专利名称：光学纯n-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物催化技术领域和药物合成领域，具体涉及一种光学纯 1^-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸的制备方法。
背景技术：
人的a-凝血酶是一个类似胰岛素的丝氨酸蛋白，它包括两个多肽链A (含有36个氨基酸残基)和B ( 259个氨基酸残基)，在生物体系起到凝 血作用。凝血酶发挥凝血作用，通常有两条途径内源激活途径和外源激 活途径。外源激活途径是在组织损伤时，产生凝血素，激活凝血酶原酶， 最终导致形成凝血酶；内源激活途径是由于生理平衡被打石皮，激活凝血因 子，最终形成凝血酶。这两种途径都是阶梯式的活化酶原，再聚集于产生 凝血酶这一点。凝血酶使纤维蛋白原交联形成纤维蛋白，它再与激活的凝 血因子交联，最后形成血块。这一过程又会加强血小板的聚集，正反馈这 个凝血过程，加速交联作用。在正常的生理条件下，内源激活的凝血系统 被抗凝血系统和纤维蛋白溶解系统平衡。但当病原诱发破坏系统平衡时， 抗凝系统处于主导，导致出血；凝血系统主导，血液流通的管路就会形成 血栓及其一 系列并发症，这些是心脑血管病的引发因素。
凝血酶处于凝血交联反应的最后阶段，当凝血酶抑制剂以一定的比例 与人的a-凝血酶的一个或所有的架构域相作用，从而使凝血酶丧失结合底 物的能力，抑制凝血酶的催化活力，这样就阻断纤维蛋白的形成，阻止凝 血酶催化的止血反应及凝血酶诱导的血小板激活反应，达到抗凝抗栓的目 的。
临床使用的凝血酶抑制剂有低分子量的肝素和华法令，^f旦他们存在许 多不足之处。低分子量的肝素延长治疗导致发生骨质疏松症的危险性增 加，还可以引起"肝素诱导性血小板减少"，肝素依赖于内源性凝血酶抑 制剂抗凝血酶血浆水平，它不能使凝血块结合的凝血酶失活。口服抗凝剂 如华法令( 一种维生素K拮抗剂)可有效减少大手术后的深部静脉血栓形成，然而它有导致严重出血的危险性，需要的频繁的实验室监测控制。
目前，现有的低分子量凝血酶抑制剂包括低分子肽型、氨基酸型和肽 类似物型凝血酶抑制剂，这几类化合物的分子都具有一至四个肽键。
Claesson在Blood Coagul, Fibrinol. ( 1994 ) 5，411中介绍了低分子量凝血酶 抑制剂的早期研制。作为吗啉酮类凝血酶抑制剂的母体中心结构，不同构 型的N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸，其对凝血酶的抑制活性明显的表现出差 异。A. Dahlgren等人在Bioorg. Med. Chem. 10 (2002) 1829-1839中报道了 如式(III)所示的(R)-吗啉酮凝血酶抑制剂和(S)-吗啉酮凝血酶抑制剂，其合 成方法是由光学纯底物出发，得到光学纯目标产物，研究显示，(R)-N-二 苯基曱基取代的吗啉酮凝血酶抑制剂抑制活性远大于(S)-N-二苯基甲基取 代的吗啉酮凝血酶抑制剂。相反的，Jonas W.在J. Med. Chem. ( 2003 ) ， 46, 3985-4001的报道中认为(S)-N-(2,5-二曱氧基)苯磺酰胺取代的吗啉酮凝血 酶抑制剂抑制活性是很高的。可见，吗啉酮类的构型与其凝血酶抑制剂抑 制活性有很大的关系，研究制备特定构型的吗啉酮类凝血酶抑制剂中间体 的方法具有重大的意义。
NH
(III)
发明内容
本发明提供了一种光学纯N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸的制备方法，利用 不同脂肪酶的催化选择性，通过拆分外消旋的N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯 底物，可以方便地制备(R)- N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸和(S)-N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸，为(R)-吗啉酮类凝血酶抑制剂和(S)-吗啉酮类凝血酶抑制剂的 制备提供了 一条可行的途径。
一种光学纯N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸的制备方法，包括如下步骤 以脂肪酶为催化剂，在水/有机溶剂体系中，水解拆分外消旋的式(I )
5所示的N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯底物，经后处理制得式(II )所示的(R)->^-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸或(8)->1-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸；
<formula>formula see original document page 6</formula>
其中，所述的R为二苯曱基、(3，,4，-二甲氧基)千基、(4，-甲氧基)节基、 (4，-氯)苄基、(4，-二甲胺基)爷基、苯乙基、苄基、苯基、(2，,5，-二甲氧基)-苯磺酰胺基、辛基、异丙基、乙基或曱基。
所述的&为Q ~ C18的烷基或d ~ C18的烯基，优选Q ~ C8的烷基或 C广Q的烯基，更优选辛基、丁基、乙基、甲基或乙烯基。
本发明可以使用固定化的脂肪酶，也可以使用游离脂肪酶。
