. Biochem. 1998 Vol. 123:283-288)、粪便拟杆菌5a"eroiofes Warcoris HJ-15 (D ong Hyuu Kim et al. ， Purification and characterization of a novel hepar inase from 5acfe渭Ves sfe彻"'5"耵-15 J. Biochem. 2000 Vol.128: 323-328) 和肝素黄杆菌尸7araZ a"eri咖力e/ ari/7咖(Sasiekharan, R. 1991 Ph.D. Thesis, Havard University)。但是来自肝素黄杆菌的肝素酶是商业化的唯一来源。
肝素酶的研究具有十分重要的意义(Sasiekharan，R. 1991 Ph. D. Thesis, Ha vard University; Sasiekharan，R. et al. ，A comparative analysis of the prim axy sequences and characteristics of heparinase I，II，and III from F73ra Z acteriw/z 力e/ arj'/ wffl Biochemical and Biophysical Research Communication 1996 Vol. 229:770-777):肝素酶是多糖裂解酶的一种，用于研究肝素酶及其底物 多糖肝素之间的相互作用有助于阐明多糖裂解酶的作用机制；肝素酶可以用于解析 肝素等复杂粘多糖的结构及其生物学功能；肝素酶可以用于解析人体内的凝血和抗
3凝血机制；肝素酶可以用作临床血液肝素化的去除，防止手术后出血；肝素酶用于 PCR反应前血液制品的处理；肝素酶可以用于制备低分子的抗凝血药物低分子量肝 素。
来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有三种，分别命名为肝素酶I (EC 4.2.2.7)、 II (NO EC code)和III (EC 4. 2. 2. 8) (Robert J. Linhardt et al. ， Purification and characterization of heparin lyases from F73ra6acte"'w/H力eparz'/3咖JEC 1992 Vol. 267:24347-24355)。其中肝素黄杆菌的肝素酶I (H印A)是目前为止研 究最充分的肝素酶之一，其在低分子肝素的生产和体外血液循环中肝素的去除上的 应用已有报道，具有巨大的市场开发价值。
肝素酶I通常是从肝素黄杆菌发酵液中提纯获得的，通常需要经过多步的色谱 纯化，收率比较低。肝素黄杆菌增长速度慢，肝素酶的生产稳定性差，而且，产肝 素酶需要价格昂贵的肝素诱导，增加了酶的成本，因而重组菌生产肝素酶I受到极 大的关注，但通常情况下重组肝素酶I极容易形成包涵体，需要复杂的复性过程才 能形成活性蛋白。
来自大肠杆菌的天然的麦芽糖结合蛋白MBP能够与麦芽糖特异吸附，参与大肠 杆菌对麦芽糖的转运和利用。MBP不但能与amy lose结合，实现亲和分离，也能与 马铃薯淀粉结合实现亲和分离(廉德君等， 一种改进的融合蛋白亲和层析纯化方法， 生物化学与生物物理进展簡Vol. 25:283-284; Usha Srinivasan et al. ， A convenient method for affinity purification of maltose binding protein fusions Journal of Biotechnology 1998 Vol. 62:163-167)，从而可大大降低 酶的分离纯化的成本。本研究小组前期利用融合蛋白技术，将MBP与从肝素黄杆菌中克 隆得到肝素酶I融合，构建了高效生产可溶性的肝素酶I的基因工程菌株，5L发酵罐生 产酶活可达20000IU/L以上(Chen Yin, Xing Xin-hui, Ye Feng-chun, Kuang Ying, Luo Ming-fang. Production of MBP-HepA fusion protein in recombinant Escherichia coli by optimization of culture medium, Biochemical Engineering Journal, 2007， 34:114-121)。该法得到的重组肝素酶I只需进行一步亲和层析就能达到95%的纯化效果。 此项工作已申请专利，专利号为200410038098.6。
绿色荧光蛋白GFP，自从1994年Chalfie等(Chalfie M， Tu Y， Euskirchen G, Ward WW， Prasher DC Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 1994， 263:802-805 )首次在大肠杆菌细胞中表达出来后，
