专利名称：：一种萝卜硫素的提取方法
技术领域：
：本发明属于生物化学
技术领域：
，涉及天然产物中有效成分的提取纯化工艺，具体为一种从干燥的西兰花种子或新鲜的西兰花球中提取萝卜硫素的方法。目前，根据流行病学及药理学的研究表明，癌症发病率低的地方，人们饮食中蔬菜、水果所占比例较大。蔬菜、水果中存在一种或多种阻止或减慢癌症发展的植物活性成分，如番茄中的番茄红素、大豆制品中的大豆异黄酮、浆果中的鞣化酸以及十字花科蔬菜中的萝卜硫素、吲哚类物质，均被证实具有良好的防癌抗癌作用。在众多含有抗癌活性成分的蔬菜中，十字花科(洋白菜、花茎甘蓝、球茎甘蓝青花椰菜、芥兰、莴苣、白萝卜和高丽菜等)中富含多种芥子苷(glucosinolates,简称GLs)。葡萄糖莱菔子苷(芥子苷的一种)经黑芥子硫酸苷酶酶解(myrosinase)或酸水解后，产生萝卜硫素(sulforaphen，简称SF)，它是迄今为止蔬菜中发现的最强的抗癌成分之一。萝卜硫素又称"莱菔子素"，就其化学成分而言，为异硫代氰酸盐衍生物，易溶于水,相对分子质量177.3，分子式C6H11S2N0，结构式如下萝卜硫素是一种多功能诱导物，可诱导机体产生II型解毒酶-谷光甘肽转移酶和醌还原酶，此酶可对许多致癌物产生抗性，从而起到抗癌作用。萝卜硫素具有较强的抗癌作用且为植物活性物质，无毒副作用，所以具有广阔的市场
背景技术：
：前景。目前，有研究报道从西兰花中提取萝卜硫素的方法，如专利为"一种提取萝卜硫素的方法(CN101143842)"，"一种莱菔硫垸的制备方法(CN1982294)"均涉及萝卜硫素的提取和纯化方法，但这两种方法制备得到的萝卜硫素的转化率较低，只限于实验规模制备少量产品，难于大规模地进行工业化的生产。目前，还没有解决上述问题更好的实施方法。
发明内容本发明的目的是克服上述现有技术的不足，提供一种萝卜硫素的提取方法的改进，该提取方法优化了原有提取纯化方法，提高了萝卜硫素的转化率，大大降低了萝卜硫素的生产成本。本发明的技术方案一种萝卜硫素的提取方法，包括以下步骤-(1)用干燥的西兰花种子或新鲜的西兰花球为原料，粉碎至3060目后，按重量计加入1.52倍量的水，用5%盐酸调节pH4.14.5，每公斤原料中加入1克的粗芥子硫苷酸酶后，在3134X:的温度下水解13h;(2)将水解后的西兰花固液混合物冷冻干燥成含水率小于5%的粉末；(3)冷冻干燥后的粉末中，分3次共加入10倍重量的纯丙酮，在室温下共浸提48h，过滤、合并3次制备得到的丙酮浸提液，将滤液于354(TC温度下真空浓縮得到萝卜硫素粗品；(4)将上述制备得到的萝卜硫素粗品采用硅胶柱层析，采用乙酸乙酯和乙醇的混合液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集萝卜硫素馏分，354(TC温度下真空浓縮；(5)将上述经真空浓縮的萝卜硫素先用甲醇溶解后，经0.2wm微孔滤膜过滤后，用2040pm的C18硅胶装柱，采用不同浓度的甲醇水进行梯度洗脱，收集萝卜硫素馏分，3540'C温度下真空干燥，得到高含量的萝卜硫素。上述的一种萝卜硫素的提取方法，作为优选，所述的粗芥子硫苷酸酶为芥子硫苷酸酶的粗品，其制备方法是取新鲜甘蓝，粉碎至3060目，用50目的双层纱布过滤后得滤液，滤液在5'C温度下加入1倍量滤液体积的纯丙酮，混合均匀，用高速冷冻离心机5。C下离心，离心机转速为4000r/min;得沉淀物，即为芥子硫苷酸酶的粗品，将该芥子硫苷酸酶的粗品放入-20'C下进行冷冻保存、备用。上述的一种萝卜硫素的提取方法，作为优选，所述萝卜硫素粗品硅胶柱层析前，需要先在萝卜硫素粗品中加入200目的硅胶拌样，硅胶的加入量为萝卜硫素粗品重量的两倍，经硅胶拌样后的萝卜硫素粗品在红外灯下烘干直至丙酮完全挥发即可。上述的一种萝卜硫素的提取方法，作为优选，步骤(4)中梯度洗脱前需要先加入3倍柱体积量的乙酸乙酯进行洗脱除杂。