专利名称：微生物在线观测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及极端高压环境下微生物的显微观测装置，特别涉及海洋生物在 高静水压等非生物生态因子条件下的在线显微观测装置。
背景技术：
海洋微生物资源的研究与开发是本世纪生物技术的主题之一，处于高压和
低温的深海极端环境下的微生物研究更是其中的热点。1949年，Zobell和 Johnson首先提出〃嗜压生物，bar叩hile〃概念(此后也称piezophile)，并于1957 年通过深海沉积物的微生物混合培养，获得了细菌嗜压生长的证据。1979年， Yayano首次报道了嗜压生物的纯培养。在20世纪80年代以来，以高压分离和 培养技术从深海沉积物中分离纯化并培细菌，结果表明它们通常均具有嗜压或 耐压生长压力的特性，证实压力为海洋生物主要的非生物因子。此外，海洋环 境的非生物因子还包括光照、温度、盐度、各种溶解气体和悬浮物质等，它们 对海洋生物的分布、生长、繁殖和生产力等方面有重要的影响。
鉴于深海采样技术在高压密封、负压密封、污染控制、防腐蚀、取样观察 等关键技术已经基本成熟，现有的仪器或器材在到达预定深度再返回陆上实验 室而进行的探测或采样所得信息已能保证准确无误。国内最新的模拟高压极端 环境的装置或设备，如中国专利CN1559659A公开的一种串联式极端环境模拟流 动反应装置可以实现实验室内模拟高压极端环境条件，但这些设备无法直接用 肉眼观察微生物的生长、发育、分化过程(对小型底栖生物而言，其大小在80 200um范围)，除非结束实验，泄压后，抽取部分样品放在显微镜下进行观察。 显然，这无法满足高压微生物的在连续高压环境中的培养和实时在线观察。因 此，结合显微成像技术，研究一套能与实验室内极端环境模拟流动反应装置相 配套的在线微生物观测装置，既可以单独使用，也可以串联接入极端环境流动 系统，从而使装置既可以维持高压等极端环境条件，同时实现微生物的同步培 养和实时观测，在线记录微生物的生长、发育、繁殖等新陈代谢过程，对研究 海洋生物具有重要意义。目前，相关的设备中，在高压条件下进行微生物在线 显微观测的装置还没有出现。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的模拟极端压力条件实验过程中微生物培 养物的不可观测问题，而提供一种模拟深海高静水压力条件下的微生物的在线 显微观测装置。
本发明的发明构思是结合显微观察技术和高压负密封技术，使本发明观 测器的壁的材料和厚度、壁上开的观测孔、通光孔的大小以及内设透明装置的
材料和厚度， 一方面确保可以承受安全压力范围为0 60MPa，另一方面，可使 观测室与显微镜物镜间的距离在显微镜物镜的工作距离内(如PlanN IOX，其 物镜工作距离为10.6mm)，从而使本发明符合显微观察原理，达到实时显微观 测微生物在多种环境条件下的生长、发育、繁殖等新陈代谢的目的。将本发明 观测装置接入极端环境模拟流动反应装置，或采用高压注射泵打压注入培养液， 并使系统内培养液模拟海洋微生物原始生活环境中的高静水压力和低氧、高盐 条件等各种非生物生态因子，通过阀门控制实现系统内本发明观测装置内各成 分的流动更新。微生物样品可以生活在本发明观测器的培养室内，由于观测室 和培养室连通，微生物进入观测室时，可以通过观测室对微生物样品进行观测 或显微摄像。
本发明实现其发明目的所采用的技术方案是该微生物在线观测装置主要 包括密封的观测器，所述观测器内设有培养室和观测室，所述培养室的一端与 过渡接头密封安装在一起，所述培养室的另一端与观测室连通，在所述观测器 的壁上与观测室相对的位置开有观测孔，所述观测孔与观测室连通，所述观测 孔内设有第一透明装置，所述第一透明装置与观测室密封安装在一起。