4由于该荧光蛋白稳定、对细胞无毒性、荧光检测简单，而且产荧光不需要底物等特 点，已成为在生理学和生物技术的研究和开发中应用最广泛的报告蛋白之一。但是，
目前为止GFP在生物学和生物技术中的应用主要侧重于各种定性解析，将其应用于 蛋白质生物生产过程的定量监测及过程优化是一个新的领域。Poppenborg等 (Poppenborg L， Friehs K， Flaschel E The green fluorescent protein is a versatile reporter for bioprocess monitoring. J. Biotechnol. 1997， 58:79-88 ) 首次证明了将GFP融合到一亲和耙物上可以实现诸如培养、色谱分离等过程的快速 监测。因此，GFP是用于定量快速监测细胞培养、发酵过程优化以及追踪固定化酶 使用过程特性的具有极大潜力的工具。本实验室前期利用融合蛋白技术，将GFP与从 肝素黄杆菌中克隆得到肝素酶I融合，构建了生产可溶性的肝素酶I的基因工程菌株(Chen Yin, Xing Xin-hui, Ye Feng-chun， Kuang Ying. Soluble expression and rapid quantification of GFP-hepA fusion protein in recombinant Escherichia coli， Chinese Journal of Chemical Engineering, 2007, 15:122-126) 。 GFP的融合可以利 用荧光测量对工程菌浓度及肝素酶I酶活进行快速定量追踪，有利于肝素酶I生产过程的 优化和控制，有利于肝素酶的保存和应用过程的快速评价，有利于解析大分子肝素的结构 和降解机理。此项工作已申请专利，专利号为200510090872.2。
现有的肝素酶I生产和催化工艺中，缺乏酶生产一分离一应用整个过程的集成 方法。因此，肝素酶I的高效可溶表达、分离纯化、固定化、高效催化以及酶活的 快速检测等多功能化集成就具有十分重要的意义。融合蛋白技术是实现这一多功能 化集成的有效手段之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合肝素酶。
本发明提供的融合肝素酶，命名为GFP-MBP-HepA，是如下a)或b)的蛋白
a) 序列表中序列1的第8-1015所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b) 在序列表中序列1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白质。
上述b)的蛋白的氨基酸序列具体可为序列表中序列1所示的氨基酸序列。 上述蛋白的编码基因，命名为她-m^-7^/"，也属于本发明的保护范围之内。 上述基因的序列是如下l)或2)或3)的核苷酸序列1) 序列表中序列2所示的核苷酸序列；
2) 在高严谨条件下与序列表中序列2的核苷酸序列杂交且编码上述蛋白的核苷 酸序列；
3) 与序列表中序列2所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码上述蛋白 的核苷酸序列。
序列2中，g步的编码区是序列2的自5'端第22-735位的碱基；m^的编码区是 序列2的自5，端第778-1878位的碱基；//印乂的编码区是序列2的自5，端第 1956-3045位的碱基。
所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液， PH7.2， 7%SDS)中，65。C预杂交30min;弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷 酸钠缓冲液，pH7.2， 7%SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65t:杂交12hr;弃杂交 液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7,2， 5%SDS) ， 65。C洗膜2次，每次 30min;加入洗膜液II (20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2， 1%SDS) ， 65t:洗膜30min。
含有上述基因的重组载体和转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。
上述重组载体是通过以下步骤构建的-
将序列表中序列2的第1位-1878位所示的DNA片段插入质粒pMAL-c2x-HepA 的多克隆位点，得到重组载体；
所述质粒pMAL-c2x-HepA是将序列2的第1956-3045位所示的肝素酶I的编 码基因插入到质粒pMAL-c2x的BamHI和HindIII酶切位点之间，得到的重组质粒。
含有权利要求上述基因的重组菌也属于本发明的保护范围之内。
上述重组菌是含有上述的重组载体的重组大肠杆菌。