作为优选，所述的脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶(CAL-B: Candida antarctica lipase B )或固定4匕米赫毛霉月旨肪酶(Lipozyme immobilized from Mucormiehei)时，在7jc/有机溶剂体系中，水解拆分外消旋的上述式(I ) 所示的N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯底物，经后处理制得上述式(II )所示 的(8)-1^-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸。
所述的脂肪酶为褶铍,i丝酵母脂肪酶(CRL: Candidarugosalipase) 或圆柱状假丝酵母脂肪酶(CCL: lipase from Candida cylindracea)时，在 水/有机溶剂体系中，水解拆分外消旋的上述式(I )所示的N-取代-吗啉 -3-酮-2-乙酸酯底物，经后处理制得上述式(II )所示的(R)-N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸。
所述的式(I )所示的N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯在水/有机溶剂体系 中的浓度为5~100g/L;过高的底物浓度容易导致反应体系呈现非均相态 而影响拆分的结果。
由于过高的脂肪酶浓度并不能进一步提高酶促反应活性，却会相应增 加反应原料的消耗成本，因此从节约成本的角度考虑，所述的脂肪酶在水 /有机溶剂体系中的浓度优选为5 ~ 50g/L。
所述的水解拆分最好是在转速为100~200r/min的摇床中进行，反应 温度为5 60。C，反应时间为1~50小时；优选反应温度为10~30°C,反应时间为1 50小时。该优选的反应温度可以维持酶更高的水解活性，另
从而获得最好的拆分结果。
本发明的水解拆分反应对压强没有特别的要求，在常压下进行即可。 所述的后处理为在水解拆分结束后，离心去除脂肪酶，滤液用饱和 NaHCOr乙酸乙酯萃取，旋干后得到光学纯(R)- N-取代-吗啉-3-S同-2-乙酸 或(S)- N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸。
所述的水/有机溶剂体系即为水和有才几溶剂的混合物，其中有机溶剂可 以选用本领域通用的亲水性的有机溶剂，如二曱基亚砜、N，N-二曱基甲酰 胺、二氧六环、乙腈、丙酮、叔戊醇中的一种，也可以选用本领域通用的 疏水性的有机溶剂，如甲基叔丁基醚、二异丙基醚、乙醚、丁醚、苯曱醚、 苯醚、正己烷、异辛烷、环己烷、曱苯、二氯曱烷中的一种，优选疏水性 的曱基叔丁基醚、二异丙基醚、苯曱醚或正己烷。疏水性有机溶剂由于具 有较高的LogP值，极性弱，不会像强极性溶剂一样容易剥夺酶分子表面 的必需水，因此，优选的非极性有机溶剂(即疏水性有机溶剂)与水组成 的体系中酶的活性更容易得到维持，从而保证好的拆分效果，而且体系中 的脂肪酶可以回收重复利用，如使用固定化脂肪酶，其重复使用次数可以 达到10次。
所述的7jC/有才几溶剂体系中水的体积百分含量为0.5% ~ 100%，优选为 0.5% ~ 20%。由于水解反应中水M应原料之一，水含量过高容易导致水 解反应过快，从而使得(11)->^取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯和(S)-N-取代-吗啉 -3-酮-2-乙酸酯两种底物都迅速水解，拆分效果较差。而在具有较高有机 溶剂浓度的水/有机溶剂体系中，有机溶剂的加入一定程度上抑制了酶的水 解催化活性，此时(R)-N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯和(S)-N-取代-吗啉-3-酮 -2-乙酸酯两种底物在酶催化立体空腔中不同的结合位点将决定其水解活 性的差异，从而使得(R)-N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯和(S)-N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯两种底物得以拆分开来。
本发明的反应体系中，还可以添加其它有机或无机添加剂，如添加表 面活性剂吐温80可以用于乳化底物使得底物和酶更均匀分散，添加无机 盐/盐水合物如十水合硫酸钠/硫酸钠等可以用于调节反应体系的水活度， 以提高脂肪酶的选择性和活性。以CAL-B、 CRL为例，本发明的水解拆分可以用下式所表示的历程
实现:<formula>formula see original document page 8</formula>
(R)-N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸
反应过程用HPLC (Shimadzu SPD-10AVP)来检测，色谱柱Shim-Pack VP-ODS (150x4.6mm)，分析条件甲醇/水(体积比)=40/60,流速 1 ml/min。
对映体过量值用HPLC( Shimadzu SPD-10AVP)来检测，手性色语柱 Chimlcel AS-H (250 x 4.6 mm， Daicel Co.， Japan )，分析条件正己烷/异丙 醇/乙酸(体积比)=55/45/0.1，流速0.4 ml/min.
