专利名称：杂交瘤细胞株及其产生抗广州管圆线虫v期幼虫55kd抗原单克隆抗体的制作方法
杂交瘤细胞株
及其产生抗广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原单克隆抗体 就鄉
本发明涉及一种可产生抗广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原单克 隆抗体的杂交瘤细胞及其产生的抗广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原
单克隆抗体的方法。 萝煮就
广州管圆线虫病(Angiostrongyliasis cantonensis)是指由广 州管圆线虫幼虫在人体内移行，侵入中枢神经系统引起的以急性剧烈 头痛为主要表现的嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎 (Eosinophilicmeningitis or Meningoencephalitis, EM)。至1945
年台湾报道的第一例病例以来，该病陆续在我国大陆报道并呈逐年上 升趋势，随后分别在温州、福建出现集体小范围暴发流行，发病率达 到44.8%。 2003年广州管圆线虫病被卫生部列为新发传染病，但未引 起足够的重视，缺乏对该病系统的认识、高效的检测手段和规范的诊 疗措施。2006年6月北京的局部暴发流行，发病人数之多、涉及范 围之广，给大众敲响了警钟，引起了社会各界人士的普遍关注。随着 人们饮食习惯改变，广州管圆线虫病逐年攀升，己对我国公共卫生和 人民健康造成严重的威胁，使我国政府部门和医疗机构承受巨大的经 济损失与社会舆论压力。
广州管圆线虫病的误诊率高，目前主要靠从病人脑脊液中检测到幼龄 成虫的虫体来确诊。由于该病的临床症状与许多中枢神经紊乱性疾病 很相似，且广州管圆线虫病病原学确诊率又较低(<10%)，给临床诊 断带来很大困难。所以免疫学方法作为辅助诊断手段在广州管圆线虫病的诊断上具有重要价值。但国内至今对该病的诊断还停留在抗体检 测阶段，因存在下列问题①感染后抗体的出现较晚，②完全治愈后 抗体仍会在体内存在较长时间，无法进行现症感染诊断和疗效考核， ③同其它蠕虫感染有较高的交叉反应等，限制了这些免疫诊断方法的 可靠性。
发辦容
本发明的目的在于为克服现有早期诊断广州管圆线虫病技术的不 足而提供一种杂交瘤细胞株及其产生抗广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原单克隆抗体。
为实现上述目的，本发明所提供的可产生抗广州管圆线虫V期幼 虫55 KD抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为 ACV1 ( Angiostrongylus cantonensis V stage larva 1,)。该细胞株已于2009 年4月29日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC一 C200930。
杂交瘤细胞株ACV1产生抗广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原的单 克隆抗体制备方法包括以下步骤
(1) 电渗法分离广州管圆线虫V期幼虫55 KD蛋白；
(2) 以从步骤(1)分离得到的蛋白作为免疫原免疫动物；
(3) 取免疫动物脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细
胞；
(4) 从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物腹水液中分离并纯化 所需单克隆抗体。
杂交瘤细胞株ACV1可产生抗广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原的 单克隆抗体，此抗体可与广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原具有较高 的结合特异性及亲和力，将此单克隆抗体应用于广州管圆线虫循环抗 原水平的检测，提供了早期诊断广州管圆线虫病的方法。
由上述杂交瘤细胞ACV1产生的抗广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗 原单克隆抗体命名为ACV McAb。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为杂交瘤细胞的染色体核型观察结果。
图2为经纯化的杂交瘤细胞ACV1产生的单克隆抗体的SDS-PAGE 检测结果。