本发明的另一目的在于提供一种生产肝素酶的方法，是将上述的重组菌诱导培 养，表达得到肝素酶。
上述诱导培养条件是0.3-lmM的IPTG， 10-30。C诱导培养5-30小时。 摇瓶培养实验证明本发明产生的融合肝素酶的酶活可达1214.4 IU/L培养基， 比酶活可达2.839 IU/mg蛋白。本发明可以利用GFP蛋白实现菌体浓度和酶活的快 速在线检测。因为本发明中酶活与细菌浓度、荧光强度均存在着良好的线性关系， 可以利用荧光强度实现培养过程中细菌浓度以及酶活的快速定量。上述结果说明在 发酵培养过程中可以通过检测荧光强度以快速获得菌体浓度和肝素酶I的酶活的变 化，从而实现高效生产三重融合肝素酶I的培养过程优化和控制。
图1为表达载体pMAL-hepA的构建过程示意图。
图2为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的肝素酶I基因电泳图谱。
图3为表达载体phGMH-L3的构建过程示意图。
图4为大肠杆菌TBl/phGMH-L3和TOP10/phGMH-L3工程菌株表达 GFP-MBP-HepA的SDS-PAGE电泳分析图。
图5为大肠杆菌TBl/phGMH-L3和TOP10/phGMH-L3工程菌株15度诱导培养 21h后菌体浓度、粗酶液酶活及荧光量比较情况示意图。
图6为大肠杆菌TBl/phGMH-L3和TOP10/phGMH-L3工程菌株15度诱导培养 21h后粗酶液比酶活及比荧光强度比较情况示意图。
图7为TOP10/phGMH-L3培养过程中细胞浓度(0D6。。)、肝素酶I的酶活(IU/L 培养基)和荧光强度(U/L)的变化曲线图。
图8为TOP10/phGMH-L3培养过程中细胞浓度(0D6。。)、荧光强度(U/L)与肝 素酶I的酶活(IU/L培养基)的关系曲线图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1.绿色荧光蛋白、麦芽糖结合蛋白和肝素酶I三重融合蛋白的表达 一、三重融合蛋白的表达载体的构建
1、含有麦芽糖结合蛋白和肝素酶I 二重融合蛋白编码基因的表达载体 pMAL-c2x-H印A的构建
表达载体pMAL-c2x-HepA的构建过程如图l所示，具体过程如下从肝素黄 杆菌(F/flvWa"eWwm //e戶〃'"wm)(购买自IAM)的染色体组DNA中扩增肝素酶 I基因，所用的引物分别为
上游引物5' -GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC -3'(带下划 线的碱基为BamHI的酶识别位点)，
下游引物5' - CTTAAAGCTTTTACTATCTGGCAGTTTCGCTGTAC- 3'(带 下划线的碱基为HindIII酶识别位点)，扩增后，分别引入Bamffl和HindIII酶识别位PCR扩增的反应体系为50ng模板DNA， 100pmol每种引物，lx扩增缓冲液 (北京天为生物技术有限公司)，200|imol/L每种dNTP, 1单位高保Pfii酶；扩增 程序为95摄氏度变性5分钟，50-60 (51、 53、 55、 57或59°0摄氏度引物退火 45秒，72摄氏度引物延伸90秒，30个循环后，72摄氏度延伸5分钟结束反应。 该PCR结果如图2所示，表明扩增得到l.lkb的肝素酶I基因片段。测序表明，该 片段具有自序列表中序列2的5'端第1956位-3045位核苷酸序列。图2中，泳道 2-6分别为引物退火温度为51、 53、 55、 57或59'C扩增结果，泳道1为分子量marker (条带大小依次为15kb、 10kb、 7500bp、 5000bp、 2500bp、 1000bp、 750bp)，箭 头所指处为l.lkb目标片段。
将上述得到的PCR产物用BamHI和HindIII双酶切后，分别插入到购自美国N ew England Biolabs公司的pMAL-c2x载体的BamHI和HindIII酶识别位点之间， 得到pMAL-c2x重组载体，将pMAL-c2x重组载体转化大肠杆菌JM109，以5'GCC TGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3，和5， CTTAAAGCTTTTACTATCT GGCAGTTTCGCTGTAC 3'为引物，通过菌落PCR筛选转化子，提取可得到l.lkb PCR产物的转化子中的pMAL-c2x重组载体，分别通过BamHI和Hindin双酶切验 证。将通过BamHI和HindIII双酶切得到Ukb片段的质粒进行测序，将含有具有 序列表中序列2的5'端第1956位-3045位的核苷酸序列的肝素酶I融合蛋白编码基 因的pMal-c2x重组载体命名为pMAL-c2x-HepA。在pMAL-c2x-HepA中，T/e;^基 因与/flcZa基因之间有两个连续的终止密码TAGTAA，从而能够有效地终止蛋白翻 译不会表达lacZa蛋白。
2、三重融合蛋白表达载体phGMH的构建