上述的一种萝卜硫素的提取方法，作为优选，步骤(4)中用于梯度洗脱的洗脱剂为乙酸乙酯与乙醇的混合溶液，该混合溶液中乙酸乙酯与乙醇的体积比为13:97。上述的一种萝卜硫素的提取方法，作为优选，步骤(4)中以乙酸乙酯和乙醇的混合液为洗脱剂进行梯度洗脱的操作需要进行三次，三次梯度洗脱时乙酸乙酯与乙醇的体积比分别为1:9，2:8，3:7。上述的一种萝卜硫素的提取方法，作为优选，步骤(5)中所述的洗脱剂是浓度为6080%的甲醇。本发明通过优化萝卜硫素原有的提取纯化工艺(尤其是通过添加粗芥子硫苷酸酶进行酶解)，大大地提高了萝卜硫素的转化率，该提取方法得到的萝卜硫素的转化率高达8cm以上，从而大大地降低了萝卜硫素的生产成本。同时，该提取方法还可以根据市场的需要得到不同含量的萝卜硫素产品，具有很好的实用性；此外，该提取方法还适用于工业化的大规模的生产。本发明中涉及的配比及其百分含量均以重量计。具体实施例方式以下结合实施例，对本发明的技术方案作进一步说明，但这些实施例的目的并不在于限制本发明的保护范围。在这些实施例中，除另有说明外，所有百分含量均以重量计。实施例1:粗芥子硫苷酸酶(即芥子硫苷酸酶的粗品)的制备称取lkg新鲜甘蓝，粉碎过30目筛，用50目的双层纱布过滤后，得到650ml滤液；滤液在5'C下加入1倍滤液体积量的纯丙酮，混合均匀，在高速冷冻离心机下离心，离心机转速为4000r/min，离心时的温度为4"C;得到41.2g沉淀物，该沉淀物即为芥子硫苷酸酶的粗品，将该芥子硫苷酸酶的粗品放入-20'C下进行冷冻保存、备用。称取1.0kg西兰花干燥种子，粉碎至30目，加入1.5kg水，用5%盐酸调节pH为4.1,加入粗芥子硫苷酸酶1.10g，在3rc条件下水解ih;将水解后的固液混合物冷冻干燥，得到1.05kg的粉末，所得到的粉末的含水量应小于5%。用10.5kg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量4.5kg，浸提3小时，第二次丙酮用量3kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量3kg，浸提1.5h，合并3次浸提液，在35。C温度下真空浓缩，得到47.71g浸膏，即得含量2.91%的萝卜硫素粗品。在上述制备得到的萝卜硫素中加入200目的硅胶进行拌样，硅胶的加入量为萝卜硫素粗品重量的两倍，经硅胶拌样后的萝卜硫素粗品在红外灯下烘干至丙酮完全挥发。经烘干后的萝卜硫素粗品装入200目的硅胶中进行层析，层析时采用干法上样，梯度洗脱的方法。所述的萝卜硫素粗品层析包括硅胶柱层析和反相硅胶柱层析两步；其中硅胶柱层析先进行，反相硅胶柱层析后进行。所述的硅胶柱层析分为四步进行1、在硅胶柱中加入3倍柱体积的乙酸乙酯进行洗脱除杂；2、在硅胶柱中加入2倍柱体积乙酸乙酯与无水乙醇的混合液，该混合液中乙酸乙酯无水乙醇的体积比为h9，进行洗脱，得到馏分l;3、在硅胶柱中加入2倍柱体积乙酸乙酯与无水乙醇的混合液，该混合液中乙酸乙酯无水乙醇的体积比为2:8，进行洗脱，得到馏分2;4、在硅胶柱中加入2倍柱体积乙酸乙酯与无水乙醇的混合液，该混合液中乙酸乙酯无水乙醇的体积比为3:7，进行洗脱，得到馏分3;合并馏分l、2、3，在35'C温度下真空浓縮，得到4.llg含量24.30%的萝卜硫素。所述的反相硅胶柱层析步骤如下将上述制备得到的24.30%的萝卜硫素用10ml纯甲醇溶解，经O.lum微孔滤膜过滤后；用20nm的C18硅胶装柱，采用不同浓度的甲醇水为洗脱剂进行梯度洗脱，该梯度洗脱操作重复3次，第一次洗脱剂是浓度为80%的甲醇，第二次洗脱剂是浓度为70%的甲醇，第三次洗脱剂是浓度为60%的甲醇；收集第二次洗脱得到的馏分，3(TC温度下真空浓縮除去甲醇后，经冷冻干燥，得到含量为95.10y。的萝卜硫素937.5mg。