图3为纯化的单克隆抗体与广州管圆线虫V期幼虫抗原的结合特 异性的Western Blot检测结果。 ,沐实嚴方义
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 杂交瘤细胞株ACV1及其产生的抗广州管圆线虫V期幼虫55 KD 抗原单克隆抗体的获得
1、 抗原制备从(^^"77ar^3 福寿螺体内分离出广州管 圆线虫III期幼虫，经口感染SD大鼠，21天后从大鼠脑组织中检获 广州管圆线虫V期幼虫，用生理盐水漂洗5次，按常规方法提取广州 管圆线虫V期幼虫抗原，跑12% PAGE胶(不加SDS)，将55 KD大 小蛋白条带切胶后于电压300V条件下电渗纯化1小时，收集上清后 PBS透析24h。用Lowry法测定抗原的蛋白质含量(4.0 mg / ml)，置 —2(TC保存。此外，将鼠血清置于—2CTC保存。
2、 免疫动物
选取6 8周龄雌性BALB/c小鼠(免疫动物还可以为小鼠、大鼠、 兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物)，用200 Pg抗原/只免 疫2个月以上。第一次免疫加福氏完全佐剂(0.1 ml/只)，第二次 以后加福氏不完全佐剂，免疫间隔时间为3周。细胞融合前3天，取 鼠尾静脉血，用间接ELISA法测定效价，选择效价最高的小鼠尾静脉 加强免疫一次。
3、 细胞融合
(1) 词养细胞的制备将一只正常BALB/c小鼠处死，无菌状态 下取出脾脏，去表面包膜及脂肪，剪碎，置于平皿中研磨，加无血清 RPMI 1640培养液制成单细胞悬液，计活细胞数，约为5X10VmL。
(2) 免疫脾细胞的制备将步骤2加强免疫三天后的BALB / c小肪，剪碎，置于平皿
中研磨，加无血清RPMI 1640培养液制成单细胞悬液，计活细胞数， 约为1X108个/mL。
(3) Sp2/0骨髓瘤细胞的处理取指数生长期的Sp2/0细胞，离 心，用无血清RPMI 1640培养液洗一次并悬浮于其中，计活细胞数， 约为2X107/mL。
(4) 免疫脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞的融合将步骤(3)的Sp2/0 骨髓瘤细胞与步骤(2)的免疫脾细胞按l: 5比例混合均匀，离心， 尽量倒净上清；然后在37。C水浴条件下，加入50%聚乙二醇(丽 1450)进行细胞融合；再加入无血清RPMI 1640培养液洗涤，用HAT 选择培养液(向含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中加入IOOX氨 基喋呤储存液(HAT)， Sigma公司)重悬后与步骤(1)的饲养细胞混 合，加入到96孔细胞培养板中，在5% C02孵箱中培养。自第七天 开始观察杂交瘤细胞生长情况，当细胞生长至肉眼可视时，在显微镜 下将HAT选择培养液换成含HT选择培养液(含2XHT的RPMI 1640 培养基)，在C02孵箱中继续培养。约3天后可用ELISA法检测培养 上清中抗体活性的高低，对杂交瘤细胞进行筛选。
4、杂交瘤细胞的筛选
采用ELISA法筛选抗广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原抗体的 杂交瘤细胞，具体方法为
(1)用50 mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)稀释步骤1的抗原至5 u g/L，加入到96孔酶标板中进行包被，每孔IOO ul， 4°C 12 24 小时，用PBS-T缓冲液(80Q mL蒸馏水中溶解8 g NaCl， 0. 2 g KC1， 1. 44 g Na2HP04， 0. 24 g KH2HP04，用HC1 i周节pH至7. 4，然后加lmL Tween-20，用水定容到1 L，室温保存)洗三遍；
(2) 用10%小牛血清进行封闭，每孔IOO ul， 37°C 30分钟， 用PBS-T缓冲液洗三遍；
(3) 向96孔板中添加步骤3的杂交瘤细胞上清，每孔100 u 1， 37°C l小时，用PBS-T缓冲液洗三遍；(4) 向96孔板中添加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠第二抗体， 每孔50ul， 37°C 30分钟，用PBS-T缓冲液洗三遍；
(5) 加碱性磷酸酶底物溶液(0.2 M Tris液50 ml, 0.1 N盐酸 40mL, MgCl2 6H20 0.2 g，左旋咪唑2 mg， lX叠氮钠5mL，调pH 至8.3，加水至IOO mL)， 37。C显色15分钟，加2 N H2S04，终止反