根据三重融合蛋白中连接绿色荧光蛋白与麦芽糖结合蛋白的氨基酸残基序列 不同，我们构建了phGMH表达载体，命名为phGMH-L3。 phGMH-L3中连接GFP 与MBP的氨基酸残基序列为S3N1()I，构建过程如图3所示。具体过程如下
phGMH-L3的构建过程 以质粒pSG1729 (从Bac川us Genetic Stock Center获得)为模板，用上游引 物5' CGAGCACTTCACGAACAAGGACCATAGCATATTAATCATCATCATCAT CATCATATGAGTAAAGGAGAAG 3'(带下划线的碱基为Asel酶识别位点)和 下游弓I物5' GATCCCATTAATGTTGTTGTTATTGTTATTGTTGTTGTTGTTCGAGCTCGATTTGTATAGTTCATCCAT 3'(带下划线的碱基为Asel酶识别位点)扩 增带有组氨酸标记His6的绿色荧光蛋白基因/^-g步，两端均引入Asel酶识别位点。
PCR扩增的反应体系为50ng模板DNA， lOOpmol每种引物，2XTransTaq High Fidelity (HiFi) PCRSuperMixII;扩增程序为95摄氏度变性5分钟，60。C退火 45秒，72摄氏度引物延伸90秒，30个循环后，72摄氏度延伸10分钟结束反应。 测序表明，/^-g步具有SEQ ID Na: 2中5'端第1-735位核苷酸序列。
将上述得到的PCR产物用Ase I酶切后，与pMAL-c2x-HepA经Ndel (酶切位点为CATATG)单酶切后的大片断用T4DNA连接酶，得到重组载体，将 将其转化大肠杆菌DH5a。筛选出重组质粒经酶切鉴定并通过序列测定确认(美国 Invitrogen公司)。将含有三重融合蛋白的编码基因(如序列表中序列2所示)的 重组载体命名为phGMH-L3。其中，g步的编码区是序列2的自5，端第22-735位 的碱基；m^的编码区是序列2的自5，端第778-1878位的碱基；压W的编码区 是序列2的自5'端第1956-3045位的碱基。
二、三重融合蛋白的表达 1、诱导表达
提取步骤一中含有phGMH-L3的大肠杆菌DH5 a中的质粒，按照常规方法转化 大肠杆菌TBI和TOPIO，经过氨苄青霉素筛选和利用步骤一中2提供的引物进行 菌落PCR鉴定，得到含有phGMH-L3的大肠杆菌TBI和TOPIO，即TBl/phGMH-L3 和TOP10/phGMH-L3作为表达GFP-MBP-HepA的工程菌。
以质粒pMAL-c2x转化大肠杆菌TBI和TOPIO，得到空载体对照 TBl/pMAL-c2x和TOP10/pMAL-c2x。
以下操作对上面的工程菌平行进行。
将空载体对照和工程菌分别在LB培养基(含IOO pg/ml氨苄青霉素)37T:培 养至OD咖约为0. 600附近后，加入终浓度为0. 3 mM IPTG 15"C进行诱导培养21h。 10000 rpm, 8min离心收集菌体并用20咖ol/L Tris-HC1 (pH 7.4)洗涤两次，重 悬至0De。。约为8.000附近，取样40pl做细胞全蛋白组分SDS—PAGE电泳。将上面 0De。。约为8. 00重悬液进行超声破碎(输出功率为300W，每次超声3秒和间歇3秒的 处理198次)，12000rpm, 30min取上清液40|il做可溶蛋白组分SDS—PAGE电泳。 结果如图4所示，图4中3个M均为marker (从上而下分子量依次均为120kDa、100kDa、 65kDa、 50kDa) ， Cl为空载体对照TOP10/pMAL-c2x全蛋白组分；C2为空 载体对照TBl/pMAL-c2x的全蛋白组分；S9、 S10分别为大肠杆菌TBI (phGMHS-L3) 的全蛋白组分和可溶蛋白组分；Sll、 S12分别为大肠杆菌TOPIO(phGMHS-L3)的全 蛋白组分和可溶蛋白组分。
结果表明空载体对照菌株TBl/pMAL-c2x和TOP10/pMAL-c2x诱导培养后无 荧光无酶活，其它工程菌均表达出了可溶性的GFP-MBP-HepA三重融合蛋白，其 中大肠杆菌TOPIO中的表达效果均要优于大肠杆菌TB1。并且经过测序， TBl/phGMH-L3、 TOP10/phGMH-L3表达出的蛋白的氨基酸序列如序列表序列1所 示。并且该融合蛋白的GFP的氨基酸序列如序列1的自氨基端第8-245位所示；该 融合蛋白的MBP的氨基酸序列如序列1的自氨基端第260-626所示；该融合蛋白 的HepA的氨基酸序列如序列1的自氨基端第653-1015所示。
2、酶活及荧光强度检测分析
粗酶液即为上面步骤中超声破碎后离心所得的上清液。酶活力(单位为IU/L) 的检测采用232 nm的光吸收法，1IU的酶活的定义为30。C每分钟产生lpmol不饱 和键的反应效力。取肝素底物溶液0.5 ml(25 g/L肝素，40 mMNaCl， 3.5 mM CaCl2， 17mMTris-HCl， pH7.4)，加入步骤3中所得的粗酶液，其它体积以Tris缓冲液 补充，最终的反应液体积为1.5ml，测单位时间内在232nm的吸光度变化AA232。 消光系数e二3800IVr1。比酶活(单位为IU/mg蛋白)的定义为酶活力与粗酶液蛋 白浓度(单位为mg/L)的比值。蛋白浓度监测采用常规的Bradford法。荧光强度 (单位为U/L)检测采用荧光分光光度计HITACHI F-2500，激发波长为488nra，检测 吸收波长为512nm。比荧光强度定义为荧光强度与粗酶液蛋白浓度(单位为mg/L) 的比值。
