专利名称：：拟态弧菌显色培养基的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物显色培养基，属于食品卫生微生物安全监测领域。
背景技术：
：在全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中，70%是由于食用了各种致病性微生物污染的食品和饮水造成的。拟态弧菌(W6n》柳'm/cw)系革兰氏阴性弧菌，具有单鞭毛，有动力，与副溶血弧菌、霍乱弧菌一样，属正常海洋菌，低度嗜盐菌，广泛分布于自然界河水、海水以及海产品中。拟态弧菌是十二种致病性弧菌之一。可引起人类的腹泻、中耳炎、外伤感染和水生生物的弧菌病(KZ^Vw/力，引起鱼类、甲壳类等水产动物严重的腹水病，还可以通过水产动物或水产品感染人类，引发肠道传染病或食物中毒，主要症状有腹泻、呕吐及腹痛，大便呈水样或粘液血便。发病年龄不限，但小儿少见。发病者多有吃生牡蛎、虾蟹史。在美国、北美、新西兰、孟加拉及非洲国家均有病例报道。我国福建、北京、上海、江苏及浙江地区也有发病。多呈散发或暴发，一年四季均有发病，以夏季为多。潜伏期平均24小时。因此，开展水产品中拟态弧菌的污染情况调查，研究快速分离和检测拟态弧菌的方法，加强对拟态弧菌性引起疾病防治的研究具有重要意义。准确及时的检测手段是预防和控制拟态弧菌污染和扩散的关键。目前对拟态弧菌检测的方法以传统的微生物学检测为主。常用的选择性培养基主要有NaCl蔗糖琼脂培养基、嗜盐菌选择性琼脂、硫代硫酸钠一柠檬酸钠一胆盐一蔗糖琼脂培养基(TCBS)，这些培养基存在共同问题特异性低，分离的菌株杂菌较多。如副溶血弧菌、创伤弧菌在TCBS琼脂平板上生长时很像拟态弧菌，只能通过一些繁杂耗时的生化反应把它们区分开来。目前，有些成熟的微生物快速鉴定系统已经被应用于拟态弧菌的检测，得到认可的主要有API20E和VITEK等，但这些方法所需的仪器和试剂耗材都比较昂贵，检测成本非常高，不利于检测部门与企业的普及应用。
发明内容针对上述情况，为了克服现有拟态弧菌选择性培养基特异性低的缺陷，本发明提供了一种特异性强的拟态弧菌显色培养基，可对拟态弧菌进行快速检测。所述拟态弧菌显色培养基，其配方为酵母膏粉5g、鱼蛋白胨5g、蛋白胨5g、氯化钠10g、柠檬酸钠810g、硫代硫酸钠8.511g、胆酸钠15g、牛胆粉27g、蔗糖1520g、纤维二糖1520g、阿拉伯糖1520g、柠檬酸铁13g、琼脂1220g、溴麝香草酚兰0.04g、麝香草酚兰0.04g、蒸馏水1000mL。优选地，拟态弧菌显色培养基配方为酵母膏粉5g、鱼蛋白胨5g、蛋白胨5g、氯化钠10g、柠檬酸钠10g、硫代硫酸钠10g、胆酸钠3g、牛胆粉5g、蔗糖20g、纤维二糖20g、阿拉伯糖20g、柠檬酸铁lg、琼脂15g、溴麝香草酚兰0.04g、麝香草酚兰0.04g、蒸馏水1000mL。所述培养基的pH值为8,09.4，优选为8.6±0.2。本发明根据拟态弧菌的基础营养需求、特殊生态环境、特殊生化反应即酶系统和代谢规律及对特定抑菌物质的耐受性等方面的特点，设计出能够明显区别于其它细菌，特别是其它弧菌和其它常见食品致病菌的拟态弧菌显色培养基。(1)营养需求和特殊生态环境由于弧菌属微生物对营养要求不高，但有一定的嗜盐性；因此拟态弧菌显色培养基的酵母膏粉、蛋白胨与NaCl己能满足其营养需求，但通过添加适量的鱼蛋白胨能更好的促进弧菌的生长。