进一步地，本发明所述观测器的壁上与观测孔相对的另一侧还开有通光孔， 所述通光孔与观测室连通，所述通光孔内设有第二透明装置，所述第二透明装 置与观测室密封安装在一起。
进一步地，本发明所述培养室与观测室的连接处有一收縮口 。
进一步地，本发明所述培养室有两个以上。
进一步地，本发明还包括压力开关，所述压力开关通过耐压管与过渡接头 连接。
与现有技术相比，本发明的有益效果是 (1)本发明装置可以承受最高60Mpa的安全压力，在0 60MPa范围内，
通过高压注射泵可以进行快速或慢速加、减压控制，通过观测室可实时观测不同压力条件下的微生物活动，也可以在恒压状态下进行微生物显微观察。
(2) 本发明装置观测室的设计符合显微观测原理，整个装置可直接放置在 显微载物台上观察，也可用于荧光显微观测，实现活体微生物的在线显微观测。 如果显微镜配置显微摄像系统，可对研究对象实时拍照和摄像，通过显微成像 后，放大倍数为1倍 100倍。
(3) 本发明装置可以单独进行高压厌氧微生物培养和显微观测，也可以通 过耐压管和压力开关连接高压流动系统(0 60Mpa范围内)，通过更新培养液， 实现长时间连续培养和在线显微观测。整套装置连接方便，操作简单，适用面 广。
图1是本发明微生物在线观测装置的外部结构示意图2是本发明微生物在线观测装置的内部结构剖视示意图3是图2的A-A剖视图4是将本发明微生物在线观测装置接入到微生物培养高压流动系统中的 结构示意图中l.压力开关，2.耐压管，3.过渡接头，4.培养室，5.观测室，6.压 套，7.密封装置，81.第一透明装置，82.第二透明装置，9.观测器的壁，10.观 测器，11.培养液箱，12.高压注射泵，13.压力传感器，14.减压阀，15.废 液瓶，16.旋钮开关，17.培养室和观测室之间连接处的收縮口， 18.观测孔，19. 通光孔。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
如图1、图2和图3所示，本发明微生物在线观测装置包括有观测器10和 压力开关1，观测器10内设有培养室4和观测室5。培养室4的一端与过渡接 头3密封安装在一起，培养室4的另一端与观测室5连通。在观测器10的壁9 上与观测室5相对的位置开有观测孔18，观测孔18与观测室5连通。观测孔 18内还安装有第一透明装置81，本发明的第一透明装置81可采用耐腐蚀、耐 高压材料的刚玉制作。可使用空心的压套6固定第一透明装置81并用空心/〇 形密封圈作为密封装置7将第一透明装置81与观测室5密封安装在一起。经过密封和固定的观测室5的密封性和透光性良好，可以承受的安全压力范围为0 60MPa。由于观测室5和培养室4连通，微生物可进入观测室5，观察者使用体 视镜或显微镜，使物镜对准观测孔18，透过第一透明装置81对观测室5内的微 生物进行观测。
为使观察者能够观察到观测室5内的微生物，可如图1至图3所示，在观 测器10的壁9上开有通光孔19，该通光孔19位于与观测孔18相对的另一侧壁 上。与观测孔18—样，可在通光孔19内也设有第二透明装置82，第二透明装 置82与观测室5密封安装在一起。第二透明装置82可也与第一透明装置81 — 样，采用耐腐蚀、耐高压材料的刚玉制作。由于通光孔19和观测孔18在观测 室5的两侧且位置相对，使得体视镜或显微镜下光源可通过通光孔19和观测孔 18进入观测室5内，并在通光孔19、观测室5和观测孔18之间形成一光路以 便有足够的光线能够观察到观测室5的微生物。当然，如果在观测室5内或在 观测孔18设有照明装置，则可以不必设置通光孔19。