15'C诱导培养空载体对照和工程菌21h后，OD6。G、酶活、荧光强度结果如图5 所示，比酶活和比荧光强度结果如图6所示，其中空载体对照诱导培养后无荧光无 酶活未在图上显示，大肠杆菌TOP10/phGMH-L3的粗酶液和比酶活很高，酶活可 达517.2 IU/L培养基，比酶活可达2.839 IU/mg蛋白，比荧光强度可达0.858 IU/mg 蛋白。
实施例2.三重融合蛋白肝素酶酶活的荧光定量追踪
10根据实施例1的结果，我们选取大肠杆菌TOP10/phGMH-L3进行了三重融合 蛋白肝素酶酶活的荧光定量追踪实验。用含IOO (ig/ml氨苄青霉素的M9YE培养基 (17. 1 g/L Na2HP04 12H20， 3. 0 g/L KH2P04， 0. 5 g/L NaCl; 1. 0 g/L NH4C1， 12. 5 g/L 酵母提取物，12 g/L葡萄糖)对TOP10/phGMH-L3进行培养,在37。C培养大约3. 5 小时(至0De。。为0. 735)后，加入终浓度为0. 3 mM的IPTG，并将培养温度改为15 'C进行诱导培养。之后每隔2小时，取2ml菌液分别测其细胞浓度(OD6co)、肝素 酶I的酶活和荧光强度(荧光分光光度计HITACHI F-2500)，直至诱导培养30小 时。
肝素酶I的酶活是按照实施例1步骤二中的步骤2的方法测定，结果表明肝素 酶I的酶活随着诱导时间的延长，表达量逐渐增加。荧光强度的测定分为两种方式 方式1是直接利用菌液测定荧光强度值，方式2是将菌液离心后用相同体积的20 mM 的Tris缓冲液(pH7.4)重悬，用实施例1中步骤二中的步骤1的方法超声破碎后 离心去上清来测定荧光强度值。
培养过程的细胞浓度(OD,)、肝素酶I的酶活(IU/L培养基)和荧光强度(RFU) 的变化如图7所示,最高酶活可达1214.4 IU/L培养基。随着诱导时间的增加，细胞 浓度、酶活和荧光量均增加，但由于细胞散射的影响，方式l所测得的荧光强度偏 小，且细胞浓度越大，偏差越大。此时可通过方式2来准确测量荧光量。
为进一步研究利用GFP蛋白实现菌体浓度和酶活的快速在线检测，我们研究了 酶活与0D6。。、荧光强度的关系，结果如图8所示。结果表明，酶活与细菌浓度、荧 光强度均存在着良好的线性关系，可以利用荧光强度实现培养过程中细菌浓度以及 酶活的快速定量。上述结果说明在发酵培养过程中可以通过检测荧光强度以快速获 得菌体浓度和肝素酶I的酶活的变化，从而实现高效生产三重融合肝素酶I的培养 过程优化和控制。序列表
<110>清华大学
<120>融合肝素酶及其编码基因
<130〉 CGGNARL92435
<160> 2
<210> 1
<211> 1015
〈212> PRT 〈213>人工序列 〈220〉 <230〉
<400> 1
Met His 1
Gly Val
His His His His His Met 5
lie Leu Val Glu
Val
Lys Phe Ser 35 Leu
Leu Thr 50 Pro Thr 65
Tyr Pro
Leu
Pro 20 Val
Lys
Val
His
Asp
Glu Gly Tyr Val
Ser
Leu 25 Glu
Lys
10
Asp
Gly Glu Glu Leu Gly Asp Val Asp1 Ala
Asn 30 Tyr
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
40 45
Phe lie Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val
55 60
Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gin Cys Phe
70 75
Met Lys Gin His Asp Phe Phe Lys Ser Ala 85 90
Gin Glu Arg Thr lie Phe Phe Lys Asp Asp
Phe Thr 15
Gly His
Gly Lys
Pro Trp
Ser Arg
80 Met Pro 95
Gly AsnTyr
Arg
Gly 145 Ala
Asn
lie 130 His
Asp
lie
100
Arg Ala Glu Val
Thr 115
Glu Leu Lys Gly
Lys Lys Glu
Leu Glu Tyr 150 Asn
Thr Pro lie 195 Gin
Ser
Gin
Asp 180 Gly
Ser
Lys 165 Gly
Thr 210
Val Leu Leu Glu