实施例2:称取1.kg西兰花千燥种子，粉碎至60目，加入3kg水，用5%盐酸调节pH为4.5，加入粗芥子硫苷酸酶1.10g(实施例1制备得到的)，在34'C条件下水解3h;将水解后的固液混合物冷冻干燥，得到1.05kg的粉末，所得到的粉末的含水量应小于5%。用10.5kg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量4kg，浸提2小时，第二次丙酮用量3.5kg，浸提lh，第三次丙酮用量3kg，浸提lh，合并3次浸提液，在4CTC真空浓縮，得到46.54g浸膏，即得含量2.83%的萝卜硫素粗品；在上述制备得到的萝卜硫素中加入300目的硅胶进行拌样，硅胶的加入量为萝卜硫素粗品重量的两倍，经硅胶拌样后的萝卜硫素粗品在红外灯下烘干直至丙酮完全挥发。经烘干后的萝卜硫素粗品装入200目的硅胶中进行层析，层析时采用干法上样，梯度洗脱的方法。所述的萝卜硫素粗品层析包括硅胶柱层析和反相硅胶柱层析两步；其中硅胶柱层析先进行，反相硅胶柱层析后进行。所述的硅胶柱层析分为四步进行1、在硅胶柱中加入3倍柱体积的乙酸乙酯进行洗脱除杂；2、在硅胶柱中加入2倍柱体积乙酸乙酯与无水乙醇的混合液，该混合液中乙酸乙酯无水乙醇的体积比为l:9,进行洗脱，得到馏分l;3、在硅胶柱中加入2倍柱体积乙酸乙酯与无水乙醇的混合液，该混合液中乙酸乙酯无水乙醇的体积比为2:8，进行洗脱，得到馏分2;4、在硅胶柱中加入2倍柱体积乙酸乙酯与无水乙醇的混合液，该混合液中乙酸乙酯无水乙醇的体积比为3:7,进行洗脱，得到馏分3;合并馏分l、2、3，在35。C温度下真空浓缩，得到3.98g含量23.30%的萝卜硫素。所述的反相硅胶柱层析步骤如下将上述制备得到的23.30%的萝卜硫素用10ml纯甲醇溶解，经0.3um微孔滤膜过滤后；用40um的C18硅胶装柱，采用不同浓度的甲醇水为洗脱剂进行梯度洗脱，该梯度洗脱操作重复3次，第一次洗脱剂是浓度为80%的甲醇，第二次洗脱剂是浓度为70%的甲醇，第三次洗脱剂是浓度为60%的甲醇；收集第二次洗脱得到的馏分，40'C温度下真空浓縮除去甲醇后，经冷冻干燥，得到含量为95.20%的萝卜硫素870.5mg。实施例3:称取lkg新鲜西兰花花球，粉碎至30目，加入1.5kg水，用5%盐酸调节pH为4.3，加入粗芥子硫苷酸酶1.10g(实施例l制备得到的)，在3rC条件下水解2h;将水解后的固液混合物冷冻干燥，得到157.32g的粉末；用1.7kg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量0.7kg，浸提3小时，第二次丙酮用量0.5kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量0.5kg，浸提1.5h，合并3次浸提液，在35。C真空浓縮，得到11.05g浸膏，即得含量2.53%的萝卜硫素粗品；在上述制备得到的萝卜硫素粗品中加入200目的硅胶进行拌样，硅胶的加入量为萝卜硫素粗品重量的两倍，经硅胶拌样后的萝卜硫素粗品在红外灯下烘干直至丙酮完全挥发。经烘干后的萝卜硫素粗品装入200目的硅胶中进行层析，层析时采用干法上样，梯度洗脱的方法。所述的萝卜硫素粗品层析包括硅胶柱层析和反相硅胶柱层析两步；其中硅胶柱层析先进行，反相硅胶柱层析后进行。所述的硅胶柱层析分为四步进行1、在硅胶柱中加入3倍柱体积的乙酸乙酯进行洗脱除杂；2、在硅胶柱中加入2倍柱体积乙酸乙酯与无水乙醇的混合液，该混合液中乙酸乙酯无水乙醇的体积比为l:9，进行洗脱，得到馏分l;3、在硅胶柱中加入2倍柱体积乙酸乙酯与无水乙醇的混合液，该混合液中乙酸乙酯无水乙醇的体积比为2:8，进行洗脱，得到馏分2;4、在硅胶柱中加入2倍柱体积乙酸乙酯与无水乙醇的混合液，该混合液中乙酸乙酯无水乙醇的体积比为3:7，进行洗脱，得到馏分3;合并馏分1、2、3，在35。