(2)特殊生化反应即酶系统和代谢规律及其指示系统因拟态弧菌不具有分解纤维二糖、蔗糖或阿拉伯糖的酶系统，即不能分解上述三种糖，在此培养基中产生的代谢产物与指示剂作用，菌落呈绿色或蓝绿色；而其它弧菌所具有的酶系统的则能够分解其中的一种、两种或三种糖，这些糖类的代谢产物与指示剂作用，菌落呈黄色；若一些其它杂菌在拟态弧菌显色培养基上生长，则可以利用柠檬酸铁指示硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色。(3)特定抑菌物质的耐受性胆酸钠、牛胆粉对革兰氏阳性菌有强大的抑制作用，对革兰氏阴性菌仅有轻度的抑制作用，与枸橼酸钠和硫代硫酸钠合用时，对大肠杆菌群的生长与菌体蛋白质的合成都有抑制作用；(4)其他因素NaCl可促进行拟态弧菌的生长，同时也起到了抑制非嗜盐菌的生长；硫代硫酸钠和柠檬酸铁均为还原刘，可以使细菌所产兰的硫化氖避免氧化而使一些菌株代谢产硫化氢气体与柠檬酸铁作用，使菌落中心呈黑色，从而排除这些杂菌；海水中的正常pH值在8.4左右，拟态弧菌显色培养基的pH为8.09.4，这样既可以促进行弧菌的生长又可以抑制其它菌的生长。本发明培养基可以按照以下方法制备根据配方称取各组份，将酵母膏粉、鱼蛋白胨、蛋白胨、氯化钠、柠檬酸钠、硫代硫酸钠胆酸钠、牛胆粉、柠檬酸铁、琼脂、蒸馏水加在一起并加热搅动，使其溶解，煮沸12min，冷却到5055'C，加入蔗糖、纤维二糖、阿拉伯糖、溴麝香草酚兰、麝香草酚兰，震荡摇均，用1mol/LNaOH调pH到8.09.4。使用该培养基可对海产品中的拟态弧菌进行检测，在36±1'C培养1218h后，拟态弧菌菌落在该培养基上呈光滑、凸起、直径l3mm、边缘整齐的绿色或蓝绿色菌落，能够明显与其他菌种区分，特别是对营养代谢相似且处于同一生态环境中的常伴菌。本发明通过筛选拟态弧菌特异性酶及显色底物，利用拟态弧菌对胆酸钠、牛胆粉的抗性，以及对碳源利用能力的不同，开发拟态弧菌的显色培养基，可有效将拟态弧菌从溶藻弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、辛辛那提弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、弗尼斯弧菌、海鱼弧菌、鲨鱼弧菌、霍利斯弧菌中区分出来；拟态弧菌显色培养基与常规方法TCBS分离培养基相比，拟态弧菌显色培养基比TCBS具有更高的检测效率，拟态弧菌显色培养基检测拟态弧菌省去了TCBS分离培养后的生化试验，缩短检测时间，降低检测成本，减少工作量，克服了传统培养基选择性差等缺点；从而方便快速地对海产品中的拟态弧菌进行检测，可直接用于对拟态弧菌进行分离鉴定。具体实施例方式实施例1:本发明所述的拟态弧菌显色培养基特异性的验证1.拟态弧菌显色培养基的配制取酵母膏粉5g、鱼蛋白胨5g、蛋白胨5g、氯化钠10g、柠檬酸钠i0g、硫代硫酸钠10g、胆酸钠3g、牛胆粉5g、柠檬酸铁lg、琼脂15g、蒸镏水lOOOmL加在一起并加热搅动，使其溶解，煮沸12min，冷却到5055。C，加入蔗糖20g、纤维二糖20g、阿拉伯糖20g、溴麝香草酚兰0.04g、麝香草酚兰0.04g，震荡摇均，用lmol/LNaOH调pH到8.6士0.2，将培养基倒入平板中，冷却后倒置放入15。C培养箱中备用。2.