Met 225
Asp Glu Leu Tyr
Asn Asn lie Met 260 Gly
Lys 245 Lys
Gly
Lys
Glu 305 Phe
Ala
Asp
Lys 275 Thr
Leu
lie 135 Asn
Gly
Val
Lys 120 Asp
Tyr
lie
105
Phe Glu Gly Asp
Phe
Asn
Lys
Lys Ser
Glu
His 155 Asn
110
Thr Leu Val Asn 125
Gly Asn lie Leu
Asp 140
Asn Val Tyr lie
Phe
Ser Val Gin
Asp Gly Pro Ala
Val 170
Leu Ala Asp His 185
Leu Ser Pro Asp
Lys Tyr
Val 200
Lys Asp Pro Asn
Ser 215
Val Thr Ala Ala
Phe 230
Ser Ser Ser Asn
Glu 220
lie
Asn 205 Lys
lie
Gin 190 His
Arg 175 Gin
Tyr Asp
Thr His Gly
Met 160 His
Asn
Leu
Arg Asp His
Gly 235
Asn Asn Asn Asn
Asn 250
Lys Leu Val lie
lie Glu Glu Gly 265
Ala Glu Val Gly
Asn 255 lie
Met 240 Asn
Asn
Gly lie Lys
Asp 290
Lys Phe Pro Gin
Tyr Asn Gly lie
Leu 280
Thr Val Glu His
Val 295
Ala Ala Thr Gly
Trp Ala His Asp 325
Glu lie Thr Pro
Val 310
Arg Phe Gly Gly
Tyr 330 Gin
Asp 315 Ala
Pro 300 Gly
Lys 285 Asp
Trp 270
Lys Phe Glu
Lys Leu Glu Pro Asp Gin Ser Gly
lie Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gin Asp Lys Leu Tyr Pro Phe
lie
Leu 335 Pro
lie 320 Leu
13340
Ala Val Arg Tyr
Thr Trp Asp 355
Glu Ala Leu Ser
345
Gly Lys Leu lie
Ala
Pro 385 Ala
Val 370 Pro
Lys
Trp
Gly
Asn 360
lie Tyr Asn Lys
Lys Gly
Leu 375
Glu lie Pro Ala
350
Ala Tyr Pro lie 365
Leu Leu Pro Asn
Thr Trp Glu 390
Ala Leu Met Phe
Asp 380
Asp Lys Glu Leu
Lys
Thr Trp Pro
Ser 405
lie Ala Ala Asp
Leu 420
Tyr Asp lie Lys
Asn 410 Gly
Leu 395
Leu Gin Glu Pro
Asn Gly Lys 435
Lys Ala Gly Leu Thr Phe
Gly 425
Val Gly Val Asp
Asn 465 Glu
Ala 450
Ala
Asp 440
Val Asp Leu lie
Tyr Ala Phe Val
Tyr 415 Tyr
Lys 400 Phe
Glu
Lys 430
Ala Gly Ala
Asp Thr Asp Thr Ala Met Thr Ser Lys
Thr 485 Asn
Tyr 470 lie
Tyr
Leu 455 Ser
Asn Gly Pro
Asn 445
Asn Lys His Met
Lys 460
Ala Phe Asn Lys
lie Ala Glu Ala 475
Ala Trp Ser Asn
Val 500
Gin Pro Ser Lys Pro Phe 515
Pro Asn Lys Glu
Gly Val
Ala
Ser 530
Thr Asp Glu
Leu 545
Ala Val Ala Leu
Lys Gly
Gly
Val
Gly 520 Ala
Trp 490
Val Leu Pro Thr
Thr 505
Val Leu Ser Ala
lie 495 Lys
Gly 480 Asp
Gly
Phe 510
lie Asn Ala
Leu 535
Glu Ala Val Asn
Leu 550
Ser Tyr Glu Glu
Lys Glu Phe Val
Leu 540 Asp
Gly 525
Glu Asn Tyr Leu
Lys 565
lie Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gin Lys Gly Glu lie Met Pro Asn
Glu 570 Lys