应，测定0D450值，0D450值为阴性对照2. l倍的为阳性杂交瘤细胞。
5、 阳性杂交瘤细胞的克隆化及细胞库的建立
(1) 阳性杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法(K6hler G和C. Milstein. ， 1975， Nature 256:495)对步骤4筛选出的阳性孔的杂 交瘤细胞进行多次亚克隆，使分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞单克隆 化，从而使其能分泌均一的单克隆抗体，同时也避免了不分泌抗体的 杂交瘤细胞过度生长而使分泌抗体的杂交瘤细胞丢失。反复克隆化至 所有单个克隆的阳性率为100%,选取强阳性克隆扩大培养，大量冻 存作为原始细胞库。部分细胞连续传代培养3个月以上，用下述步骤 6的方法检测杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。
(2) 细胞库的建立在对阳性杂交瘤细胞进行克隆化过程中，由 融合细胞、 一次亚克隆、二次亚克隆及体外连续培养3个月以上稳定 分泌抗体的三次亚克隆细胞组成原始细胞库。取原始细胞库中三次亚 克隆的杂交瘤细胞株全面检测，大量培养冻存，建立主细胞库。取主 细胞库的细胞大量培养，经抗体活性及支原体复查合格后，冻存，每 批不少于20管，建成工作细胞库。每次生产时取l管复苏，用于制 备腹水抗体。
6、 杂交瘤细胞的鉴定
(1)抗体分泌稳定性检测对经筛选获得的其中一株强阳性单克 隆细胞株(命名为ACV1)进行扩大培养，取部分细胞用生理盐水调 整浓度为2X10e个/mL，将其接种于小鼠腹腔，接种细胞数为1X106 个/只。约7 10天形成腹水，至腹水增多，腹部特别膨隆时，处死 小鼠，取腹水，离心后取上清并用ELISA法测腹水效价。另取部分细 胞，连续传代培养3个月后，用与上述同样的条件对小鼠进行腹腔接种，取腹水，离心后取上清并测腹水效价，结果二次ELISA测定结果 均达到1:105，表明该强阳性单克隆细胞株ACV1具有较好的抗体分泌 稳定性。
(2) 杂交瘤细胞染色体分析对细胞株ACV1传代培养36 48小 时后加入秋水仙素，继续培养4 6小时后收集细胞，加入已预温至37 。C的0. 075 M KC1溶液悬浮细胞，37匸水浴15 20分钟作低渗处理； 将细胞用甲醇/冰醋固定液三次固定后，悬浮在固定液中，4°C 12 24小时，然后离心，去上清，留少许固定液将细胞悬浮，混匀后滴 在刚从冰水中取出的载玻片上，吹散，通过火焰数次，自然干燥，用 10% Giemsa染色液染色10 20分钟，洗去染液，自然干燥，镜下 观察杂交瘤细胞的染色体核型，显微拍照。杂交瘤细胞的染色体核型 观察结果见图1，杂交瘤细胞ACV1平均染色体数目为102条左右， 接近Sp2/0细胞和脾细胞染色体数目之和(BALB / c小鼠脾细胞染色 体数目为40条，Sp2/0细胞的平均染色体数目为64条左右)，证明 该杂交瘤细胞株是由Sp2/0细胞和小鼠脾细胞融合而来的，且传代后 的杂交瘤细胞呈现相同的染色体检测结果，证明杂交瘤细胞在传代过 程中携带抗体染色体产生基因，没有丧失抗体分泌能力，并能将这种 能力遗传给予细胞。
(3) 抗体亚型鉴定采用单克隆抗体亚型检测试盒(ImmunoType TM Kit, Sigma)剂对杂交瘤细胞培养上清进行免疫球蛋白亚型的鉴定， 具体方法为用PBS以1:1000比例稀释各类抗体(按常规方法制备 的抗小鼠IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgA及IgM)，然后用稀释抗 体包被96孔酶标板(每孔IOO ul，每类抗体两个孔)，37'C温育1 小时后，弃包被液，洗涤3次，按IOO lU/孔的量加入单克隆细胞 株ACV1的培养上清，室温温育1小时后洗涤3次，按0. lmL /孔的 量加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG (江苏碧云天公司)，室温 温育30分钟后，洗涤3次，按IOO "l/孔的量加入辣根过氧化物 酶底物反应液(lmg/ml TMB)，室温10 15分钟，出现蓝色即为阳性 结果，最后按50 ul/孔的量加入3 N NaOH终止反应。结果，杂交瘤细胞ACV1分泌的抗体为IgG2a亚类。
7、单克隆细胞株ACV1的抗体的大量制备及特异性鉴定