反应产物光学纯度通过对映过量值(ee%)来评价，反应的对映体选 择性以E来评价。相应的计算公式如下，其中eep是指产物的ee值，ees 是指底物的对映体过量百分率，c为反应转化率。[(S)-acid]、 [(R)-acid]、 [Intial vinyl ester]分别指代反应结束时S构型水解酸产物的浓度、R构型水 解酸产物的浓度、底物的初始浓度。
c(%)=,-acd]xl00
—%) = [(i )-aCid]-,-aCid]x100 [(及)陽acid] + [(S)-aci司
<formula>formula see original document page 8</formula>
ln[l-—卿)] 本发明具有如下有益效果
本发明筛选获得了高立体选择性的脂肪酶CAL-B、 Lipozyme ,用以 选择性水解(8)-^[-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯得到光学纯(S)- N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸，产物对映体过量值最高达到99 %，收率为40%~53%，通过 最终转化得到(S)-吗啉酮凝血酶抑制剂；而采用脂肪酶CRL 、 CCL则择性 水解(11)-]^取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯得到光学纯(R)- N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸，产物对映体过量值最高达到98.3%，收率为41%~47%，通过最终 转化得到(R)-吗啉酮凝血酶抑制剂。本发明方法通过改变反应条件，可以 调控水解产物的选择性，实现两种构型产物的可控制备；
本发明采用的酶促方法与其它化学法合成相比产物光学纯度高、副反 应少、底物与产物易分离、反应条件温和，对环境友好。
本发明方法为进一步合成(R)-吗啉酮凝血酶抑制剂和(S)-吗啉酮凝血 酶抑制剂提供一种有效的路线。
具体实施例方式
取500mg 4-(3，，4，-二曱氧基节基)吗啉-3-酮-2-乙酸乙烯酯置于100ml 反应瓶，用25ml甲基叔丁基醚溶解。再加蒸馏水500pl， 500mgCAL-B, 摇床温度控制在25。C,摇床转速是200 r/min,搅拌反应30 h。反应结束 后，将反应液过滤回收酶以重复利用。滤液中的产物(S)-4-(3，,4，-二曱氧基 苄基)吗啉-3-酮-2-乙酸和未反应的(R)-4-(3，，4，-二甲氧基苄基)吗啉-3-酮-2-乙酸乙烯酯用HPLC检测。产物转化率为48.9%, ee值为98.10/()。
滤液用饱和NaHC03水溶液每次25ml反向萃取3次，水相用稀HC1 调节pH到7，再用乙酸乙酯对水相进行萃取，旋干乙酸乙酯最后得到光 学纯的(S)- 4-(3，，4，-二曱氧基爷基)吗啉-3-酮-2-乙酸。其结构式如下<formula>formula see original document page 9</formula>
取500 mg 4-(3，，4，-二曱氧基节基)吗啉-3-酮-2-乙酸乙烯酯置于100 ml 反应瓶，用25ml环己烷溶解。再加蒸馏水500jnl， 500mgCRL，摇床温 度控制在25。C,摇床转速为200 r/min,搅拌反应36 h。反应结束后，将
实施例1
实施例2反应液过滤回收酶以重复利用。滤液中的产物(R)-4-(3，，4，-二曱氧基千基) 吗啉_3-酮-2-乙酸和未反应的(S)-4-(3，，4，-二曱氧基节基)吗啉-3-酮-2-乙酸 乙烯酯，用HPLC4企测。产物转化率为47.5%， ee值为97.3 %。
滤液用饱和NaHC03水溶液每次25 ml反向萃取3次，水相用稀HC1 调节pH到7，再用乙酸乙酯对7jC相进行萃取，旋干乙酸乙酯最后得到光 学纯的(R)-4-(3，，4，-二曱氧基千基)吗啉-3-酮-2-乙酸。其结构式如下
实施例3
除了酶促水解底物选用4-(4，-氯节基)吗啉-3-酮-2-乙酸乙酉旨，其余操作 同实施例1，制得下式所示的光学纯(S)-4-(4，-氯千基)吗啉-3-酮-2-乙酸， 转化率为48.2 %, ee值为97.5 %。
<formula>formula see original document page 10</formula>
实施例4
除了酶促水解底物选用4-(4，-氯节基)吗啉-3-酮-2-乙酸乙酯，其余操作 同实施例2,制得下式所示的光学纯(R)-4-(4，-氯节基)吗啉-3-酮-2-乙酸， 转化率为45.8%， ee值为98.3 %。
<formula>formula see original document page 10</formula>
实施例5
取2.5g 4-(2，,5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)吗啉-3-酮-2-乙酸丁酯置于 100ml反应瓶，用25ml丙酮溶解。再加蒸馏水6.2ml (体积含量20%)， 1250mg固定化米赫毛霉脂肪酶Lipozyme⑧，摇床温度控制在60。C，摇床转速是200r/min，搅拌反应24 h。反应结束后，将反应液过滤回收酶以重 复利用。滤液中的产物(S)-4-(2，，5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)吗啉-3-酮-2-乙酸 和未反应的(R)-4-(2，,5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)吗啉-3-酮-2-乙酸丁酯用 HPLC检测。产物转化率为52.8%, ee值为95.40/。。
滤液旋干后用饱和NaHC03水溶液每次25ml洗涤3次，水相用稀HC1 调节pH到7，再用乙酸乙酯对水相进行萃取，旋干乙酸乙酯最后得到(S)-4-(2，，5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)吗啉-3-酮-2-乙酸。其结构式如下