如图1至3所示，本发明可在观测室5的两端对称地各设有一个培养室4， 两个培养室4的其中一端均与观测室5连通，使得各培养室4的微生物可以进 入到观测室5内。两个培养室4的另一端则由过渡接头3密封。由于培养室4、 观测室5均通过密封装置7进行密封，从而使得整个观测器10形成一个密封的 结构。本发明的培养室4可以有两个以上，它们可分布在观测室5的四周，并 分别与观测室5连通。
需要说明的是，培养室4与观测室5之间的连接处有一收縮口 17，设置该 收縮口 17的目的是为了防止饵料等除了微生物以外的悬浮物颗粒也进入到观测 室5，以避免这些悬浮物颗粒干扰对微生物的观察，从而提高观察的准确性。
本发明装置可以单独进行厌氧微生物培养和观测；也可以接入微生物培养 高压流动系统，由该高压流动系统供给新的营养液，对同一样品进行长期在线 显微观测。
若要将本发明装置接入到微生物培养高压流动系统中，则如图1至图4所 示，可将本发明装置的培养室4上的过渡接头3通过耐压管2与压力开关1连 接。压力开关1可以控制观测器10内的压力，用高压注射泵12加压后，压力 开关1关闭后整个本发明装置处于高压密封状态，则可单独进行厌氧微生物在 恒压状态下的培养和观察实验。如果本发明装置的观测室5只连接有一个培养 室4，为将本发明装置接入到微生物培养高压流动系统中，则可在观测室5上增设一个培养液出口，该培养液出口与过渡接头密封安装在一起，并且该过渡接
头通过耐压管与压力开关连接，使得培养液可动态流经由培养室4和观测室5。 如图4所示，将本发明观测装置接入外部微生物培养高压流动系统后，整 个系统包括培养液箱ll，高压注射泵12、压力传感器13，减压阀14和废液瓶 15，本发明的观测器IO，观测器10的左、右两端的压力开关l。其中，本发明 的观测器10 —端的压力开关1与高压注射泵12连接，观测器10另一端的压力 开关1与减压阀14连接。高压注射泵12可以为手动快速高压注射泵或高压恒 流泵，用以实现整个系统的加压或泄压，观测器10两端的压力开关1控制观测 器10内的压力，观测器10右边的压力开关1还可连接第二个压力开关以用于 连接其他外部设备。
以下介绍本发明装置的使用过程。
实验室内连续进行加压试验打开过渡接头3，将适量样品装入观测器10 的两个培养室4和观测室5，本发明整个装置连接好并保证密封良好。将本发明 装置接入微生物培养高压流动系统中，将培养液箱ll的内部预先清洗千净，并 装入试验所需培养液，打开旋钮开关16，高压注射泵12加入培养液，关闭旋钮 开关16和减压阀14，打开压力传感器13和观测器10两端的压力开关1，根据 试验方案采用快速加压或缓慢加压到实验所需要的压力。然后，将观测器10放 置在体视镜或显微镜的载物台上，可以透过观测孔18内的第一透明装置81观 察观测室5内的同一微生物样品在不同压力条件下的生理活动，若显微镜配备 有摄像系统，则可以实时拍照和摄像。
为了达到样品在高压状态下的长时间的观察需要，需要及时更新培养液， 此时，需缓慢打开减压阀14的同时通过高压注射泵12缓慢加压，也可以直接 用恒流泵，设定每分钟流量，如0.1ml/min，此流量以保证样品基本不会受到扰 动而同时又添加了新的培养液，从而达到对同一样品的连续观测，同时维持装 置内压力水平基本保持不变。
实验室内的减压实验加压过程同以上连续加压实验，采用快速加压至实 验所需压力，然后快速或缓慢打开减压阀14实现减压。根据所观察样品的大小， 控制减压阀14的流量大小，保证样品基本不会受到扰动而达到对同一样品的连 续观测，同时达到装置内压力水平缓慢降低到所需水平。实验过程中可以通过 观测孔18对观测室5内的微生物在显微镜下实时拍照和摄像。
通过本发明装置所实现的压力控制和培养液中的PH、盐度和溶氧等环境参数的改变，实时显微观察和摄像，研究不同生物在高压、高盐、低氧、低营养 等不同条件下微生物生理活动的适应机制。