Lys 555
Leu Ala Lys Asp
Lys Pro Leu Lys
Pro 575 Pro
Gly 560 Arg580
Met Ser Ala Phe
lie Pro Gin 595
Asn Ala Ala Ser Gly Arg
585
Tyr Ala Val Arg
Gin 625 Leu
Ser
Ala 610
Thr Asn Ser Ser
Trp 600
Thr Val Asp Glu
Gin 615
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Thr 605 Leu
590
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Gly lie Glu Gly
Asn
lie 660 lie
Gly 645 Pro
Ser 630
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Ala 620
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Asn 635
Gly Ser Gin Gin
Lys Asp Ala Asn
Gin Ser Glu 675
Pro Tyr Ala
690 Ser Tyr Arg 705
Ala Ala Gly Glu
Tyr Arg Val lie Asp Asn Leu Gin Tyr
Phe 650
Val Gin Ala Asp
Asn 665
Trp Val Ala Val
Lys 680
Asp Lys Leu Arg
Phe Glu Leu 710
JLys
Asp 695
Lys Ala Glu Asp
Thr Thr Asn Asp 740 Lys
Gin Lys Leu 755 Ser
Gly
Ser Ser Arg 770
Asp Asn Ala Thr
Thr 725 Phe
Thr
Ser
Lys Val Tyr
Gly Arg lie Lys Phe Tyr
Asn 715 Leu
Pro 785
Arg Thr Leu Val
His 760
Thr Phe Ser Val 775
lie Phe Ala Gin
Thr 790
Thr Pro Glu
Ala 805
Glu Glu Phe Heu Ala Leu Tyr Asp
Gly Arg
Glu 810 Met
Trp 795 lie
Gly 685 Asn
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Lys 655 Ala
Asn
Asn 640 Lys
Lys
Lys
Glu 730
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Phe 700
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Gly Lys Pro
Pro 745
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Tyr Tyr
Lys
Gly
Tyr 735 Asn
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Ala
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Gin 750
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lie 780 His
lie 765
Pro Ser Ser Phe
Gly Ala Pro Lys Thr Leu lie Phe Lys Lys
Ser 815 Asn
Ser 800 lie
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Ala His Asp Lys Val Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly Lys lie Thr Tyr
835 840 845
Val Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val Glu Gin Gly Gly Tyr Pro
850 855 860
Pro Leu Ala Phe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr lie Lys Ala Asn 865 870 875 880
Ser Asp Arg Gin Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg Asn Asn Ala Asn
885 890 895
Pro Glu Asn Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys Thr
