专利名称：一种非动物源性细胞培养血清替代物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种非动物源性细胞培养血清替代物及其作为胎牛血清 等的替代物在细胞培养中的应用。
(二)
背景技术：
在常规的细胞培养、扩增过程中，动物源性血清如胎牛血清(FBS) 是细胞扩增必须的添加成分。
再生医学的细胞治疗手段中，临床使用的种子细胞不仅有数量要求， 并且需要保证其安全有效，动物源性血清参与细胞培养虽然能满足数量 需求，却给临床治疗带来了不安全隐患。而自体来源的血清无论获得及使 用都有诸多不便，无法达到使细胞快速扩增的效果，也无法满足临床细胞 治疗对于细胞数量的需求。
(三)
发明内容
本发明目的是一种非动物源性细胞培养血清替代物及其作为胎牛血 清等的替代物在细胞培养中的应用。
本发明采用的技术方案是
一种非动物源性细胞培养血清替代物，由如下方法制备得到取3~5 体积单位O型的血沉棕黄层和1体积单位AB型的血浆混合，300 400g 离心，取上清液作为一个体积单位的富含血小板血浆；将富含血小板血浆 过滤除去白细胞，-l(TC以下冷冻保存备用，使用前30 37。C解冻、 3000 5000g离心去除血小板膜碎片，既得所述非动物源性细胞培养血清
3替代物，以PLT表示。
血液由液体成分的血浆和悬浮于其中的血细胞组成，合称为全血。 血浆离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞 成分的液体，即血浆。血清离体的血液凝固之后，经血凝块聚缩释出的 液体，即血清。粗略的说，血清与血浆的区别，主要在于血清不含纤维蛋 白元。血沉棕黄层富含血小板，是全血经重离心获得的沉淀部分，上清部 分即为血浆。
具体的，所述非动物源性细胞培养血清替代物由如下方法制备得到 取4体积单位O型的血沉棕黄层和1体积单位AB型的血浆混合，341g 离心6min,取上清液作为一个体积单位的富含血小板血浆；将富含血小 板血浆过滤除去白细胞，-30°(3冷冻保存备用，使用前37。C解冻、5000g 离心5min去除血小板膜碎片，既得所述非动物源性细胞培养血清替代物， 即PLT。
本发明还涉及所述的非动物源性细胞培养血清替代物作为胎牛血清
替代物在细胞培养中的应用。
所非动物源性细胞培养血清替代物作为胎牛血清替代物可用于培养
间质干细胞、人软骨细胞、人肌腱细胞或皮肤人成纤维细胞等常规细胞的 培养。所述培养仅仅是以PLT替代胎牛血清，其他参数可按照本领域常 规方法进行。
所述PLT在细胞培养基的用量可参照胎牛血清用量，优选的，本发 明中所述的应用为在DMEM培养液中添加10%体积的PLT,作为待用 培养基基本组分，用于细胞培养，培养基中其他附加组分，如肝素、双抗 等，按常规用量即可。本发明方法能够避免使用动物源性血清，避免了异种添加物的高危险
性；而制备及利用人血小板溶血产物(HPL)作为血清替代物进行细胞培 养，不仅能够刺激细胞在短期内大量扩增，还能够维持干细胞的多向分化 潜能，不影响细胞质量。
这种细胞培养及扩增方法，不仅有利于加速实-验研究进程，更有利于 缩短临床使用周期。
本发明的有益效果主要体现在利用PLT作为胎牛血清替代物用于 细胞培养，能够免除细胞培养中的动物源性成分，加速细胞倍增，从而满 足临床安全和缩短手术周期需求，不仅适用于间质干细胞，亦适用于其他 人源细胞的扩增培养。 具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一 步描述,但本发明的保护范围 并不仅限于此
实施例1: PLT获得方法具体操作步骤
(1) 釆全血(450ml±45ml),至血袋(枸橼酸盐磷酸盐右旋糖血袋)；
(2) 22。C静置16小时后，血液离心(4250g, 13min， 22°C )，分离红细 胞和血小板，得到血沉棕黄层和血浆。仪器(CompomatG3， NPBI， Amsterdam, the Netherlands ));
(3) 为避免MSC引发凝集反应；四单位的O型血沉棕黄层混合一单位 的AB血浆，轻柔离心(341g， 6min， 22°C )作为一个单位的富含 血小板血浆(PRP)。 PRP转移入贮存袋，过滤除去白细胞。-30°C 冷冻保存。使用前，37。C解冻离心(4000g， 15min)，去除PLT膜 碎片，降低引发异体之间的免疫应答的危险。(4)上清液即为PLT。
实施例2: PLT作为血清替代物培养间质干细胞
培养基配制500mlDMEM基础培养基中添加50mLPLT, 1OOOU肝 素，lmmol谷氨酰胺，5mL双抗(青霉素与链霉素浓度各为10000U/mL); 原代细胞培养
1. 抽取5ml骨髓，肝素抗凝；利用PLT培养基进行差速贴壁法培养；
2. 36小时后首次换液，75cm2细胞培养瓶添加15ml培养基。
3. 每2 3天换液一次；第5 6天胰酶消化计数，此为原代细胞获取过程； 细月包扩增
