专利名称：：一种培育抗黄萎病的转基因植物的方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种培育抗黄萎病的转基因植物的方法。
背景技术：
：棉花黄萎病(CottonVerticilli咖Wilt)是一种侵害棉株维管束的真菌性病害，具有分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多、存活时间久的特点。由于生产上一直没有找到理想的防治和控制方法，其被称为棉花的"癌症"。我国的黄萎病自1935年由美国引进品种传入，先后在陕西泾阳、山西运城、山东高密和河南安阳等地发生；1993年棉花黄萎病在我国大范围爆发，北方棉区重病棉田棉花病株率达50%，当年全国发病面积为26.67万公顷，损失皮棉逾l亿公斤；2002、2003年棉花黄萎病在黄河流域和新疆棉区再次爆发。化学防治黄萎病的方法成本较高，污染环境，且防治效果不理想；而常规育种也难以培育出相对病指低于20的抗性品种。随着分子植物病理学和基因工程技术的迅猛发展，运用转基因技术提高植物的抗病性已成为棉花抗病育种的重要手段。
发明内容本发明的目的在于提供一种培育抗黄萎病的转基因植物的方法。本发明提供的培育抗黄萎病的转基因植物的方法，是将含有细胞凋亡抑制基因的重组表达载体导入目的植物中，得到抗黄萎病的转基因植物；所述转基因植物对黄萎病的抗性高于目的植物；所述细胞凋亡抑制基因是iap基因和p35基因；所述iap基因的序列如序列表中序列1的自5'端第7-813位所示、所述p35基因的序列如序列表中序列2的自5，端第7-906位所示；所述重组表达载体的出发质粒是pCAMBIA1301。所述重组表达载体的构建方法如下将通过EcoRI和PstI双酶切载体pBI121-p35得到的含有p35基因的片段插入载体pl301-iap的多克隆位点中，得到所述重组表达载体(命名为p1301—iap-p35);所述载体pBI121-p35是将p35基因插入载体pBI121的BamHI和SacI酶切位点之间得到的重组质粒。所述p1301-iap是将iap基因是插入载体pCAMBIA1301的BglII和Eco91I酶切位点之间，得到的重组质粒。上述目的植物可以是任何可感染黄萎病的植物，具体可为棉花、辣椒、茄子或黄瓜。上述棉花是中棉所39。上述的方法在培育植物新品种中的应用也属于本发明的保护范围之内。上述植物新品种具体可以是抗黄萎病的棉花新品种，上述棉花是中棉所39。实验证实将本发明的重组载体导入棉花中，得到15株转基因棉花株系，经潮霉素筛选后得到12个阳性株系，对这12个阳性株系的丁3代依次进行了潮霉素筛选、PCR、RT-PCR、Westernblot以及病圃筛选，筛选到抗病指数均在3-10之间的高抗黄萎病棉花株系。图1为载体pl301-iap-p35的构建流程图，a是载体pl301-i即的构建，b是载体pBI121-p35的构建，c是pl30卜iap-p35的构建。图2为T3代转基因棉花病圃抗病性检测，(a)为未转化的棉花单株，(b)为转基因棉花单株。图3为T3代转基因棉花的RT-PCR检测，(a)为p35基因RT-PCR扩增产物电泳图，(b)为iap基因RT-PCR扩增产物电泳图，1为未转化的棉花RT-PCR产物(阴性对照)，2-4为转基因棉花RT-PCR产物，5为质粒P1301-iap-p35的PCR产物(阳性对照)，6为1kbDNAladder,由下到上分别为250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp。图4为Westernblot检测T3代转基因棉花叶片中的p35蛋白和iap蛋白，(a)为T3代转基因棉花叶片中的p35蛋白，(b)为T3代转基因棉花叶片中的i即蛋白，卜3为转基因棉花，4为未转化棉花(阴性对照)，6为蛋白分子量标准(a)由下到上分别为16.5kDa，25kDa，32.5kDa，47.5kDa，62kDa，(b)由下到上分别为16.5kDa，25kDa，32.5kDa。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例l、培育抗黄萎病转基因棉花及其抗病检测一、抗黄萎病转基因棉花的获得1、细胞凋亡抑制基因的克隆1)iap基因的克隆由Invitrogen公司合成序列表中序列1的自5'端第1-820位所示的核苷酸，其中第1-6是BglII酶切位点，第7-813是i即基因的序列，第814-820是Eco91I的酶切位点。