接种拟态弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、非01型霍乱弧菌、辛辛那提弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、弗尼斯弧菌、海鱼弧菌、鲨鱼弧菌、霍利斯弧菌复苏采用碱性蛋白胨水(APW);埃希氏大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌0157、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌复苏采用营养肉汤；当复苏6h8h后，用接种环(直径3mm)挑取1环，分别划线接种在拟态弧菌显色培养基平板上，37°C培养16h24h，观察各个菌株在显色培养基上的生长情况。3.结果及分析在拟态弧菌显色平板上，出现绿色或蓝绿色菌落；其它弧菌菌落呈黄色；埃希氏大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌0157、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的显色平板上均无生长现象；说明显色培养基对拟态弧菌具有较好的选择性和特异性。实施例2:本发明所述的拟态弧菌显色培养基平板效率的验证1.拟态弧菌显色培养基的配制取酵母膏粉5g、鱼蛋白胨5g、蛋白胨5g、氯化钠10g、柠檬酸钠10g、硫代硫酸钠10g、胆酸钠3g、牛胆粉5g、柠檬酸铁lg、琼脂15g、蒸馏水lOOOmL加在一起并加热搅动，使其溶解，煮沸12min，冷却到5055°C，加入蔗糖20g、纤维二糖20g、阿拉伯糖20g、溴麝香草酚兰0.04g、麝香草酚兰0.04g，震荡摇均，用lmol/LNaOH调pH到8.6士0.2，将培养基倒入平板中，冷却后倒置放入15。C培养箱中备用。2.接种将拟态弧菌标准菌株在3.5%NaCl营养琼脂复苏24h后，接种环挑取l环，加入到10mL0.85M生理盐水中配成菌悬液原液，然后进行10倍梯度稀释:稀释8个梯度，用移液管吸取各浓度菌液lmL，分别涂布TCBS培养基、拟态弧菌显色培养基和嗜盐琼脂平板(含3y。NaCl)平板，每个平板设10次重复；拟态弧菌显色培养基平板、TCBS琼脂培养基和嗜盐琼脂平板(含3%NaCl)在37°C培养，24h与48h后，菌落记数(取30至300之间菌落数的梯度)，计算各种选择培养基的出菌率。3.出菌率的计算与数据处理方法出菌率(平板效率)指在选择性培养基上生长的菌落个数与在非选择性培养基上生长的菌落个数的比值。非选择培养基上菌落个数运用SPSS软件配对样品T检验(Paired-SamplesTTest)方法进行显著性分析。4.结果及分析拟态弧菌显色培养基平板经过16h48h培养后观察记数，其细菌菌落数并没有发生变化。对30300之间的菌落数进行记数，与嗜盐琼脂平板记数结果进行对比，计算出菌率，结果见表1。由于菌液涂布的差异造成同种培养基的出菌率的呈一定的偏差。对两种培养基出菌率进行配对样品T检验，结果表明拟态弧菌显色培养基、TCBS平板上生长的菌落数无显著差异(P〉0.05)，2种培养基可以达到相同的检测限，培养基的灵敏度相当。表l不同培养基对拟态弧菌的出菌率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例3:本发明所述的拟态弧菌显色培养基精确度及灵敏度的验证1.