专利名称：：一种耐氧性双歧杆菌的制作方法
技术领域：
：本发明属于食品科学
技术领域：
，主要涉及一种耐氧性的双歧杆菌菌抹。
背景技术：
：自1899年Tissier首次从婴儿粪便中发现并分离出双歧杆菌以来，后续的研究发现双歧杆菌作为一种活性菌在功能性制品中具有很好的健康作用。这些作用主要包括抑制肠道病原菌的生长、抑制致癌因子及其活性、治疗腹泻与〗更秘、刺激免疫功能和降低血清胆固醇水平等。由于这些特殊的生理功能和保健作用，双歧杆菌被广泛应用到药品和乳制品中。然而，要使双歧杆菌发挥其保健功能，日摄入量应当不小于108CFU，因此产品中的活菌数在货架期内必须达到10tFU/克或毫升。一些对市售酸奶制品的调查研究表明，许多产品的活菌数量低于1(^CFU/克或毫升。影响双歧杆菌在酸奶制品中的存活率的因素有多种，包括菌种、pH值、储存条件、发酵产物(乳酸和醋酸)及溶解氧等。由于双》支杆菌属专性厌氧菌，在制造及储存过程中与溶解氧的接触是影响其存活和稳定性的一个重要因子。与需氧菌不同的是，双歧杆菌缺乏将溶解氧转化为水分子的系统，电子传递链的缺乏致使氧气不能完全还原过氧化氬。另外，双歧杆菌体内缺乏能分解过氧化氢的酶，与氧气的接触导致了一些代谢产物如02—、OH—、11202在细胞内的累积，大量的这些产物最终导致了细胞的死亡。为了解决这样的问题，人们对能够提高保存时存活率的各种添加剂比如说抗坏血酸、乳糖醇、木糖醇等的使用进行研究，但这些添加剂的使用会带来制造成本上升，嗜好性降低等问题。人们也通过研究能够阻断氧气与双歧杆菌发酵物接触的包装材料来提高保存时的存活率，但是，到目前为止，还未提出完全的不透氧容器，而一些低透氧的容器价格昂贵，且废弃物处理复杂，其利用也在多方面收到限制。国外的一些研究者发现，对于氧气的耐受性，在很大程度上取决于菌抹，部分双歧杆菌具有一定的氧耐受性。因此，改善双歧杆菌在发酵乳或者乳饮料中的存活性根本的解决方法在于找出即使在好氧条件下也能具有高存活性的双歧菌抹。TalwalkarA.和KailasapathyK等(Metabolicandbiochemicalresponsesofprobioticbacteriatooxygen,JournalofDairyScience,2003)在研究中发现某些双歧杆菌在非严格厌氧环境下能获得很好的生长。Meile等(Bifidobacteriumlactissp.nov.，amoderatelyoxygentolerantspeciesisolatedfromfermentedmilk，SystemAppliedMicrobiology,1997)从发酵奶制品中分离到一林氧耐受性强的乳酸双歧杆菌。ShinjiKawasaki等(ResponseofmicroaerophilicBifidobacteriumboumandBifidobacteriumthermophilumtooxygen,Appliedenvironmentmicrobiology,2006)所选育的两抹双歧杆菌在20%氧气浓度下能够4艮好的生长。目前工业所用的双ot支杆菌大部分对氧气比4交^:感，这对其产品在储存过程中保持较高的活菌有较大影响。
发明内容针对目前双歧杆菌制品中活菌数普遍偏低的现象，本发明提供一种能够耐受一定程度氧气的双歧杆菌。一种耐氧双歧杆菌，该双歧杆菌保藏名称为动物双歧杆菌乳酸亚种(5折cfo6acteWww<3m>wafc/acto)Qq08，保藏单位中国孩么生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏日期2009年1月4日，保藏号CGMCCNo.2844。该双歧杆菌为动物双歧杆菌，在TPY培养基上，厌氧培养24h后，呈现乳白色，光滑，圆形菌落。革兰氏染色阳性，菌体多为为杆状，少数存在分叉，透射电镜下很容易找到双歧杆菌典型的Y及H型。本发明的双歧杆菌是从新疆发酵乳、西藏干酪及健康人体粪便的菌抹中分离出的双歧杆菌再经耐氧性初篩和复筛得到的。