900 905 910
Ser Thr lie Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gin Phe Pro Lys Asp Cys
915 920 925
Trp lie Thr Phe Asp Val Ala lie Asp Trp Thr Lys Tyr Gly Lys Glu
930 935 940
Ala Asn Thr lie Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr Tyr 945 950 955 960
Thr Lys Asn Lys Lys Pro Gin Lys Ala His lie Val Asn Gin Gin Glu
965 970 975
lie Leu lie Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe Gly
■ 985 990
lie Tyr Arg Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr Tyr Asn Leu Ser
995 1000 1005
Gly Tyr Ser Glu Thr Ala Arg 1010 1015
〈210〉 2
〈211〉 3051
〈212> DNA 〈213〉人工序列〈220〉 <230>
〈400〉 2
atgcaccacc8ccacc3ccacatg3gtaBagg卿agaacttttcactggagttgtccca60
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gtcccggttacttataacctgagcgggtacagcgaaactgccagatagta61305权利要求
1、一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列1的第8-1015所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白质。
2、 根据权利要求1所述的多功能融合肝素酶，其特征在于所述b)的蛋白的氨 基酸序列是序列表中序列1所示的氨基酸序列。
3、 权利要求1或2所述蛋白的编码基因。
4、 根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因的序列是如下l)或2)或3)的核苷酸序列1) 序列表中序列2所示的核苷酸序列；2) 在高严谨条件下与序列表中序列2的核苷酸序列杂交且编码权利要求1或2所述 蛋白的核苷酸序列；3) 与序列表中序列2所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码权利要求1 或2所述蛋白的核苷酸序列。
5、 含有权利要求3或4所述基因的重组载体和转基因细胞系。
6、 根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是通过以下步 骤构建的将序列表中序列2的第1位-1878位所示的DNA片段插入质粒pMAL-c2x-HepA 的多克隆位点，得到重组载体；所述质粒pMAL-c2x-HepA是将序列2的第1956-3045位所示的肝素酶I的编码 基因插入到质粒pMAL-c2x的BamHI和HindIII酶切位点之间，得到的重组质粒。
7、 含有权利要求3或4所述基因的重组菌。
8、 根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是含有权利要求5 或6所述的重组载体的重组大肠杆菌。
9、 一种生产肝素酶的方法，是将权利要求7或8所述的重组菌诱导培养，表达 得到肝素酶。
10、 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述诱导培养条件是0.3-lmM的 IPTG， 10-3(TC诱导培养5-30小时。
全文摘要
本发明公开了一种融合肝素酶。该融合肝素酶是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列1的第8-1015所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白质。上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。本发明产生的三重融合蛋白的酶活通过摇瓶培养可达1214.4IU/L培养基，比酶活可达2.839IU/mg蛋白。本发明可以利用GFP蛋白实现菌体浓度和酶活的快速在线检测。
文档编号C12R1/19GK101608178SQ20091009016
公开日2009年12月23日 申请日期2009年7月29日 优先权日2009年7月29日
发明者叶逢春, 翀 张, 蒋培霞, 邢新会 申请人:清华大学