C温度下真空浓縮，得到0.96g含量20.21%的萝卜硫素。所述的反相硅胶柱层析步骤如下将上述制备得到的20.21%的萝卜硫素用2ml纯甲醇溶解，经0.2um微孔滤膜过滤后；用30um的C18硅胶装柱，采用不同浓度的甲醇水为洗脱剂进行梯度洗脱，该梯度洗脱操作重复3次，第一次洗脱第二次洗脱剂是浓度为70%的甲醇，第三次洗脱剂是浓度为60%的甲醇；收集第二次洗脱得到的馏分，4(TC温度下真空浓縮除去甲醇后，经冷冻千燥，得到含量为94.70%的萝卜硫素147.6mg。本发明提供的萝卜硫素提取方法具有很高的转化率，不仅适用于工业化生产，而且降低了生产成本。以下通过具体实验数据来比较说明本发明提供的萝卜硫素提取方法与现有方法之间的区别。由于萝卜硫素是以前体葡萄糖莱菔子苷的形式存在的，葡萄糖莱菔子经过水解后才能转化为苷萝卜硫素，水解过程的转化率直接决定了所采用提取工艺的收率。通常采用的水解方法有二种，一是仅控制水解过程的pH值(专利CN1982294采用此法)；二是在控制pH值得同时，加入抗坏血酸(CN101143842)。本发明采用了加入粗芥子硫苷酸酶和调节PH值的方法，使水解转化率得到了很大提高。以下进行了三种转化方法的对比试验。1、采用专利一种莱菔硫垸的制备方法(CN1982294)的方法迸行萝卜硫素的转化称取100g西兰花干燥种子，粉碎至50目，加入180g水，用5%盐酸调节pH为4.2，在28。C条件下水解2h;将水解后的固液混合物冷冻干燥，得到101.llg的粉末；用l.lkg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量0.5kg，浸提3小时，第二次丙酮用量0,3kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，合并3次浸提液，在35。C真空浓缩，得到3.52g浸膏，即得含量2.11%的萝卜硫素粗品；2、采用专利一种提取萝卜硫素的方法(CN101143842)"进行萝卜硫素的转化称取100g西兰花干燥种子，粉碎至3060目，加入180g水，用5%盐酸调节pH为4.0，在28'C条件下水解2h;将水解后的固液混合物冷冻干燥，得到106.llg的粉末；用1.lkg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量0.5kg，浸提3小时，第二次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，合并3次浸提液，在35。C真空浓縮，得到3.82g浸膏，即得含量2.31%的萝卜硫素粗品；3、称取100g西兰花千燥种子，粉碎至40目，加入180g水，用5%盐酸调节pH为4.5，加入粗芥子硫苷酸酶O.11g在31'C条件下水解2h;将水解后的固液混合物冷冻干燥，得到108.53g的粉末；用1.lkg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量0.5kg，浸提3小时，第二次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，合并3次浸提液，在35"C真空浓縮，得到4.51g浸膏，即得含量2.93%的萝卜硫素粗品；三种方法萝卜硫素的转化率见表1。表1三种转化方法比较<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>从对比实施例可知，本发明提供的萝卜硫素提取方法将葡萄糖莱菔子转化为萝卜硫素的转化率大大提高，从而大大地降低了萝卜硫素的生产成本。