将序列1所示的片段插入pGEM-T载体(购自Promage公司)，得到载体pGEM-iap，经过测序验证，合成得到的片段iap具有序列表中序列1的自5'端第7-813位所示的核苷酸。2)p35基因的克隆由Invitrogen公司合成序列表中序列2的自5'端第1-912位所示的核苷酸，其中第1-6是BamHI酶切位点，第7-906是p35基因的序列，第907-912是SacI的酶切位点。将序列2所示的片段插入pGEM-T载体(购自Promage公司)，得到载体pGEM-p35，经过测序验证，合成得到的片段p35具有序列表中序列2的自5'端第7-906位所示的核苷酸。2、重组载体的构建构建过程如图l所示。1)载体pl301-iap的构建将步骤l的l)得到的载体pGEM-iap经过Bgl1I和Eco91I双酶切，回收小片段，然后将该片段与经同样酶切过的载体pCAMBIA1301(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriclture,www.cambia.org)连接，《导至U载^本pl301-iap(图la)。2)载体pBI121-p35的构建将步骤1的2)得到的载体pGEM-p35经过BamHI和SacI双酶切，回收小片段，然后将该片段与经同样酶切过的载体PBI121(ArabidopsisBiologicalResourceCenter,www.arabidopsis.org/a_brc/)连接，得至職体pBI121-p35(图lb)。3)载体pl301-iap-p35的构建将上述步骤2的2)得到的载体pBI121-p35经EcoRI和PstI双酶切，回收含有p35基因及其上下游的CaMV35S启动子和终止子的片段，然后将该片段与经同样酶切过的载体pl301-iap连接，得到载体pl301-iap-p35(图lc)。3、抗黄萎病转基因棉花的获得1)转化农杆菌农杆菌感受态细胞的制备挑取农杆菌EHA105(抗生素抑制农杆菌的效果及对条斑紫菜生长发育的影响，王萍等水产科学，200928(7)，公众可从中国农业大学获得)单菌落接种于100mlYEB液体培养基中，220rpm28。C振荡培养至0De。(P0.5;转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清，加入10ml预冷的0.15M的CaCh溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min;4°C，5000rpm离心5min，去上清，加入4ml预冷的含10%甘油的O.15M的CaCl2溶液，轻轻悬浮；农杆菌悬浮液分装于无菌印pendorf管中，每管200ul于液氮中速冻lmin，冻存于-70°C。表达载体转化农杆菌EHA105取lPg的表达载体pl301-iap-p35加入到200WEHA105感受态细胞中，混匀；液氮中速冻lmin，37。C水浴5min，加入1mlYEB液体培养基，28°C150rpm振荡培养4h;10000rpm离心30sec，弃上清，加入0.1ralYEB液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于含50ug/mlKan和50ug/ml利福平的YEB固体平板上，28°C培养约48h。长出单菌落用PCR鉴定，鉴定用的引物是以p35基因的5'引物5，atgtgtgtaatttttccggtag3，、3，弓l物5，ttatttaattgtgtttaata3，禾口iap基因的5，弓l物5，atgagctcccgagcaatt3，、3，弓l物5，ttacacttggtacatgcgcac3'分别扩增，结果显示载体p1301-iap-p35已经成功转入农杆菌中。2)转化棉花a、外植体的获得将受体材料中棉所39(购自中国农业科学院棉花研究所科技贸易公司)的去壳种子利用。0.P/。升汞消毒5min，无菌水冲洗3-5次，接种于MS培养基上，光照培养5—7d;用刀片将其下胚轴切成长0.5cm左右的切段，以此5-7d的棉花无菌苗下胚轴切段作为外植体进行农杆菌感染转化。b、农杆菌介导转化与培养挑取上述经过验证过的含有p1301-iap-p35表达载体的农杆菌单菌落接种于YEB(50lig/mlKan和50ug/ml利福平)液体培养基中，28。