拟态弧菌显色培养基的配制取酵母膏粉5g、鱼蛋白胨5g、蛋白胨g、氯化钠10g、柠檬酸钠10g、硫代硫酸钠10g、胆酸钠3g、牛胆粉5g、柠檬酸铁lg、琼脂15g、蒸馏水1000mL加在一起，并加热搅动，使其溶解，煮沸12min，冷却到5055°C，加入蔗糖20g、纤维二糖20g、阿拉伯糖20g、溴麝香草酚兰0.04g、麝香草酚兰0.04g，震荡摇均，用lmd/LNaOH调pH至U8.6土0.2，将培养基倒入平板中，冷却后倒置放入15r培养箱中备用。2.接种(1)纯菌污染样品将拟态弧菌MCCC1H00078(中国海洋微生物菌种保藏管理中心菌种编号)在3.5%NaCl营养琼脂上复苏后，进行IO倍梯度稀释，用移液管吸取10—410—6各浓度菌液1mL分别加到25g鱼肉中，均匀混合2h后，按照国标GB/T4789.7-2008检验程序，在碱性蛋白胨水(APW)中增菌培养18h，取l环增菌液划线接种拟态弧菌显色培养基和TCBS平板，36°C培养16h24h，观察拟态弧菌的检出情况。同时吸取1CT410—6各浓度菌液1mL涂布嗜盐琼脂平板对拟态弧菌MCCC1H00078进行计数。(2)混合菌液污染样品将拟态弧菌MCCC1H00078复苏后，进行10倍梯度稀释，用移液管吸取10—31()—4各浓度菌液1mL分别加到25g鱼肉中，同时将非Ol霍乱弧菌(约103104cfu/mL)、溶藻弧菌(约103104cfb/mL)、创伤弧菌(约103104cfo/mL)、副溶血性弧菌(约1(^10、fo/mL)、河流弧菌(约103104cfu/mL)、梅氏弧菌(约1()3104cfo/mL)辛辛那提弧菌(约103104cfo/mL)、弗尼斯弧菌(约103104cfti/mL)、海鱼弧菌(约103104cfu/mL)、鲨鱼弧菌(约103104cfU/mL)、霍利斯弧菌(约1()S10、fU/mL)加到每份鱼肉样品中，均匀混合2h后，按照国标GB/T4789.7-2008检验程序，首先在碱性蛋白胨水(APW)中增菌培养18h，然后取l环增菌液划线接种拟态弧菌显色培养基和TCBS平板，37°C培养16h24h，观察拟态弧齒的检出情况。疑似菌落采用法国梅里埃细菌鉴定系统API20E试剂条，结合传统生化方法弧菌鉴定生化管进行鉴定，鉴别典型菌落菌株类型。3.结果及分析拟态弧菌MCCC1H00078纯菌液涂布嗜盐琼脂的计数结果约为1.8xl07cfu/mL，将拟态弧菌MCCC1H00078稀释度为10—410—6的纯菌液污染鱼肉后，增菌检测结果表明，浓度为101cfu/mL103cfb/mL(稀释度10—410—6)在拟态弧菌显色培养基和TCBS平板上都可以检出，2种平板可以达到相同的检测限10、fli/mL，即当样品中带有10、fo/mL浓度的目标菌时，经过前增菌培养，在2种培养基上都可以检出。混合菌液污染样品结果表明拟态弧菌MCCC1H00078浓度为103cfu/mL、104cfb/mL(稀释度1(T3、10—4)的纯菌液混合其他杂菌污染样品后，经过碱性蛋白胨水(APW)增菌，在拟态弧菌显色培养基可以检出拟态弧菌，拟态弧菌呈绿色菌落，其他弧菌呈现黄色菌落；在TCBS也可以检测出拟态弧菌，拟态弧菌呈绿色菌落，但绿色菌落中混有大量副溶血弧菌与创伤弧菌。拟态弧菌显色培养基的特异性要优于TCBS，即当样品中含有103cfo/mL浓度以上拟态弧菌时，经过碱性蛋白胨水(APW)增菌培养，在两种显色培养基上都可以检出，但TCBS平板上绿色菌落中混有大量的副溶血弧菌与创伤弧菌。