除了催化剂选用圓柱状假丝酵母脂肪酶(CCL )，溶剂选用25ml环己 烷和150ul水(体积含量0.5% )，反应时间50h外，其余操作同实施例5， 制得下式所示的光学纯(R)-4-(2，，5，-二甲氧基-苯磺酰胺基)吗啉-3-酮-2-乙 酸，转化率为41.4%, ee值为97.3 %。
取160mg 4-(2，，5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)吗啉-3-酮-2-乙酸丁酯置于 100ml反应瓶，用25ml丙酮溶解。再加蒸馏水6.2ml (体积含量20%), 160mg固定化米赫毛霉脂肪酶Lipozyme ,摇床温度控制在60°C,摇床 转速是200 r/min，搅拌反应lh，其余操作同实施例5,其中水解产物 (S)-4-(2，，5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)吗啉-3-酮-2-乙酸的转化率为40.4%, ee 值为99.0%，其结构式如实施例5所示。
实施例6
实施例7
ii实施例8
除了反应温度为5。C，反应时间为24小时外，其余操作同实施例7， 其中水解产物(S)-4-(2，，5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)吗啉-3-酮-2-乙酸的转化 率为48.3%， ee值为96.0。/c)，其结构式如实施例5所示。
1权利要求
1、一种光学纯N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸的制备方法，包括如下步骤以脂肪酶为催化剂，在水/有机溶剂体系中，水解拆分外消旋的式(I)所示的N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯底物，经后处理制得式(II)所示的(R)-N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸或(S)-N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸；其中，所述的R为二苯甲基、(3’，4’-二甲氧基)苄基、(4’-甲氧基)苄基、(4’-氯)苄基、(4’-二甲胺基)苄基、苯乙基、苄基、苯基、(2’，5’-二甲氧基)-苯磺酰胺基、辛基、异丙基、乙基或甲基；所述的R1为C1～C18的烷基或C1～C18的烯基。
2、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶或固定化米赫毛霉脂肪酶，制得(8)"^-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸。
3、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的脂肪酶为褶铍假丝酵母脂肪酶或圆柱状假丝酵母脂肪酶，制得(R)-N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸。
4、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯底物在水/有机溶剂体系中的浓度为5 ~ 100g/L。
5、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的脂肪酶在水/有机溶剂体系中的浓度为5 ~ 50g/L。
6、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的水解拆分的反应温度为5 60。C，反应时间为1 50小时。
7、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的后处理为在水解拆分结束后，离心去除脂肪酶，滤液用饱和NaHC(V乙酸乙酯萃取，旋干后得到光学纯(11)"^-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸或(8)->^取代-吗啉-3-酮-2-乙酸。
8、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的7K/有机溶剂体系中有机溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基曱酰胺、二氧六环、乙腈、丙酮、叔戊醇、曱基叔丁基醚、二异丙基醚、乙醚、丁醚、苯曱醚、苯醚、正己烷、异辛烷、环己烷、甲苯或二氯曱烷。
9、 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述的7jc/有机溶剂体系中水的体积百分含量为0.5% ~ 20%。
全文摘要
本发明公开了一种光学纯N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸的制备方法，包括如下步骤以脂肪酶为催化剂，在水/有机溶剂体系中，水解拆分外消旋的式(I)所示的N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸酯底物，经后处理制得式(II)所示的(R)-N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸或(S)-N-取代-吗啉-3-酮-2-乙酸；本发明采用的酶促方法通过改变反应条件，可以调控水解产物的选择性，实现两种构型产物的可控制备；本发明方法与其它化学法合成相比产物光学纯度高、副反应少、底物产物易分离、反应条件温和，对环境友好。
文档编号C12P17/14GK101643757SQ20091010239
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月7日 优先权日2009年9月7日
发明者叶海朋, 起 吴, 林贤福 申请人:浙江大学