C振荡培养至OD,值为0.5—0.7，5000rpm离心5min，用MSB液体培养基重新悬浮，与5-7d的棉花无菌苗下胚轴切段共培养10min，用无菌滤纸吸干外植体表面菌液，转入表面铺有一层滤纸的共培养培养基(MSB+0.1mg/L2,4-D+0.lmg/LKT+0.lmg/LIAA+30g/L葡萄糖+2g/LGelrite,pH5.8)中，2rC黑暗条件下共培养48h，接着转移到抗性愈伤诱导培养基(MSB+0.1mg/L2，4-D+0.lmg/LKT+0.1mg/LIAA+500mg/L头孢霉素+50mg/L潮霉素+30g/L葡萄糖+2g/LGelrite，pH5.8)培养3周，将诱导的抗性愈伤转入分化培养基(MSB+0.02mg/LKT+0.005mg/LIAA+30g/L葡萄糖+2g/LGelrite,PH5.8)中诱导分化成胚状体，将胚状体转入成苗培养基(MSB+0.1mg/LIBA+30g/L葡萄糖+2g/LGelrite，pH5.8)形成再生植株，用劈接法将获得的15棵转基因再生植株嫁接到砧木苗上，移至温室培养，并进行潮霉素抗性检测，得到12株转基因植株，该12株转基因棉花自交授粉后获得T。代种子，长成L代棉花，经过3年的自交繁殖分别获得T,代种子、L代棉花、L代种子.L代棉花、L代种子。3)转基因棉花的检测a.潮霉素检测在12个T3代转基因棉花株系的单株幼苗长出2-3片真叶时，对其进行了潮霉素叶片涂抹初筛实验。取浓度为50mg/L的潮霉素涂抹转化单株，涂抹7-10d后观察涂抹部位的颜色，淘汰叶片涂抹点变黄的单株，然后进行第二轮筛选，如此连续涂抹3次，选出涂抹叶片依然为绿色的单株为阳性株系。b.DNA水平检测PCR检测以步骤a得到的各阳性株系的基因组DNA为模板，质粒pl301-iap-p35为阳性对照，未转化棉花的基因组DNA为阴性对照，分别以p35基因表达框的5，弓l物5，cccacagatggttagagagg3，、3，弓l物-5,gtagtagtcgttgcgttcgt3，禾口iap基因的5，弓l物5，atgagctcccgagcaatt3，、3，弓l物5，acgcctcagtcatcaccc3，扩增，反应体系ddH2037u110XPCRBuffer5u1dNTP(25mM)4n15，引物(5pmol/u1)lu13，引物(5pmol/u1)lu1rT叫酶(5U/u1)lu1模板(l"g/ul)1"总体积50ulPCR反应程序为第一轮95。C变性5min;第二轮95n变性50sec，各基因特定退火温度(iap:60。C，p35:58。C)50sec，72。C延伸lmin30s，35个循环；第三轮72'C延伸10min。反应结束后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果。选出能同时扩增出特异的1300bp和568bp的p35和i即基因片段的PCR阳性植株。c.RNA水平检测RT-PCR检测为了检测步骤b中的PCR阳性植株中p35和iap基因是否得到转录，进一步进行PT-PCR检测。用CTAB法提取步骤b中的PCR阳性植株的总RNA，以完整性好、无污染的RNA为模板，用M-MLV酶(购自TaKaRa生物工程公司)反转录RNA为cDNA，反转录反应体系賺(1.0ixg/u1)4.On1OligdT2.0u1总体积6.0til将上述混合物混匀后，短暂离心将之收集于管底，72"C温育10min，再立即置于冰上5min，再加入以下成分5XM-MLVBuffer2.0u1dNTP2.0li1RTaseM-MLV(200U/u1)0.75u1HPR(40,)0.25u1总体积ll.Oixl将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，在3(TC反应10min，42。C温8育60rain，70。C反应10rain，取出置于冰上，离心后储存于一2(TC。以0.5yl反转录产物为模板进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件与步骤b相同。选出经RT-PCR能同时扩增出特异的1300bp和568bp的p35和iap基因片段(如图3所示)的植株，为RT-PCR阳性植株。d.蛋白水平检测Westernblot:为了检测步骤c中得到的RT-PCR阳性植株中p35和iap基因是否得到表达，进一步进行westernblot检测。