1. 初始以3><105个细胞种植，每隔2天换液一次，细胞密度到达90%以 上即可传代。
2. 胰酶消化，每瓶以3xl()S个细胞密度种植，2 3天换液一次；
3. 经过11 14天扩增及传代过程，总共可收获不小于3x 108个细胞。 而常规以添加胎牛血清的培养基进行培养，由初始3xl()S个细胞培养
至获得不小于3x 108个细胞，通常需要14天以上。
实施例3: PLT作为血清替代物培养人软骨细胞
培养基配制500mlDMEM基础培养基中添加50mLPLT， 1000U肝 素，lmmol谷氨酰胺，5mL双抗(青霉素与链霉素浓度各为10000U/mL); 使用75cm2培养瓶扩增细胞； 细胞扩增
1.以1 x 106个细胞/瓶种植，每2天换液一次，细胞密度到达90%以上传 代。
62. 胰酶消化传代，种植密度为1.5xloV瓶；隔2 3天换液；
3. 经过11-14天扩增及传代过程，总共可收获不小于4.5x 108个细胞。 软骨细胞的异位成软骨培养
1. 收集106个以上软骨细胞；
2. 用0.25ml胶原凝胶、0.25ml软骨基质混悬，使之成凝胶团块；
3. 将团块植入棵鼠背部皮下，4周后取出观察，组织学切片检测，呈典型 软骨组织结构。
实施例4: PLT作为血清替代物培养人肌腱细胞
培养基配制500mlDMEM基础培养基中添加50mLPLT, IOOOU肝素， lmmol谷氨酰胺，5mL双抗(青霉素与链霉素浓度各为10000U/mL); 使用75cn^培养瓶扩增细胞； 细胞扩增
1. 以5xl05个细胞/瓶种植，每2天换液一次，细胞密度到达90%以上传 代。
2. 胰酶消化传代，种^f直密度为8x 105/瓶；隔2 3天换液；
3. 经过11 14天扩增及传代过程，总共可收获不小于3 x 108个细胞。
实施例5: PLT作为血清替代物培养皮肤人成纤维细胞
培养基配制500mlDMEM基础培养基中添加50mLPLT, 1OOOU肝素，
lmmol谷氨酰胺，5mL双抗(青霉素与链霉素浓度各为10000U/mL);
4吏用75cm^咅养并瓦扩增细月包；
细胞扩增
1. 以5xl05个细胞/瓶种植，每2天换液一次，细胞密度到达90%以上传代。
2. 胰酶消化传代，种植密度为8x 105/瓶；隔2~3天换液；
3. 经过11 14天扩增及传代过程，总共可收获不小于3x 108个细胞。
权利要求
1. 一种非动物源性细胞培养血清替代物，由如下方法制备得到取3～5体积单位O型的血沉棕黄层和1体积单位AB型的血浆混合，300～400g离心，取上清液作为一个体积单位的富含血小板血浆；将富含血小板血浆过滤除去白细胞，-10℃以下冷冻保存备用，使用前30～37℃解冻、3000～5000g离心去除血小板膜碎片，既得所述非动物源性细胞培养血清替代物，以PLT表示。
2. 如权利要求1所述的非动物源性细胞培养血清替代物，其特征在于所 述非动物源性细胞培养血清替代物由如下方法制备得到取4体积单 位O型的血沉棕黄层和1体积单位AB型的血浆混合，341g离心6min, 取上清液作为一个体积单位的富含血小板血浆；将富含血小板血桨过 滤除去白细胞，-30°(3冷冻保存备用，使用前37X:解冻、5000g离心5min 去除血小板膜碎片，既得所述非动物源性细胞培养血清替代物，即PLT。
3. 如权利要求1所述的非动物源性细胞培养血清替代物作为胎牛血清替 代物在细胞培养中的应用。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所非动物源性细胞培养血清替 代物作为胎牛血清替代物用于培养间质干细胞、人软骨细胞、人肌腱 细胞或皮肤人成纤维细胞。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用为在DMEM培养 液中添加10%体积分数的PLT,用于细胞培养。
全文摘要
本发明提供了一种非动物源性细胞培养血清替代物(PLT)及其应用，所述PLT由如下方法制备得到取3～5体积单位O型的血沉棕黄层和1体积单位AB型的血浆混合，300～400g离心，取上清液作为一个体积单位的富含血小板血浆；将富含血小板血浆过滤除去白细胞，-10℃以下冷冻保存备用，使用前30～37℃解冻、3000～5000g离心去除血小板膜碎片，既得所述非动物源性细胞培养血清替代物。本发明的有益效果主要体现在利用PLT作为胎牛血清替代物用于细胞培养，能够免除细胞培养中的动物源性成分，加速细胞倍增，从而满足临床安全和缩短手术周期需求，不仅适用于间质干细胞，亦适用于其他人源细胞的扩增培养。
文档编号C12N5/0775GK101486996SQ200910096079
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月6日 优先权日2009年2月6日
发明者姜洋子, 欧阳宏伟 申请人:浙江大学