(1) 获取抗体腹水选取20 22 g BALB/c小鼠(温州医学院实 验动物中心提供)，雌性，腹腔注射降植垸，0.5 ml /只； 一周后， 将培养的对数生长期的抗体阳性杂交瘤细胞悬液离心，沉淀细胞悬于 无血清RPMI 1640，重复离心洗涤2次，重悬于无血清RPMI 1640， 每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1X107 /只，同时对侧再注入降植垸与 不完全福氏佐剂的等体积混合物0.5 ml /只。7 10天后待小鼠腹 部显著膨隆后，收集腹水；将收集的腹水，12 000 rpm离心30秒， 去除底部沉淀和上层油脂，收集中段液体，用ELISA法测腹水效价， 结果符合要求，分装，一2(TC冻存备用。
(2) 抗体的亲和层析纯化用Pharmacia Biotech.公司的AKTA FPLC蛋白层析仪对经初步纯化的单克隆抗体进行亲和纯化，具体方 法为先用3倍柱体积的0.02 M PBS(pH 7.0)冲洗HiTrap Protein G 层析柱(lmL， Amersham公司)填料中的乙醇，然后用5倍柱体积的 0.02 M PBS (pH 7.0)平衡层析柱，将2 mL经硫酸铵初步纯化的抗 体溶液加入层析柱，用5倍柱体积的0. 02 M PBS (pH 7. 0)冲洗层 析柱，收集流出液，当紫外线检测器出现IgG洗脱峰时，迅速用已加 入60 100 u 1 0.05 M Tris-HCl缓冲液(pH9.5)的离心管收集， 最后用5倍体积的0.02M PBS (pH7. 0)冲洗平衡层析柱，收集流出 液，将纯化的抗体分装，一2(TC保存。
(3)抗体纯度及浓度测定分别将单克隆抗体腹水及经Protein G-S印harose亲和层析纯化后的抗体按常规方法进行SDS-PAGE电泳检 测，检测结果见图2 (泳道M:低分子量蛋白标准，泳道ACV:纯化 单抗)，结果经亲和层析纯化后的抗体的电泳图谱呈现二条区带，为 抗体的轻链和重链，分子量约为24KD和53KD。经扫描测定，经亲和 层析后的抗体纯度达98%以上，获得了纯度较高的单克隆抗体。将20 mL单克隆腹水抗体用上述方法提纯后，用PBS调整至原体积，以PBS
为空白对照，测定抗体溶液的0D450值，计算出抗体浓度约为10mg/mL。
(4)单克隆抗体特异性鉴定用免疫印迹反应(Western Blot) 检测上述纯化的单克隆抗体与广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原的结 合特异性。将广州管圆线虫V期幼虫抗原、日本血吸虫虫卵抗原、猪 囊尾蚴抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和旋毛虫抗原进行常规SDS-PAGE 后，转移到硝酸纤维素膜上，以上述纯化的单克隆抗体为一抗、HRP 标记的羊抗鼠IgG为二抗进行免疫印迹反应，具体方法可参考文献 (Sambrook， J.，等人，分子克隆实验指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版，888页)，结果见图3(泳道1:广州管 圆线虫V期幼虫抗原，泳道2:日本血吸虫虫卵抗原，泳道3:猪囊
尾蚴抗原，泳道4:卫氏并殖吸虫成虫抗原，泳道5:旋毛虫抗原)，
表明所制备的单克隆抗体只与广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原特异 结合，而不与日本血吸虫抗原、卫氏并殖吸虫抗原、猪囊尾蚴抗原和 旋毛虫抗原结合。
上述实验结果表明本发明的单克隆细胞株ACV1产生的单克隆抗 体具有较好的结合特异性，将该抗体命名为ACV McAb。
8、 ACV McAb与广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原的亲和力测定 采用非竞争性ELISA法测定ACV McAb与广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原的亲和力，具体方法为用0.05 mol/L、 pH 9. 6碳酸盐缓冲 液将广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原稀释至浓度分别为1000、 500、 250、 125 ng/mL，然后加入酶标板，100 y 1 /孑L， 4"C包被12 24 小时；弃去抗原溶液，用PBS (含0.05。/。Tween 20)洗板3次；每孔 加入150 ul含l^牛血清白蛋白的PBS， 37。C封闭0.5小时，加入 系列稀释的纯化单克隆抗体ACV McAb (从1:1000开始按102倍比进 行稀释)，100 ul/孔，37'C孵育1小时，洗板3次；加入HRP标记 的二抗羊抗鼠IgG(1:2000)， 100 u 1 /孔，37。C孵育0. 