培养方法为TPY培养基，2%的接种量，37°C，非严格厌氧培养。TPY培养基胰酶解酪朊10g;植质蛋白胨5g;酵母浸膏2.5g;葡萄糖15g;土温801ml;K2HP042g;MgCl2.6H200.5g;CaCl20.15g;ZnCl2.7H200.25g,FeClJ鼓量，半胱氨酸0.5g;pH6.5;H201000mL。短期保藏方式为采用脱脂乳培养基，37°C,将该双歧杆菌按照2%的接种量接种后培养至凝固后置4。C冰箱保藏，每个月转接一次。脱脂乳培养基脱脂乳9.5g，酵母提取物0.5g,葡萄糖2g,半胱氨酸0.05g,自然pH，H20100mL。本发明的双歧杆菌在TPY液体培养基中，通气的情况下生长良好，应用于药品和乳制品时，该双歧杆菌对贮存条件要求低，有较高存活率。图1是16-23SITS区序列分析图2是本发明的双歧杆菌在厌氧、微需氧、需氧条件培养下OD6oo值的变化曲线。具体实施方式菌抹的筛选从分离自新疆发酵乳、西藏干酪及健康人体粪便的菌抹中筛选。分离方法取样后做适当稀释，涂布平板，厌氧，37。C培养48h后，挑取单个菌落，做革兰氏染色镜检，对符合双歧杆菌典型形态特征的菌落保存于脱脂乳培养基中。筛选所用培养基及其培养方法TPY液体胰酶解酪朊10g;植质蛋白胨5g;酵母浸膏2.5g;葡萄糖15g;土温80lml;K2HP042g;MgCl2.6H200.5g;CaCl20.15g;ZnCl2.7H200.25g,FeCl3微量，半胱氨酸0.5g;pH6.5;H201000mL。种子培养条件厌氧，37°C，24h。初筛条件微需氧培养，250mL三角瓶，装液量100ml,摇床转速100rpm，37°C,24h。复筛条件需氧培养，250ml玻璃瓶，100ml装液量，摇床转速150rpm，200rpm，37°C，24h。耐氧性双歧杆菌的筛选方法双歧杆菌的耐氧性用RBGR值来考察。将活化好的菌株按照1%的接种量接入装有100mLTPY液体培养基的250mL三角瓶中，微需氧及需氧培养用八层纱布封口；厌氧培养条件的构建配置好的TPY培养基力口热至沸腾，加热过程中持续通入高纯氮气，5min后放入凉水浴中冷却，并持续通入氮气，冷却后用橡皮塞将瓶口封好，加入0.01。/。次曱基蓝^f故为指示剂，液体变蓝，说明尚有氧气残留。RBGR值的确定将接种后的三角瓶置于摇床，37°C,培养24h后取出测定OD600,RBGR值为需氧条件下测得的OD6oo值与严格厌氧条件下测得的OD,值的比值。RBGR值越大，说明该菌的耐氧性越好。(1)耐氧性双歧杆菌初步筛选将分离到的双歧杆菌，在100rpm的转速下，测定不同菌株的RBGR值(结果见表l)。表l不同菌抹耐氧性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表1可以得到RBGR值高于0.7的菌抹有7株，其中B.longum.9631生长不好，所以保留另外6抹RBGR值较高的双歧杆菌菌抹进行复筛。(2)耐氧性双歧杆菌复筛将初筛得到的6抹菌在氧气浓度逐渐增大的情况下，测定RBGR值'结果见表2。表2耐氧性双歧杆菌复筛结果菌抹B邻p.943B.spp.9415B邻p.959B邻p.9518B邻p.9519B.spp.9639A,，37。C,24h磨rpm0.952±0.0156a0.829±0.0085c0.945±0.0198a0.930±0.0042a200rpm0.7335±0細320.6965±0.0049ab0.481±0.0226b150rpm0.725±0.0693s0.707±0.24750.5985±0.0163abab0.7435±0.0035d0.7115±0.0120.8785±0.0049b0,4485士0.00211ab0.457±0.0085t0.4305±0.15060.683±0.01840.708±0.0665由表2可知，B邻p.943在三种不同的摇床转速下，均具有较高的RBGR值，因此，该菌具有最好的耐氧性。