如上所述，观测器10的壁9、第一透明装置81、第二透明装置82、耐压管 2、压力开关1和过渡接头3等部件可采用耐腐蚀耐高压材料制成。培养室4内 可以投放饵料等生物长期生活必需的悬浮物颗粒。组装后的观测器10的密封性 能可以达到最大60MPa的安全压力，观测室5的透光性90%在以上。观测器10 的耐压性能与所选用的材料和观测器10的壁9的厚度、第一透明装置81和第 二透明装置82的大小及厚度有关，本领域技术人员可根据本发明观测装置所需 要承受的具体压力进行相应的选择:如果观测器10所选用的材料的耐压性能好， 则观测器10的壁9的厚度可以薄些；如果观测器10所选用的材料的耐压性能 低些，则观测器10的壁9的厚度可以厚些，例如，当本发明观测器10使用耐 高压、耐腐蚀的不锈钢材料时，观测器10的壁9的厚度可约为9 mm，培养室4 高度为20mm，观测室5高度为3mm，第一透明装置81和第二透明装置82可采 用①16X8mm的刚玉，整个观测器10的高度约为38iran，适合放在体视镜或长工 作距离的显微镜(物镜工作距离为10.6mm)的载物台上，物镜距离观测室5底 部的最小距离约为10. 4mm，通过观测室5可以进行显微观测。当然，观测器10 的整体高度不是越厚越好，观测器10的整体高度应小于显微镜物镜和载物台间 的最大距离，否则观测器10将无法放入载物台。若显微镜配备有摄像系统，则 可以实时显微摄像。本发明整个装置通过压力开关1接入微生物培养高压流动 系统，构成微生物流动培养高压在线观测系统。通过使用本发明装置，可以实 现在实验室内对同一高压微生物样品的长期在线显微观测。
权利要求
1.一种微生物在线观测装置，其特征在于它包括密封的观测器(10)，所述观测器(10)内设有培养室(4)和观测室(5)，所述培养室(4)的一端与过渡接头(3)密封安装在一起，所述培养室(4)的另一端与观测室(5)连通，在所述观测器(10)的壁(9)上与观测室(5)相对的位置开有观测孔(18)，所述观测孔(18)与观测室(5)连通，所述观测孔(18)内设有第一透明装置(81)，所述第一透明装置(8)与观测室(5)密封安装在一起。
2. 根据权利要求l所述的微生物在线观测装置，其特征在于所述观测器 (10)的壁(9)上与观测孔(18)相对的另一侧还开有通光孔(19)，所述通光孔(19)与观测室(5)连通，所述通光孔(19)内设有第二透明装置(82)， 所述第二透明装置(82)与观测室(5)密封安装在一起。
3. 根据权利要求1所述的微生物在线观测装置，其特征在于所述培养室 (4)与观测室(5)的连接处有一收縮口 (17)。
4. 根据权利要求1至3中任何一项所述的微生物在线观测装置，其特征在 于所述培养室(4)有两个以上。
5. 根据权利要求1所述的微生物在线观测装置，其特征在于它还包括压 力开关(1)，所述压力开关(1)通过耐压管(2)与过渡接头(3)连接。
全文摘要
本发明公开了一种可模拟高压极端环境条件下的微生物在线观测装置，它主要包括密封的观测器，观测器内设有培养室和观测室，培养室的一端与过渡接头密封安装在一起，培养室的另一端与观测室连通，在观测器的壁上与观测室相对的位置开有观测孔，观测孔与观测室连通，观测孔内设有第一透明装置，第一透明装置与观测室密封安装在一起。本发明连接方便，操作简单，适用面较广，不仅可以单独进行高压厌氧微生物培养和实验室内对高压微生物的实时在线观测，也可以通过耐压管和压力开关连接高压流动系统实现长时间连续培养和在线显微观测。
文档编号C12M1/34GK101624567SQ200910102130
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月13日 优先权日2009年8月13日
发明者叶树明, 楼凯凯, 王可成, 罗建超 申请人:浙江大学