5小时，洗 板3次；加入底物lmg / mL TMB，用底物缓冲液(O. 01%&02)稀释，100 u 1 /孔，室温避光放置5 10分钟；最后用2mol / L H2S04终止反应，测定各孔450 nm的^值，绘制测定曲线4条，读出每一包被抗原的 最大吸光度"值)l / 2所对应的抗体浓度，利用Beatty计算公式 (Beatty 瓜 Beatty BG, Vlahos WG, " <3丄 Measurement of monoelonal antibody by non-competitive enzyme immunoassay[J]. J Immunol Med， 1987, 100(1-2):173-178.)确 定纯化后的ACV McAb的亲和常数K值，结果K值为10.26X109 mol-、 与广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原也具有较高的亲和力。
上述实施例中的检测结果表明本发明杂交瘤细胞株ACV1产生的 单克隆抗体ACV McAb与广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原具有较高 的结合特异性及亲和力。
广州管圆线虫循环抗原水平的检测
现用ELISA法用杂交瘤细胞株ACV1产生的单克隆抗体ACV McAb 对广州管圆线虫循环抗原水平进行检测，包括以下步骤
(1) 包被酶标板用50 mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)将用常规方法 制备的抗广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗原多抗血清稀释至浓度为1 mg / mL，每孔100 ix 1， 4。C放置12 24小时，然后用10 mM PBS-0. 05 %Tween 20 (pH7. 4)洗三遍；
(2) 封闭己包被的酶标板用10%的小牛血清封闭包被的酶联 板，100 yl/孔，37。C保温30分钟；
(3) 在酶标板上分别加入病人血清或广州管圆线虫感染小鼠血清 100 u 1 /孔，37。C保温1小时，然后用10 mM PBS-0. 05%Tween 20 (pH7.4)洗三遍；
(4) 在酶标板上加入浓度为0. 2 mg / L单克隆抗体ACV McAb， 100 li 1 /孑L， 37。C保温1小时，然后用10 mM PBS-O. 05%Tween 20 (pH7. 4)洗三遍;
(5) 加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG， 50 ul/ L， 37。C保 温30分钟，然后用10 mM PBS-0, 05%Tween 20 (pH7.4)洗三遍;
(6) 加辣根过氧化物酶底物溶液(lmg / mL TMB) ，50 u 1 /孔，37 。C显色15分钟；(7) 加2 N H2S04 50 u 1 /孔终止反应；
(8) 测定0D450值。
步骤(5)中的二抗也可以是过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记的抗
鼠或抗兔抗抗体。
结果经统计学分析(1)广州管圆线虫感染小鼠血清均为阳性， 与正常组鼠血清相比具有显著性差异(尸<0. 01); (2)检测病人血清， 通过与病原学检査、临床症状及发病史进行比较，发现病原学阳性或 有典型广州管圆线虫病临床症状患者血清中的广州管圆线虫循环抗 原水平均较正常组要高，差异具有统计学意义(尸<0.01)。表明本
发明杂交瘤细胞株ACV1产生的单克隆抗体ACV McAb可用于人血清广 州管圆线虫循环抗原水平的检测。
广州管圆线虫循环抗原的免疫检测方法还可为放射免疫法、酶联 免疫吸附法、夹心式免疫法、免疫沉淀或免疫荧光等。
上述检测方法中，待测样品的选择可以是来自患者的血清和脑脊液。
所述单克隆抗体与样品发生相互作用的条件，可依据检测方法进 行确定。
本领域技术人员知晓，对于固相反应而言，可以将本发明所述单 克隆抗体固定于固相载体，反应通常在室温下进行，检测过程中需要 洗涤不与本发明所述单克隆抗体结合的样品的步骤。
对于液相反应而言，通常可以向处在特定缓冲体系中的待测样品 中直接加入本发明的单克隆抗体，然后在适于抗原抗体发生相互作用 的温度下(如室温)进行反应。
所述检测方法中第二抗体的选择取决于本发明单克隆抗体的来 源。本领域技术人员知晓如何根据单克隆抗体的来源选择相应的第二 抗体。所述第二抗体可以是放射性同位素标记的，包括但不限于使用