该双歧杆菌的特征描述和鉴定结果理化鉴定及其结果描述该菌在TPY培养基上，厌氧培养24h后，呈现乳白色，光滑，圓形菌落。革兰氏染色阳性，菌体多为为杆状，少数存在分叉，透射电镜下很容易找到双歧杆菌典型的Y及H型。经过试-睑测试，该菌的生理生化特征见表3。表3生理生化特试验结果生理生化特试验结果征征注+表示阳性；-表示阴性；+-表示不确定根据伯爵氏细菌鉴定系统，由此上表可以初步确定该菌为动物双歧杆菌(说y^/o6ocfer/zw7."w/w"fe)。该菌抹的分子鉴定及其结果经16-23rRNA试验验证(系统发育树见图1)，该菌抹与动物双歧杆菌乳酸亚种(万折(iok^eWww.aw7wato/ac^DSM10140T(X89513))同源性为100%，命名为动物双歧杆菌乳酸亚种(5折do6"cten'ww.a"/wa/^+凝固++++++++++++接触酶运动性厌氧牛奶反应D-核糖L-阿拉伯葡萄糖酸盐木糖甘露糖果糖半乳糖蔗糖水杨苷术、普-普享、營二浙来酉分浙二一二予A争卜」禽一二喬t瞎享#八厶帛lw、vsir千木冲J么\、普叠享米者s:、魯藻二露s海蜜甘孝subsp/ac他)Qq08。该菌较目前市场上声称耐氧的5折cfo6acfeWM附./acfcBbl2菌才朱具有更高的RBGR值，其耐氧程度优于5zy^oZwcfen'ww./acfeBbl2。新微生物的命名及保藏情况命名为动物双歧杆菌乳酸亚种Qq08(S折cfo6acten'謂.am'應fcsubsp保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，筒称CGMCC。保藏日期2009年1月4日，保藏号CGMCCNo.2844。该双歧杆菌的筒单培养条件及其生长情况该双歧杆菌的简单培养及保藏条件该双歧杆菌的培养方法为TPY培养基，2%的接种量，37°C，非严格厌氧培养。该双歧杆菌的短期保藏方式为采用脱脂乳培养基，37°C，将该双歧杆菌按照2%的接种量接种后培养至凝固后置4。C冰箱保藏，每个月转接一次。脱脂乳培养基脱脂乳9.5g，酵母提取物0.5g,葡萄糖2g，半胱氨酸0.05g，自然pH,H20100mL。TPY培养基胰酶解酪朊10g;植质蛋白胨5g;酵母浸膏2.5g;葡萄糖15g;土温801ml;K2HP042g;MgCl2.6H200.5g;CaCl20.15g;ZnCl2.7H200.25g，FeCl3微量，半胱氨酸0.5g;pH6.5;H201000mL。该菌在非严格厌氧条件下的生长情况将该双歧杆菌在下述三种条件下培养24h后，取样测定OD6oo值，结果见图2，由此可知，该菌在微需氧以及需氧的条件下均能获得不同程度的生长，在严才各厌氧情况下的生长状况略好于有氧气存在的情况。一、厌氧培养，250mL三角瓶，装液量100ml，37°C，严才各厌氧。二、微需氧培养，250mL三角瓶，装液量100ml，摇床转速100rpm，37°C。三、需氧培养，250ml三角瓶，100ml装液量，摇床转速200rpm,37°C。权利要求1、一种动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)Qq08，保藏号为CGMCCNo.2844。全文摘要本发明公开了一种耐氧性双歧杆菌，该双歧杆菌保藏名称为动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)Qq08，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2009年1月4日，保藏号CGMCCNo.2844。本发明的双歧杆菌可以在TPY液体培养基中，通气的情况下生长良好，应用于药品和乳制品时，该双歧杆菌对贮存条件要求低，有较高存活率。文档编号C12N1/20GK101503667SQ20091009651公开日2009年8月12日申请日期2009年3月5日优先权日2009年3月5日发明者何国庆,李青青,晖阮,陈启和申请人:浙江大学