提取转基因植株的总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳分离，应用电转装置将蛋白转移至醋酸纤维膜上进行免疫印迹杂交，p35蛋白的第一抗体购自IMGENEX公司(产品目录号是IMG-5740)，Iap蛋白第一抗体购自GeneTex公司(产品目录号是GTX23930)，第二抗体均为碱性磷酸酶标记的山羊抗兔lgG(购自北京博奧森生物技术有限公司，产品目录号是bsap-0295G)，杂交膜洗涤3次后，用NBT/BCIP显色。能够显色有特异的35kDa和30kDa的条带(如图4所示)的转化株为westernblot阳性植株。结果如表l所示，每一株系均可获得阳性植株。至此，成功获得T3代阳性植株。二、抗病功能检测将经上述步骤d验证过的T3代阳性植株在当年进行病情调查，调査方法如下T3代阳性植株和对照(未转化的棉花植株中棉所39)种于中国农业科学院棉花研究所植保室黄萎病病圃，该病圃具中等致病力，可保证感病对照发病株率达80%,病指50以上。分别于蕾期、花期和铃期逐株进行3次病情调査，调查按照全国统一的分级标准，单株划分病情级别，黄萎病发病程度分为0、1、2、3、4等5级。用发病程度值的大小作为衡量抗病程度的指标，筛选出抗病的单株。棉花黄萎病发病强度分级标准0级健株；1级病株叶片有25%以下表现病状，叶片主脉间产生淡黄色或黄色不规则病斑；2级病株叶片有25%_50%表现病状，病斑颜色大部分变成黄色或黄褐色，叶片边缘略有巻枯；3级病株叶片有50%-75%表现病状，病斑颜色大部分成黄褐色，叶片边缘巻枯，有少数叶片凋落；4级全株叶片发病，多为褐色掌状枯斑，以致植株死亡。根据调査结果计算病情指数病情指数=[(2:各级病级X相应病级发病株数)/调査总株数X最高病级值(4)]xioo以一个株系为一个样本，对每个株系中的T3代阳性植株进行病圃调查，每个株系得到一个病情指数，对照调査了30个单株。照片如图2所示，未转化的棉花单株(对照)上黄萎病症状明显，转基因的阳性植株叶片正常。3次调査得到的病情指数的平均值如表1所示，获得的T3代株转基因棉花株系的病情指数均在3-10之间。表1.T3代株转基因棉花株系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序列表<110〉中国农业大学<120>—种培育抗黄萎病的转基因植物的方法<130>CGGNARL92528<160>2〈210〉1〈211〉820<212>DNA<213〉人工序列〈220>〈230〉〈400〉1agatctatgagctcccgagcaattggcgcgccgcaagaaggcgcagacatgsaa^aca^60gccgcgcgtctcggcacgtacaccaattggcccgtccagtttttggagccgagccgcatg120gccgccagcgggttctactacttgggccgcggcgacgaggtgcgctgcgcgttttgca_ag180cg肪ttgggt朋ggggcgscgacccggaaacggaccac肌gcggtgggcg240ccgcagtgtccgtttgtgcgcaacaacgcgcacgacacgccacacgaccgcgccccgccg300gcgcggtcggcggccgcgcacccgcagtatgccacggeiagccgcgcgtttgcgcaccttt360gcggagtggccccgcgggttga獄agcggcccgaagagttggccgaggccggattcttt420tacactggccagggcgacaagacgcggtgcttttgctgcgacggcggtctg朋ggattgg■gaacccgacgacgcgccgtggcagcaacacgcccgctggtacgaccgctgcgagtacgtg540ctgctcgtcaagggccgcgaCtttgtgC3gcgggtgatgactgaggcgtgtgtggttcgc600ga_cgcgg3C3acgaaccgcacattgagcggccggccgttgaagcggaggtggcggatgac660CggCtgtgC33ga_tttgcctcggcgccgaaaagaccgtgtgctttgtgccctgcgggcac720gtggtggcgtgcggcaagtgcgctgcgggcgtgeiccacgtgccccgtttgccgcggtcag780ttagaceiaeigcggtgcgcatgtaccaagtgtaeiggtgacc820<210〉2<211>912〈212〉靈〈213〉人工序列<220〉<230>〈400〉2ggatccatgtgtgtaatttttCCggt3g333tCg8Cgtgtcccagacgattattcgagat60tgtcaggtggacaaacaaaccagagagttggtgtacattaa_caa_gattatg3ELcacgc肌120ttg3C3a^cccgttctcatgatgtttaacatttcgggtcctatacgaagcgttaicgcgc180aageiEicaacaatttgcgcgacagaataaaatcaaaagtcgatgaacaatttgatcaacta240g朋CgCg3ttacagcgatcaaatggatggattccacgatagcatcaagta300gaaceictattcggt犯gttgccaaaatggcagcgtgttgaaa_agca_agtttgct犯a^tt360tta_a_a_g8gtcatgattataccgataaaaagtctattgaagcttacgagaaatactgtttg420ccc犯attggtcgacgaacgcaacgactactacgtggcggtatgcgtgttgaagccggga480tttgagaeicggcagcaaccaagtgctatctttcgagtacaacccga_ttggtaacaaagtt540attgtgccgtttgctcacgaaattaacgacacgggactttacgagtacgacgtcgtagct600tacgtggacagtgtgcagtttgatggcgaacaatttgaagagtttgtgcag3gtttaata660ttgccgtcgtcgttcaaaaattcggaaaaggttttatattacaacgaagc720a肌agcatgatctacaaggctttagagtttactacagaatcgagctggggc肌atccgaa780aagtataattggsieiaattttttgtaacggttttatttatgataaaaaatcaa^Lgtgttg840t3tgtt犯3ttgcacaatgt肪ctagtgcactcaacei犯aatgtaatatt900aaataeigagctc91权利要求1、一种培育抗黄萎病的转基因植物的方法，是将含有细胞凋亡抑制基因的重组表达载体导入目的植物中，得到抗黄萎病的转基因植物；所述转基因植物对黄萎病的抗性高于目的植物；所述细胞凋亡抑制基因是iap基因和p35基因；所述iap基因的序列如序列表中序列1的自5’端第7-813位所示、所述p35基因的序列如序列表中序列2的自5’端第7-906位所示；所述重组表达载体的出发质粒是pCAMBIA1301。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于所述重组表达载体的构建方法如下将通过EcoRI和PstI双酶切载体pBI121-p35得到的含有p35基因的片段插入载体pl301-iap的多克隆位点中，得到所述重组表达载体；所述载体pBI121-p35是将p35基因插入载体pBI121的BaraHI和SacI酶切位点之间得到的重组质粒；所述p1301-iap是将iap基因是插入载体pCAMBIA1301的BglII和Eco91I酶切位点之间，得到的重组质粒。3、如权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为棉花。4、如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述棉花是中棉所39。5、权利要求l-4任一所述的方法在培育植物新品种中的应用。6、如权利要求5所述的应用，其特征在于所述植物新品种是抗黄萎病的棉花新品种，所述棉花是中棉所39。全文摘要本发明公开了一种培育抗黄萎病的转基因植物的方法。本发明提供的方法是将细胞凋亡抑制基因通过表达载体导入目的植物中，得到抗黄萎病的转基因植物；所述转基因植物对黄萎病的抗性高于目的植物；所述细胞凋亡抑制基因是iap基因和p35基因；所述iap基因的序列如序列表中序列1的自5’端第7-813位所示、所述p35基因的序列如序列表中序列2的自5’端第7-906位所示；所述表达载体是pCAMBIA1301。本发明得到的T<sub>3</sub>代植株依次进行潮霉素筛选、PCR、RT-PCR、Westernblot以及病圃筛选，筛选到抗病指数均在3-10之间的高抗黄萎病棉花株系。文档编号C12N15/82GK101659964SQ20091009243公开日2010年3月3日申请日期2009年9月8日优先权日2009年9月8日发明者涛王,娟田,董江丽申请人:中国农业大学