选自32P、 1251、 S、 W等；也可以是非放射性同位素标记的，包括 但不限于使用选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、链霉亲 和素等标记。本发明所述检测方法中使用的检测剂，取决于检测过程使用的第二抗体的标记物，本领域技术人员知晓如何选择合适的检测 试剂。
上述检测方法中的反应条件及试剂均可按照常规方法进行选择。 本发明还提供了一种检测人广州管圆线虫循环抗原水平的试剂
本发明所提供的检测人广州管圆线虫循环抗原水平的试剂盒，可
包括由上述杂交瘤细胞株ACV1产生的抗广州管圆线虫V期幼虫55 KD 抗原的单克隆抗体。
所述试剂盒还可包括与上述杂交瘤细胞株ACV1产生的抗广州管 圆线虫V期幼虫55 KD蛋白的单克隆抗体发生相互作用的第二抗体。
所述第二抗体可为羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG等。
所述第二抗体可为经过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶等标记酶 标记的，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或 过碘酸法交联在抗体上。
试剂盒中还可包括显色液A液和显色液B液，所述显色液A液为 过氧化氢或过氧化脲溶液，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯 胺溶液。
为方便使用，所述试剂盒还可包括检测用的洗涤液，如PBST等常 规的洗涤试剂；封闭液，如10%小牛血清等；抗体稀释液，如50 mM 碳酸盐缓冲液(pH 9.5)等。
权利要求
1、一种可产生抗广州管圆线虫V期幼虫55KD抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于所述杂交瘤细胞株为ACV1。
2、 一种根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株ACV1产生抗广州管 圆线虫V期幼虫55 KD抗原的单克隆抗体的制备方法，其特征在于包 括以下步骤(1) 电渗法分离广州管圆线虫V期幼虫55 KD蛋白；(2) 以从步骤(1)分离得到的蛋白作为免疫原免疫动物；(3) 取免疫动物脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞；(4) 从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物腹水液中分离并纯化 所需单克隆抗体。
3、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:继续用Protein G-S印harose亲和层析法对步骤(4)获得的单克隆抗体进行纯化。
4、 一种检测广州管圆线虫循环抗原水平的试剂盒，其特征在于 包括由杂交瘤细胞株ACV1产生的抗广州管圆线虫V期幼虫55 KD抗 原的单克隆抗体、与杂交瘤细胞株ACV1产生的抗广州管圆线虫V期 幼虫55 KD蛋白的单克隆抗体发生相互作用的第二抗体，所述第二抗 体可为羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG等，试剂盒中还可包括显色液A液和 显色液B液。
5、根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述第二抗 体可为经过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶等标记酶标记的，优选为 辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在 抗体上；所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲溶液，所述显色液B 液为邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液。
全文摘要
本发明公开了杂交瘤细胞株ACV1及其抗广州管圆线虫V期幼虫55KD抗原的单克隆抗体ACV McAb。该抗体可与广州管圆线虫V期幼虫55KD抗原特异结合。该抗体制备方法简单，可由杂交瘤细胞株ACV1直接分泌产生。此抗体可与广州管圆线虫V期幼虫55KD抗原具有较高的结合特异性及亲和力，将此单克隆抗体应用于广州管圆线虫循环抗原水平的检测，提供了早期诊断广州管圆线虫病的方法。
文档编号C12N5/20GK101654668SQ20091010041
公开日2010年2月24日 申请日期2009年6月29日 优先权日2009年6月29日
发明者李江辉, 潘长旺, 昕 胡, 峰 谭 申请人:温州医学院