拟态弧菌显色培养基与TCBS两种培养基相比，拟态弧菌显色培养基比TCBS具有更高的检测效率，拟态弧菌显色培养基检测拟态弧菌省去了TCBS分离培养后的生化试验，縮短检测时间，降低检测成本，减少工作量，可直接用于对拟态弧菌进行分离鉴定。实施例4:本发明所述的拟态弧菌显色培养基检测实际样品中应用1.拟态弧菌显色培养基的配制取酵母膏粉5g、鱼蛋白胨5g、蛋白胨5g、氯化钠10g、柠檬酸钠10g、硫代硫酸钠10g、胆酸钠3g、牛胆粉5g、柠檬酸铁lg、琼脂15g、蒸馏水lOOOmL加在一起并加热搅动，使其溶解，煮沸12min，冷却到5055°C,加入蔗糖20g、纤维二糖20g、阿拉伯糖20g、溴麝香草酚兰0.04g、麝香草酚兰0.04g，震荡摇均，用lmol/LNaOH调pH到8.6士0.2，将培养基倒入平板中，冷却后倒置放入15。C培养箱中备用。2.增菌采集样品鱼类8份、虾9份、贝类5份和鱿鱼7份，先将样品表面进行酒精消毒，然后用剪刀取每份样品25g加入225mL碱性蛋白胨水(APW)增菌液中增菌培养18h。3.接种培养接种环取l环增菌液划线接种拟态弧菌显色培养基平板，37°C培养16h24h，观察记录菌落颜色和形态。4.结果及分析经鉴定，采集的29份实际样品中，只在贝类中检出拟态弧菌1株；拟态弧菌菌落在拟态弧菌显色培养基培养基上呈光滑、凸起、直径l3mm、边缘整齐的绿色或蓝绿色菌落。权利要求1.拟态弧菌显色培养基，其特征在于所述培养基的配方为酵母膏粉5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、柠檬酸钠8～10g、硫代硫酸钠8.5～11g、胆酸钠1～5g、牛胆粉2～7g、蔗糖15～20g、纤维二糖15～20g、阿拉伯糖15～20g、柠檬酸铁1～3g、琼脂12～20g、溴麝香草酚兰0.04g、麝香草酚兰0.04g、蒸馏水1000mL。2.如权利要求1所述的拟态弧菌显色培养基，其特征在于所述培养基的配方为酵母膏粉5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、柠檬酸钠10g、硫代硫酸钠10g、胆酸钠3g、牛胆粉5g、蔗糖20g、纤维二糖20g、阿拉伯糖20g、柠檬酸铁lg、琼脂15g、溴麝香草酚兰0.04g、麝香草酚兰0.04g、蒸馏水1000mL。3.如权利要求1或2所述的拟态弧菌显色培养基，其特征在于所述培养基的pH值为8.09.4。4.如权利要求3所述的拟态弧菌显色培养基，其特征在于所述培养基的pH值为8.6±0.2。全文摘要本发明公开了拟态弧菌显色培养基，其配方为酵母膏粉5g、鱼蛋白胨5g、蛋白胨5g、氯化钠10g、柠檬酸钠8～10g、硫代硫酸钠8.5～11g、胆酸钠1～5g、牛胆粉2～7g、蔗糖15～20g、纤维二糖15～20g、阿拉伯糖15～20g、柠檬酸铁1～3g、琼脂12～20g、溴麝香草酚兰0.04g、麝香草酚兰0.04g、蒸馏水1000mL。本发明根据拟态弧菌的基础营养需求、特殊生态环境、特殊生化反应即酶系统和代谢规律及对特定抑菌物质的耐受性等方面的特点，设计出能够明显区别于其它细菌，特别是其它弧菌和其它常见食品致病菌的拟态弧菌显色培养基，克服了传统培养基选择性差等缺点，可对海产品中的拟态弧菌进行快速检测。文档编号C12R1/63GK101555514SQ20091009854公开日2009年10月14日申请日期2009年5月14日优先权日2009年5月14日发明者申科敏,赵广英申请人:浙江工商大学