权利要求1、一种萝卜硫素的提取方法，包括以下步骤(1)用干燥的西兰花种子或新鲜的西兰花球为原料，粉碎至30～60目后，按重量计加入1.5～2倍量的水，用5％盐酸调节pH4.1～4.5，每公斤原料中加入1克的粗芥子硫苷酸酶后，在31～34℃的温度下水解1～3h；(2)将水解后的西兰花固液混合物冷冻干燥成含水率小于5％的粉末；(3)冷冻干燥后的粉末中，分3次共加入10倍重量的纯丙酮，在室温下共浸提4～8h，过滤、合并3次制备得到的丙酮浸提液，将滤液于35～40℃温度下真空浓缩得到萝卜硫素粗品；(4)将上述制备得到的萝卜硫素粗品采用硅胶柱层析，采用乙酸乙酯和乙醇的混合液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集萝卜硫素馏分，35～40℃温度下真空浓缩；(5)将上述经真空浓缩的萝卜硫素先用甲醇溶解后，经0.2μm微孔滤膜过滤后，用20～40μm的C18硅胶装柱，采用不同浓度的甲醇水进行梯度洗脱，收集萝卜硫素馏分，35～40℃温度下真空干燥，得到高含量的萝卜硫素。2、如权利要求1所述的一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于所述的粗芥子硫苷酸酶为芥子硫苷酸酶的粗品，其制备方法是取新鲜甘蓝，粉碎至3060目，用so目的双层纱布过滤后得滤液，滤液在5'c温度下加入r倍量滤液体积的纯丙酮，混合均匀，在高速冷冻离心机下离心，离心机转速为4000r/min,离心时的温度为46t:;得沉淀物，即为芥子硫苷酸酶的粗品，将该芥子硫苷酸酶的粗品放入-2(TC下进行冷冻保存、备用。3、如权利要求1所述的一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于所述萝卜硫素粗品硅胶柱层析前，需要先在萝卜硫素粗品中加入200目的硅胶拌样，硅胶的加入量为萝卜硫素粗品重量的两倍，经硅胶拌样后的萝卜硫素粗品在红外灯下烘干直至丙酮完全挥发即可。4、如权利要求1所述的一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于步骤(4)中梯度洗脱前需要先加入3倍柱体积量的乙酸乙酯进行洗脱除杂。5、如权利要求1所述的一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于步骤(4)中用于梯度洗脱的洗脱剂为乙酸乙酯与乙醇的混合溶液，该混合溶液中乙酸乙酯与乙醇的体积比为13:97。6、如权利要求1所述的一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于步骤(4)中以乙酸乙酯和乙醇的混合液为洗脱剂进行梯度洗脱的操作需要进行三次，三次梯度洗脱时乙酸乙酯与乙醇的体积比分别为h9，2:8，3:7。7、如权利要求1所述的一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于步骤(5)中所述的洗脱剂是浓度为6080%的甲醇。全文摘要本发明属于生物化学
技术领域：
。目的是提供一种萝卜硫素的提取方法的改进，该提取方法优化了原有提取纯化方法，提高了萝卜硫素的转化率，大大降低了萝卜硫素的生产成本。一种萝卜硫素的提取方法，包括以下步骤1.用干燥的西兰花种子或新鲜的西兰花球为原料，粉碎后，加入水，调节pH4.1～4.5，加入粗芥子硫苷酸酶后，水解；2.将水解后的西兰花冷冻干燥成粉末；3.在粉末中，加入纯丙酮，浸提，过滤、合并丙酮浸提液，将滤液真空浓缩成萝卜硫素粗品；4.该萝卜硫素粗品梯度洗脱，收集馏分，真空浓缩；5.将萝卜硫素先用甲醇溶解后，经微孔滤膜过滤后，用C18硅胶装柱，采用甲醇水梯度洗脱，收集萝卜硫素馏分，真空干燥，得萝卜硫素。文档编号C12P11/00GK101544995SQ20091009819公开日2009年9月30日申请日期2009年5月7日优先权日2009年5月7日发明者刑健彬,童云标,陈安良,陈张金申请人:杭州临安天鸿生物科技有限公司